五種磺酰脲類除草劑分離檢測方法的建立及其在土壤樣品中的應(yīng)用

湯凱潔，周志娥，余瑞龍，陳尚衛(wèi)

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 南昌市農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045;2.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

隨著我國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展和近年來農(nóng)村勞動(dòng)力向城市轉(zhuǎn)移，農(nóng)業(yè)栽培耕作方式趨向于規(guī)?；图s化發(fā)展，我國農(nóng)村對除草劑的需求量日漸增大，除草劑對土壤和水體的污染及其在農(nóng)作物中的殘留日益嚴(yán)重?；酋ｋ孱惓輨瘫究齐s草、闊葉雜草、莎草、看麥娘、稗草等都有較好的防除效果，可用于水稻、玉米、大豆、油菜、麥類等多種作物田防除雜草［1－2］。隨著該類除草劑使用量及使用范圍的不斷加大，其在農(nóng)作物中的殘留、對環(huán)境的污染及對人類健康潛在的危害也越來越為各國政府和專家所重視［3－6］。我國目前廣泛應(yīng)用的磺酰脲類除草劑品種有芐嘧磺隆、吡嘧磺隆、煙嘧磺隆、苯磺隆、胺苯磺隆、氯磺隆、甲磺隆、醚磺隆等。美國、歐盟、日本等專門針對多種磺酰脲類除草劑制定了在食品、飼料中的最高殘留限量，韓國和中國臺灣省分別制定了吡嘧磺隆和芐嘧磺隆的在大米中的最大殘留限量，吡嘧磺隆最大殘留限量分別為0.05 mg/kg(韓國)0.5 mg/kg(中國臺灣)，芐嘧磺隆的最大殘留限量分別為0.02 mg/kg(韓國)0.5 mg/kg(中國臺灣)［7－8］，成為我國大陸農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易面臨的又一個(gè)技術(shù)壁壘。由于芐嘧磺隆、吡嘧磺隆?；煊糜谒咎锓莱瘫究齐s草，煙嘧磺隆常用在玉米田防除禾本科雜草，苯磺隆常用于小麥和大麥田防除闊葉雜草，而甲磺隆是近年來禁用農(nóng)藥，但其對闊葉雜草防除的高效性，不法生產(chǎn)和銷售商仍在非法銷售。由于水田和旱地的相互輪作，因此這五種磺酰脲類除草劑可能會(huì)在土壤和農(nóng)作物中同時(shí)殘留，因?yàn)檫@幾種物質(zhì)的極性比較接近，要良好分離有一定的難度，雖然其他磺酰脲類除草劑檢測也有文獻(xiàn)報(bào)道［9－12］，但同時(shí)分離檢測吡嘧磺隆、芐嘧磺隆、苯磺隆、甲磺隆、煙嘧磺隆方法未見報(bào)道，由于輪作和農(nóng)藥混用的原因，而這五種磺酰脲類物質(zhì)在水體和土壤中的殘留現(xiàn)狀值得關(guān)注。因此本文研究了這五種常用磺酰脲類除草劑的高效液相分離檢測條件和檢測土壤樣品殘留的預(yù)處理方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

吡嘧磺隆(pyrazosulfuron，PS)、芐嘧磺隆(bensulfuron－methyl，BSM)、苯磺隆(tribenuron－methyl，TBM)、甲磺隆(metsulfuron－methy，MSM)、煙嘧磺隆(nicosulfuron，NS)(標(biāo)準(zhǔn)品98%，上海農(nóng)藥研究所);甲醇(MeOH)、乙腈(MeCN)(色譜純，江蘇漢幫化學(xué)試劑公司)，磷酸(phosphoric acid)(分析純，上海國藥集團(tuán))，硅藻土(上海國藥集團(tuán))，硅酸鎂(天津傲然精細(xì)化工研究所，60～100目)。實(shí)驗(yàn)用水為Mill-Pore超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters 1525高效液相色譜儀:配置雙波長紫外檢測器(Waters 2487，USA)，二元泵(Waters 1525，USA)、采用Waters 1525化學(xué)工作站;

METTLER DELTA 320 pH計(jì):梅特勒－托利多上海有限公司;真空固相萃取裝置:北京京科瑞達(dá)科技有限公司;Milli－Q integral 15超純水處理器:法國密理博公司;KD200型氮?dú)獯祾邇x:杭州奧盛儀器有限公司;KQ3200型超聲波清洗機(jī):昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HPLC 分離條件的優(yōu)化 色譜柱為 C18柱(250mm×4.6mm，i.d.，5 μm，，Waters Co，USA)，柱溫為30℃，流速為0.8mL/min，進(jìn)樣量為10μL，檢測波長241 nm。流動(dòng)相 A為 V(乙腈)∶V(水)=20∶80，0.01%磷酸調(diào)pH)，流動(dòng)相B為V(乙腈)∶V(水)=80∶20，0.01%磷酸調(diào)pH)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了3種不同的洗脫梯度程序，考察不同梯度對五種磺酰脲類分離效果的影響，以分離度為考察指標(biāo)，從而選擇最佳洗脫梯度。梯度設(shè)計(jì)見表1～3.

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序1Tab.1 Liquid chromatography separation conditions mobile phase gradient elution procedure 1

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序2Tab.2 Liquid chromatography separation conditions mobile phase gradient elution procedure 2

表3 流動(dòng)相梯度洗脫程序3Tab.3 Liquid chromatography separation conditions mobile phase gradient elution procedure 3

1.3.2 試劑的配制 分別準(zhǔn)確稱取吡嘧磺隆0.0228 g，芐嘧磺隆0.0165 g，煙嘧磺隆0.0102 g，甲磺隆0.0182 g，苯磺隆0.0107 g置于100mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成溶度為228，165，102，182，107 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。使用前再用甲醇將儲備液稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。將以上儲備液用封口膜密封后置于冰箱中存放備用，可保存一個(gè)月。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別取配制好的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇逐級稀釋，配制成適合的濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，供HPLC分析。以配制的濃度為橫坐標(biāo)，其對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求出線性回歸方程。

1.3.4 SPE柱的選擇 配制10 μg/mL的PS、NS、MSM、BSM和TBM 5種標(biāo)樣，用不同的SPE柱富集和凈化，硅酸鎂柱和硅膠柱(漢邦公司)的洗脫程序參考肯定列表標(biāo)準(zhǔn)［7］，SPE C－18柱(漢邦公司)和SPE－ENVITM－18柱(Sigma公司)柱的洗脫程序?yàn)橄扔靡译?×2.5mL活化，然后用乙腈提取溶液上樣，再加2.5mL乙腈洗脫，收集洗脫液，氮吹干，加1mL甲醇超聲溶解留待HPLC定量分析，比較不同柱的回收率。

1.3.5 土壤樣品的制備 土壤樣品取自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)田。稱取經(jīng)粉碎混勻后過50目篩的土壤樣品約5 g，置于50mL離心管中，加入20mL水，放置2 h。加入20mL乙腈，攪拌10min后，超聲輔助提取30min，然后以4000 r/min離心20min，采用0.45 μm有機(jī)相濾頭過濾，殘?jiān)瓷鲜龇椒ㄖ貜?fù)操作，合并濾液于離心管中，氮吹干，加標(biāo)溶解留待過ENVITM－18柱。

1.3.6 樣品的凈化 ENVITM－18小柱(3mL，500 mg)中分別注入乙腈2.5mL和水2.5mL活化，棄去流出液。然后往柱中注入1.3.5提取方法所得的溶液后，用2×2.5mL水淋洗，棄去流出液，繼續(xù)加入2×2.5mL乙腈洗脫，收集乙腈洗脫液并過孔徑0.45 μm濾膜，洗脫液用氮吹干，加甲醇1mL超聲溶解留待HPLC進(jìn)樣分析，計(jì)算樣品加標(biāo)的回收率和精密度實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相和洗脫梯度的優(yōu)化

在HPLC多殘留分析中流動(dòng)相的選擇和優(yōu)化很關(guān)鍵，好的洗脫程序不僅應(yīng)使各種除草劑組分基線分離，而且還應(yīng)考慮除草劑組分與干擾物質(zhì)分離，為將各種磺酰脲類除草劑與干擾物質(zhì)分離，必須要達(dá)到合適的分離度(Rs＞1.5)，分離度受容量因子(k)，選擇因子(a)和柱效(N)的影響［13］。筆者在實(shí)驗(yàn)中比較了甲醇－水(冰醋酸調(diào)pH)，甲醇－水(未調(diào)pH)，乙腈－水(未調(diào)pH)，乙腈－水(磷酸調(diào)pH)等4種流動(dòng)相。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在同一梯度下，流動(dòng)相中酸度對磺酰脲類除草劑的保留值起十分重要的作用，流動(dòng)相中不含磷酸時(shí)，磺酰脲類除草劑的保留時(shí)間相對較長，當(dāng)流動(dòng)相中添加0.01%的磷酸時(shí)，5種磺酰脲類除草劑的分離較大地改善，且基線平穩(wěn)。其主要原因是，當(dāng)用磷酸調(diào)節(jié)pH，能抑制磺酰脲類除草劑－NH上的氫電離，使PS、BSM、MSM、NS和TBM保持分子形態(tài)，使它們與C18柱之間的相互作用減弱［14］。用改變流動(dòng)相的配比來改變k值以增加分離度是最方便的方法，等梯度洗脫不能將以上五種磺酰脲類除草劑完全分離，因此實(shí)驗(yàn)中比較了3種不同的梯度洗脫模式，調(diào)整溶劑的強(qiáng)度使所有譜帶符合1＜k＜20的范圍［15］，能獲得較好的分離度。

圖1 洗脫程序(1)色譜圖Fig.1 Chromatography with elution procedure(1)

圖2 洗脫程序(2)色譜圖Fig.2 Chromatography with elution procedure(2)

比較3種梯度洗脫的液相色譜圖可見，采用梯度程序1分離得到的液相圖譜圖1，有3種除草劑完全分離開來，但有兩種峰沒有達(dá)到基線分離;而采用梯度2洗脫程序得到的液相色譜圖2，發(fā)現(xiàn)只有4個(gè)峰，其中有一個(gè)峰在20min后仍沒有出現(xiàn);從梯度程序3洗脫的色譜圖可以看出，5種磺酰脲類除草劑在18min內(nèi)得到良好的分離，峰型和出峰時(shí)間都比較理想，因此后面的實(shí)驗(yàn)都采用梯度3洗脫程序進(jìn)行分離和定量。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在上述確定的梯度程序3的分離條件下，配制5個(gè)不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行 HPLC 色譜測定(10.0，6.0，3.5，0.3，0.1 μg/mL)，以各組分的 3 次平均峰面積(Y)對濃度(X，μg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，5種除草劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)見表4。從表4可以看出，五種磺酰脲類除草劑在0.1～10 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)(R2)均在0.998以上。可以滿足定量分析的要求。5種磺酰脲類除草劑的HPLC線性方程見表4。

采用本方法對同一標(biāo)準(zhǔn)品平行測定6次，測得各物質(zhì)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1%，表明本方法精密度很好。配制3個(gè)相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，每個(gè)濃度重復(fù)進(jìn)樣3次，檢驗(yàn)方法的重現(xiàn)性，測得RSD＜5.0%，符合高效液相標(biāo)準(zhǔn)偏差要求，本方法能用于實(shí)際樣品的檢測。

圖3 洗脫程序(3)色譜圖Fig.3 Chromatography with elution procedure(3)

表4 五種除草劑在高效液相色譜儀上測定的線性關(guān)系與相關(guān)系數(shù)Tab.4 The linearity of sulfonylurea herbicides with HPLC

2.3 土壤樣品前處理方法的選擇

本實(shí)驗(yàn)比較了文獻(xiàn)報(bào)道中的幾種SPE柱對PS，NS，MSM，BSM和TBM標(biāo)樣回收率的影響，比較了SPE－C18 和 SCX［16］、硅膠柱［17］、硅酸鎂柱［7］、ENVITM－18 柱［18－19］和 Florisil層析柱［20］。在沒有干擾成份的影響下，對5種標(biāo)樣回收率最高的是ENVITM－18柱，其中對PS，NS，MSM，BSM和TBM的回收率分別為:88.9%，76.4%，89.6%，83.6%和 86.5%。本實(shí)驗(yàn)中采用的 ENVITM－18 柱較 Fang 等［21］采用的MWCNTs柱使用更簡單。因此后面土壤樣品的富集和凈化就采用ENVITM－18柱。

2.4 加標(biāo)回收率、精密度和檢出限

在土壤空白樣品中添加5種磺酰脲類除草劑的3個(gè)濃度混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述步驟進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，并且，每個(gè)添加濃度平行操作6份，測定精密度，結(jié)果見表5，由表5可以看出，5種磺酰脲類除草劑加標(biāo)3.5 mg/kg濃度回收率最高，加標(biāo)回收率介于89.1% ～98.6%，而加標(biāo)0.1 mg/kg的回收率介于74.5% ～80.9%，其多次測定的RSD介于1.9% ～5.7%，方法的準(zhǔn)確度和精密度均符合殘留分析的要求。

表5 土壤中五種磺酰脲類除草劑的加標(biāo)回收率(n=6)Tab.5 Recoveries of five sulfonylurea herbicides in spiked rice

根據(jù)信噪比(S/N=3)計(jì)算得出五種磺酰脲類除草劑的檢出限分別是:PS為0.05 μg/mL，NS為 0.09 μg/mL，MSM 為 0.03 μg/mL，TBM 為 0.07 μgmL，BSM 為 0.02 μg/mL。以每次進(jìn)樣體積為10μL 計(jì)算，定量限(S/N=10)如下:PS 為 3.43 μg/mL，NS 為 4.45 μg/mL，MSM 為 3.32 μg/mL，TBM為4.41 μg/mL，BSM 為 4.37 μg/mL。在實(shí)際土壤樣品中 PS、NS、MSM、TBM 和 BSM 的定量限分別為 2.60，3.92，3.67，3.30，2.95 μg/mL。

3 結(jié)論

通過洗脫梯度的優(yōu)化，5種磺酰脲類除草劑得到了良好的分離，建立了5種磺酰脲類除草劑的高效液相色譜檢測方法，對標(biāo)樣的檢測限在0.02～0.09 μg/mL，能滿足國內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對該類除草劑殘留限量的檢測要求。

［1］楊德義.磺酰脲類除草劑分析方法研究進(jìn)展［J］.化學(xué)工程師，2006，132(9):48－49.

［2］劉長令.世界農(nóng)藥大全:除草劑卷［M］.北京:北京化工出版社，2002:15－75.

［3］Dasgupta S，Meisner C，Wheeler D，et al.Pesticide poisoning of farm workers－implications of blood test results from vietnam international［J］.Journal of Hygiene and Environmental Health，2007，210:121－132.

［4］Ding F，Liu W，Zhang X，et al.Identification of pyrazosulfuron－ethyl binding affinity and binding site subdomain IIA in human serum albumin by spectroscopic methods［J］.Spectrochimica Acta Part A，2010，75:1088－1094.

［5］Dasgupta S，Meisner C，Wheeler D，et al.Pesticide poisoning of farm workers－implications of blood test results from vietnam international［J］.International Journal of Hygiene and Environmental Health，2007，210:121－132.

［6］Rao A N，Johnson D E，Sivaprasad B，et al.Weed management in direct－seeded rice［J］.Advances in Agronomy，2007，93:153－255.

［7］中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)院.日本厚生勞動(dòng)省食品中農(nóng)用化學(xué)品殘留檢測方法［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2006.

［8］Luc1＇a P，F(xiàn)erna＇ndez－Alba A R，Vero＇nica C，et al.Analytical methods for pesticide residues in rice［J］.Trends in Analytical Chemistry，2011，30(2):270－291.

［9］李輝，李娜，張玉婷，等.糧食中磺酰脲類除草劑的UPLC/MS/MS測定方法［J］.分析試驗(yàn)室，2012，31(6):63－69.

［10］吳巖，楊長志，劉永，等.氣相色譜－質(zhì)譜法測定大豆中的豆磺隆的殘留量［J］.分析試驗(yàn)室，2008，27(3):80－83.

［11］Polati S，Bottaro M，F(xiàn)rascarolo P，et al.HPLC－UV and HPLC－MS multiresidue determination of amidosulfuron，azimsulfuron，nicosulfuron，rimsulfuron，thifensulfuron methyl，tribenuron methyl and azoxystrobin in surface waters［J］.Analytica Chimica Acta，2006，579(1):146－151.

［12］Wu Q H，Wang C，Liu Z M，et al.Dispersive solid－phase extraction followed by dispersive liquid－liquid microextraction for the determination of some sulfonylurea herbicides in soil by high－performance liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography A，2009，1216:5504－5510.

［13］施奈德L R，格萊吉克J L.實(shí)用高效液相方法的建立［M］.王杰，趙嵐峰，王樹力，等譯.2版.北京:科學(xué)出版社，2000.

［14］Bottaro M，F(xiàn)rascarolo P，Gosetti F，et al.HPLC－UV and HPLC－MS multiresidue determination of amidosulfuron，azimsulfuron，nicosulfuron，rimsulfuron，thifensulfuron ethyl，tribenuron methyl and azoxystrobin in surface waters［J］.Analytica chimica acta，2006，579(2):146－151.

［15］傅若農(nóng).色譜分析概論［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，1999:198.

［16］Ramezani M，Simpson N，Oliver D，et al.Improved extraction and clean－up of imidazolinone herbicides from soil solutions using different solid－phase sorbents［J］.Journal of Chromatography A，2009，1216:5092－5100.

［17］Fang G Z，Chen J，Wang J P，et al.N－Methylimidazolium ionic liquid－functionalized silica as a sorbent for selective solidphase extraction of 12 sulfonylurea herbicides in environmental water and soil samples［J］.Journal of Chromatography A，2010，1217:1567－1574.

［18］岳霞麗，張新萍，董元彥，等.固相萃取－高效液相色譜法測定水體中芐嘧磺隆的殘留量［J］.光譜實(shí)驗(yàn)室，2006，23(2):321－323.

［19］隋凱，李軍，衛(wèi)鋒，等.固相萃?。咝б合嗌V法同時(shí)檢測大米中12種磺酰脲類除草劑的殘留［J］.色譜，2006，24(2):152－156.

［20］祁彥，李淑娟，占春瑞，等.高效液相色譜2質(zhì)譜法測定大豆中磺酰脲類除草劑多殘留量的研究［J］.分析化學(xué)，2004，32(11):1421－1425.

［21］Fang G Z，Wang X N，Wang S.Multiwalled carbon nanotubes as SPE adsorbents for simultaneous determination of seven sulfonylurea herbicides in environmental water by LC－MS－MS［J］.Chromatographia，2010，72:403－409.