虛擬篩選預(yù)測(cè)固本止咳膏的作用靶標(biāo)

陳海燕， 李秉佳， 史勝楠

（廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 廣西 南寧 530004）

虛擬篩選預(yù)測(cè)固本止咳膏的作用靶標(biāo)

陳海燕， 李秉佳， 史勝楠

（廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院， 廣西 南寧 530004）

目的 應(yīng)用虛擬篩選方法預(yù)測(cè)固本止咳膏的活性成分及其作用靶標(biāo)，以期闡明固本止咳膏活性成分的協(xié)同機(jī)制。 方法 通過(guò)文獻(xiàn)收集固本止咳膏復(fù)方原材料有關(guān)的 117 個(gè)化合物。 選取三個(gè)炎癥中關(guān)鍵酶 6COX、 1A4G、 1LRY作受體， 應(yīng)用 iGEMDOCK軟件對(duì) 117 個(gè)化合物分子進(jìn)行分子對(duì)接， 發(fā)現(xiàn)了 19 個(gè)活性分子。 再用 SePreSA進(jìn)行反向分子對(duì)接預(yù)測(cè)這些活性成分的作用靶標(biāo)。結(jié)果 預(yù)測(cè)了固本止咳膏中活性成分及其分子靶標(biāo)。結(jié)論 初步闡釋固本止咳膏在抗炎、抗菌和抗病毒方面的作用機(jī)制，為下一步研究壯藥固本止咳膏的作用靶標(biāo)選取提供理論指導(dǎo)，為復(fù)方壯藥開(kāi)發(fā)提供一種新的研究策略。

壯藥；固本止咳膏；活性成分；虛擬篩選；分子對(duì)接；作用靶標(biāo)

固本止咳膏源于壯族秘方，以白蟻菌圃與黃芪、五味子、淫羊藿、矮地茶、苦杏仁配伍而成［1］，具有止咳祛痰的作用［2］。 既往對(duì)其原材提取物的成分和藥效已有研究［3-4］， 其中 主藥白蟻菌圃具有抗炎、 增強(qiáng)免疫力 等作用［5-6］， 但對(duì) 其活性成分分子作用機(jī)制尚不明確。這也是壯族醫(yī)藥現(xiàn)代化開(kāi)發(fā)和推廣的常見(jiàn)問(wèn)題，而對(duì)活性成分的研究有助于提高質(zhì)量控制和增強(qiáng)藥物安全，更可使之與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)接軌，推動(dòng)其得到廣泛應(yīng)用。

囿于固本止咳膏原藥材成分復(fù)雜，若運(yùn)用傳統(tǒng)的藥理研究方法破譯難度高、周期長(zhǎng)、投資大，而使用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì) CADD技術(shù)可避免此問(wèn)題。隨著將虛擬篩選和高通量篩選結(jié)合，新配體識(shí)別的技術(shù)得到發(fā)展［7］。 同時(shí)， 虛擬篩選能較好地從化合物中篩選出活性成分［8］。 本實(shí)驗(yàn)利用挖掘文獻(xiàn)的方法和虛擬篩選工具結(jié)合，篩選固本止咳膏原藥材中具有抗炎活性的分子并預(yù)測(cè)其作用靶標(biāo)，以期闡明固本止咳膏活性成分的分子協(xié)同機(jī)制，為民族醫(yī)藥的現(xiàn)代化開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 材料

1.1.1 配體庫(kù)的構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)以固本止咳膏原藥材中化學(xué)成分為研究對(duì)象， 通過(guò)文獻(xiàn) ［9-11］ 挖掘共計(jì) 117 個(gè)化合物。 化合物分子采用 Chem Office、Open Babel（http： //openbabel.org） 等構(gòu)建成三維結(jié)構(gòu)， 并對(duì) 其加氫、 加電荷，保 存 為 mol2 格式，作為虛擬篩選的配體庫(kù)。

1.1.2 受體選擇 咳嗽痰飲的臨床表現(xiàn)有咳痰、哮喘、咳嗽。主要病因是細(xì)菌、病毒感染，真菌、衣原體、支原體致使上呼吸道炎癥，發(fā)展到喉、氣管、肺部等病變。故而從蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（http： //www.rcsb.org） 中選擇在炎癥的表達(dá)和調(diào)節(jié) 中 關(guān) 鍵 酶 COX-2 為 受 體 蛋 白 （ PDB code：6COX［12］）。 同時(shí)， 選取兩個(gè)病毒和細(xì)菌合成的關(guān)鍵酶神經(jīng)氨酸苷酶 （ PDB code：1A4G［13］）、 肽脫甲?；?（ PDB code： 1LRY［14］） 作為受體蛋白。

1.2 方法

1.2.1 分子對(duì)接和評(píng)價(jià)方法 分子對(duì)接是將化合物分子放入受體蛋白配體結(jié)合位點(diǎn)，通過(guò)研究受體結(jié)構(gòu)特征及其與化合物分子之間作用力，依據(jù)讓兩者在幾何、能量上匹配的原則而相互識(shí)別，篩選出結(jié)合能量最低的分子［15］。

采用 iGEMDOCK［16］（ GA parameters： Population size=200， Generation=70， Number of solution= 2， Binding site radius=8?） 對(duì)化合物分子和受體蛋白的結(jié)合腔穴進(jìn)行對(duì)接。蛋白質(zhì)上基團(tuán)通過(guò)范德華力、氫鍵和靜電作用與化合物分子結(jié)合，匹配出能力最低的結(jié)合位點(diǎn)。能量函數(shù)根據(jù)對(duì)分子對(duì)接結(jié)果的范德華力、氫鍵和靜電作用統(tǒng)計(jì)，并將能量轉(zhuǎn)換成單位 kcal/mol。

1.2.2 作用靶標(biāo)預(yù)測(cè) 活性分子之間， 具有共同特征的如化學(xué)基團(tuán)、 氫鍵給/受體、 正/負(fù)電基團(tuán)和疏水性基團(tuán)等，以化合物分子的結(jié)構(gòu)信息和生物活性為基點(diǎn)，找到共同的藥效作用本質(zhì)。作用靶標(biāo)預(yù)測(cè)是在不知靶點(diǎn)情況下，讓活性分子和有可能的多個(gè)靶標(biāo)的三維結(jié)構(gòu)對(duì)接， 尋找潛在靶標(biāo)［17］。

通過(guò) SePreSA （ http： //sepresa.bio-x.cn/） 服務(wù)器，將化合物分子的三維結(jié)構(gòu)上傳，服務(wù)器將化合物分子和蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)合。篩選出對(duì)化合物分子有敏感作用的氨基酸殘基，以期闡明化合物分子在產(chǎn)生藥效過(guò)程中的副作用及解釋其中藥物動(dòng)力學(xué)，評(píng)估化合物分子的安全性［18］。

2 結(jié)果

2.1 以 1A4G、 1LRY、 6COX為受體， 通過(guò)將化合物分子與之對(duì)接， 篩選出打分排在前19的分子，以 ZMR［19］、 BB2［20］、 SC58［21］為 對(duì)接結(jié)果陽(yáng) 性 對(duì)照， 并對(duì)其進(jìn)行排序 （見(jiàn)表1）， 能量較低者表示化合物分子與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定，發(fā)生的作用可能性大，而且多數(shù)分子的對(duì)接能量比相應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照物的能量要大，即可成為相關(guān)酶的抑制劑。

表1 分子對(duì)接數(shù)據(jù)Tab.1 Docking score

2.2 藥物的潛在靶標(biāo)的識(shí)別對(duì)于藥物的研發(fā)、使用過(guò)程中的分子生理活性和毒性等有重要意義。同時(shí)，據(jù)此能挖掘藥物的適用性，有利于其在老藥新用等領(lǐng)域的發(fā)展。作為一種快速而低成本的技術(shù)，計(jì)算機(jī)輔助識(shí)別分子靶標(biāo)的算法應(yīng)用甚廣，根據(jù)SePreSA服務(wù)器所設(shè)定算法［18］，選出結(jié)果 Z'-scores＜-0.5 且 Z-scores＜-1.2 的靶標(biāo) （ 見(jiàn)表 2）。

3 討論

固本止咳膏6種原藥材化學(xué)成分復(fù)雜，其中黃芪、五味子等在方劑配伍使用較多。采用單一藥材的研究不足以體現(xiàn)中藥復(fù)方的系統(tǒng)性。中藥有“藥有個(gè)性之長(zhǎng)，方有合群之妙” 的說(shuō)法，即配伍藥材之間存在相互協(xié)同效用。依靠對(duì)中藥成分的分離提純后進(jìn)行藥理實(shí)驗(yàn)流程復(fù)雜、周期長(zhǎng)、成本高，只能適用小規(guī)模篩選。利用計(jì)算機(jī)虛擬篩選的方法實(shí)驗(yàn)具有導(dǎo)向性，加快了中藥復(fù)方的機(jī)理研究過(guò)程［22］。 中藥方劑青黛片治療急性早幼粒白血病的分子機(jī)理的分析，首次闡述方劑 “君、 臣、佐、使” 的配伍原則［23］。

表2 作用靶標(biāo)預(yù)測(cè)結(jié)果Tab.2 Result of virtual screening

固本止咳膏作為傳統(tǒng)壯藥，其原藥材的鑒定和分析的深入研究已有報(bào)道，中藥配伍對(duì)化學(xué)成分的影響指出合理的方劑有助于藥效的釋放［24］。 但囿于客觀條件，依據(jù)傳統(tǒng)方法弄清化合物分子的生理活性仍是一項(xiàng)困難的工作。文中數(shù)據(jù)表明，打分排在前的化合物分子在與 COX-2 結(jié)合具有穩(wěn)定構(gòu)象，君藥白蟻菌圃中的 Ursolic acid、 佐藥苦杏仁、 矮地茶中的 Amygdalin、 Quercetin、 Kaempferol等指出方劑止咳祛痰的活性成分，驗(yàn)證了其傳統(tǒng)醫(yī)理中具有治療炎癥的作用。 而臣藥黃芪的 Rutin 和五味子中木脂素類(lèi)化合物與神經(jīng)氨酸苷酶、肽脫甲?；傅膶?duì)接結(jié)果說(shuō)明其在抗菌和抗病毒方面也具有療效，補(bǔ)充解釋方劑效用。

同時(shí)，研究中發(fā)現(xiàn)潛在的作用靶標(biāo)中涉及藥效范圍面廣， 如蛋白質(zhì) Poly［ADP-ribose］ polymerase 1 具有生理毒性等。 由蛋白質(zhì) Mitogen-activated protein kinase 1 （MAPK） 形成的信號(hào)通路， 接受外界刺激可調(diào)節(jié)真核生物基因表達(dá)，化合物分子與之結(jié)合而影響真核生物的生長(zhǎng)發(fā)育、分化凋亡。方劑中的化合物分子通過(guò)分子間作用力與之結(jié)合，作為潛在的抑制劑，或可改變調(diào)節(jié)機(jī)制。我們也注意到化合物分子能與蛋白質(zhì) Histamine N-methyltransferase（HMT） 結(jié)合而影響 HMT對(duì)組胺代謝的作用。 表明使用固本止咳膏的使用可能影響組胺參與睡眠和食欲調(diào)節(jié)的功能，是潛在的藥物安全性能的指標(biāo)。

方劑與其他藥物混合使用時(shí)存在藥物的協(xié)同拮抗作 用。 如 蛋 白 質(zhì) Arylamine N-acetyltransferase 2（NATs） 可與化合物 Deoxyschizandrin、 Schisandlignan A等結(jié)合， 從而影響 NATs催化基于輔酶 A乙?；掳┓枷惆奉?lèi)化合物的過(guò)程，拓展了對(duì)癌病發(fā)病和抗癌藥物的代謝機(jī)制的研究。Anwuweizic acid在抑制蛋白質(zhì) Cholinesterase的同時(shí)， 延緩了可卡因代謝，也增加了可卡因使用的潛在風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)此，固本止咳膏除了在抗炎病癥上能發(fā)揮作用外尚有治療其他病癥的效用等待發(fā)掘。

值得注意的是，實(shí)驗(yàn)中只對(duì)固本止咳膏原材中的117 個(gè)化合物分子進(jìn)行了研究， 同時(shí)也只挑選了炎癥中的3個(gè)關(guān)鍵酶，這顯然是不夠的。藥物在人體代謝過(guò)程的機(jī)制等很多問(wèn)題尚待深入研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)確定了固本止咳膏中抗炎、抗菌和抗病毒的主要活性成分以及其主要的作用靶標(biāo)，這有助于闡釋固本止咳膏的分子作用機(jī)制，明確臨床定位和提高臨床有效性及安全性評(píng)價(jià)與合理用藥，并為中藥復(fù)方和壯族傳統(tǒng)醫(yī)藥提供一個(gè)新的研究策略，使用計(jì)算機(jī)從復(fù)雜體系中虛擬篩選出活性成分的方法簡(jiǎn)單、周期短，從而減低研究費(fèi)用，提高研究效率。

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Predicting target of Guben Zhike Electurary by virtual screening

CHEN Hai-yan， LIBing-jia， SHISheng-nan
（1.School of Chemistry&Chemical Engineering， Guangxi University， Nanning 530004， China）

AIM In order to elaborate the collaborativemechanism of active compounds in Guben Zhike Electurary， amethod of virtual screeningwas proposed to forecast Guben Zhike Electurary’s active compounds and targets.METHODS Firstly， 117 compounds of Guben Zhike Electurary were collected through literature and other materials.Secondly， the 19 active compounds were found in the 117 compounds， which were docked with 3 key enzymes（pdb code： 6COX， 1A4G and 1LRY， which was the targetof the anti-inflammatory， antibacterial and antiviral， respectively） by iGEMDOCK.Finally， the 19 active compounds'targetswere predicted by the reverse docking software SePreSA.RESULTS Active compounds and targetof Guben Zhike Electurary were confirmed.The mechanism of action in anti-inflammatory， antibacterial and antivirus were explained.CONCLUSION All above will lay the foundation of further study of Guben Zhike Electurary， and provide new strategies ofmodern development of compound of Zhuangmedicine at the same time.

Zhuangmedicine；Guben Zhike Electurary； active compounds；virtual screening； dock； target

R284.1； R289.9

： A

： 1001-1528（2014）03-0559-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.024

2013-05-09

梧州市科技局-廣西大學(xué)校市對(duì)接項(xiàng)目 （2011）

陳海燕 （1976—） ， 男， 博士， 副教授， 從事天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)、 中藥現(xiàn)代化。 E-mail： czyzsu@163.com