HPLC法測定烏蘇里瓦韋藥材中 2種活性成分

王麗紅， 宋琳琳， 吳宏斌， 趙 龍， 劉德江， 穆立薔

（1.東北林業(yè)大學林學院， 黑龍江 哈爾濱 150040； 2.佳木斯大學藥學院， 黑龍江 佳木斯 154007； 3.佳木斯大學生命科學院， 黑龍江 佳木斯 154007）

HPLC法測定烏蘇里瓦韋藥材中 2種活性成分

王麗紅1，2， 宋琳琳2， 吳宏斌2， 趙 龍2， 劉德江3， 穆立薔1*

（1.東北林業(yè)大學林學院， 黑龍江 哈爾濱 150040； 2.佳木斯大學藥學院， 黑龍江 佳木斯 154007； 3.佳木斯大學生命科學院， 黑龍江 佳木斯 154007）

目的 建立 HPLC法測定烏蘇里瓦韋藥材中綠原酸和葉黃素的方法。 方法 測定綠原酸色譜條件為 Agilent E-clipse XDB-IIC18柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm） ， 流動相為乙腈-0.4% 磷酸溶液 （13 ∶87） ， 體積流量為 1.0 mL/min，進樣量為 10 μL， 柱溫為 25 ℃， 檢測波長為 325 nm。 葉黃素色譜條件為 Agilent Eclipse C18柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）， 流動相為 100%甲醇， 柱溫為室溫， 體積流量為 1mL/min， 檢測波長為 474 nm。 結(jié)果 綠原酸線性范圍為 0.4～4.0 μg， 樣品平均加樣回收率為 100.3%， 方法精密度 RSD （n=5） 為 2.03%， 綠原酸含有量為 2.635 mg/g； 葉黃素線性范圍為 1.0 ～100.0 μg， 樣品平均加樣回收率為 99.45%， 方法精密度 RSD （n=5） 為 1.90%， 葉黃素含有量為 110 μg/g。 結(jié)論 上述方法快捷、 簡便、 準確、 專屬性好、 靈敏度高。

烏蘇里瓦韋； 綠原酸； 葉黃素； HPLC

烏蘇里瓦韋，為蕨類水龍骨科瓦韋屬植物烏蘇里瓦韋Lepisorus ussuriensis（ Regel etMaack） Ching的全草， 生于海拔 800 m左右的山地樹干或山坡蔭處巖石上［1］。 《 貴州民間方藥集》記載其藥材名為射雞尾，主治風濕疼痛、跌打傷腫、 清熱、 治驚風。 《中華本草》、 《廣西藥用植物名錄》、 《湖南藥物志》、 《東北常用藥用植物》 等記載該植物具有利尿、鎮(zhèn)痛、止咳、活血的功效。并且這些地區(qū)的居民將其稱為石茶、樹茶，將其代茶飲用，治療各種炎癥疼痛［1-4］， 是一種常用的民間用藥。 但至今未見對該種蕨類植物化學成分及質(zhì)量分析的報道。為了弄清烏蘇里瓦韋的有效物質(zhì)基礎(chǔ)，保證民間用藥的安全及可控，課題組對其化學成分進行了研究，表明該植物中含有多種化學成分，主要活性成分為綠原酸、 葉黃素等。 課題組采用 HPLC法對烏蘇里瓦韋中的綠原酸及葉黃素進行測定，擬為烏蘇里瓦韋的質(zhì)量控制和進一步開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 儀器、 試劑、 材料

安捷倫 1100 型高效液相色譜儀 （四元泵、 自動進樣器、 恒溫箱和 DAD檢測器）、 安捷倫液相色譜工作站； 凌光 UV7547CRT紫外可見分光光度計等。

實驗材料于 2012 年 7 月中旬采自黑龍江省湯原縣鷹山。經(jīng)佳木斯大學藥學院王麗紅教授鑒定為蕨類水龍骨科瓦韋屬植物烏蘇里瓦韋的全草。將材料洗凈，陰干。將干燥藥材粉碎， 過40目篩， 備用。

綠原酸對照品 （純度 98%， 中國藥品生物制品檢定所）； 葉黃素對照品 （純度 90%， sigma公司）。 乙腈、 甲醇為色譜純，磷酸為優(yōu)級純；異丙醇、丙酮為分析純；哇哈哈純凈水。

2 方法和結(jié)果

2.1 綠原酸的測定

2.1.1 綠原酸對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸對照品1.000mg， 置 10 mL量瓶中， 加甲醇定容， 即得 100 μg/mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取烏蘇里瓦韋粉末約 1.00 g，精密加入甲醇 20 mL， 超聲處理 30min， 濃縮， 置 10 mL棕色量瓶中， 定容。 用 0.22 μm微孔濾膜過濾， 即為供試品溶液［5］。

2.1.3 綠原酸檢測波長的選擇 取綠原酸對照品適量， 經(jīng)紫外全波長掃描， 結(jié)果綠原酸在 325 nm波長處有最大吸收。 故以 325 nm為檢測波長。

2.1.4 測定綠原酸的色譜條件 參照藥典法及文獻資料［6-8］， 對 色 譜 條 件 進 行 了 優(yōu) 化。 Eclipse XDB-II C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）； 流動相為乙腈-0.4%磷酸溶液（13 ∶87）； 體 積流量 1.0 m L/m in； 進 樣量 10 μL； 柱 溫25 ℃； 波長 325nm。 按以上條件測定樣品中綠原酸量， 理論塔板數(shù)不少于7 000。 HPLC色譜圖見圖 1。

2.1.5 線性關(guān)系考察 分別吸取綠原酸含有量為 0.4、0.8、 1.0、 3.0、 4.0 μg的對照品溶液， 依次進樣， 測定峰面積。 以色譜峰面積 （mAu） 為橫坐標， 進樣量 （μg） 為縱坐標， 進行回歸分析得： y=0.000 5x+0.171 5， R2= 0.996 4 （n=5）， 說明綠原酸進樣量與峰面積在 0.4 ～4 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.6 精密度試驗 精密移取綠原酸對照品 10 μL， 采用“2.1.4” 項色譜條件， 連續(xù)進樣 5 次， 分別測定峰面積，計算 RSD值為 2.03%。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取 “2.1.2” 中供試品溶液， 分別在0、 2、 4、 8、 12、 24 h 進樣， 測定峰面積， 計算 RSD值為 2.56%。

圖1 對照品 （A） 和供試品 （B） 的 HPLC色譜圖

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知綠原酸含有量的烏蘇里瓦韋藥材粉末 0.500 0 g， 共 6 份， 分別加入一定量的綠原酸對照品， 采用 “2.1.2” 項下操作， 按照 “2.1.4”項色譜條件進樣，分別測定峰面積，計算回收率，結(jié)果見表1。

表 1 綠原酸加樣回收試驗結(jié)果 （n=6）

2.1.9 重復(fù)性試驗 分別稱取 5 份烏蘇里瓦韋藥材各1.000 g， 按 “2.1.2” 項方法制備供試品溶液， 分別進樣測定綠原酸， 計算 RSD值為 0.76%。

2.1.10 樣品測定 精密稱取烏蘇里瓦韋藥材各 1.000 g，5 份， 按 “2.1.2” 項方法制備供試品溶液， 采用 “2.1.4”項色譜條件測定峰面積，根據(jù)綠原酸標準曲線 y= 0.000 5x+0.171 5計算， 烏蘇里瓦韋中綠原酸平均含有量為 2.635 mg/g。

2.2 葉黃素的測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取葉黃素對照品10.000 mg， 用丙酮溶解并定容于 10 mL量瓶中， 搖勻， 得到對照品貯備液 （1 mg/mL）。 將貯備液分別稀釋為 1、 10、 25、50、 100 μg/mL。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取2.00 g烏蘇里瓦韋粉末， 放入錐形瓶中， 加入 80 mL的丙酮溶液。 70℃恒溫提取 30min。 將提取液濃縮后， 定容至 10 mL。 經(jīng) 0.22 μm濾膜過濾后，即為供試品溶液。

2.2.3 葉黃素檢測波長的選擇 將葉黃素對照品溶液在200 ～800 nm波長范圍內(nèi)進行掃描， 發(fā)現(xiàn)其在 446 nm波長處有最大吸收峰， 故確定檢測波長為 446 nm。

2.2.4 測定 葉 黃 素的 色 譜 條 件［9-10］使 用 Agilent Eclipse XDB-IIC18（250 mm×4.6 mm， 5 μm） 色譜柱， 流動相為100%甲醇； 體積流量 1 mL/min； 柱溫為室溫； 進樣量 10 μL； 檢測波長 446 nm。 按以上條件測定樣品中葉黃素量，理論塔板數(shù)不少于3 000。 HPLC色譜圖見圖 2。

圖2 對照品 （A） 及供試品 （B） 色譜圖

2.2.5 線性關(guān)系考察 分別吸取 10 μL的 1、 10、 25、 50以及 100 μg/m L的對照品溶液進樣， 按 “2.2.4” 項中色譜條件測定色譜峰面積，以峰面積為縱坐標，進樣量（μg） 為橫 坐標， 進 行分析， 得線性回 歸 方 程： y= 101.10x+221.20 （r=0.999 8）， 葉黃素對照品站在 1 ～100 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗 精密吸取質(zhì)量濃度為 25 μg/mL的葉黃素對照品溶液連續(xù)進樣5 次， 每次進樣10 μL， 測定峰面積， 其 RSD為 1.9%。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液， 分別于制備后0、 4、 8、 12、 24、 48 h 測定峰面積， 供試品溶液在 2 d 內(nèi)基本穩(wěn)定， 峰面積的 RSD為 3.4%。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知葉黃素含量的烏蘇里瓦韋藥材粉末 1.000 g， 共 6 份， 分別加入一定量的葉黃素對照品， 采用 “2.2.2” 項下操作， 按照 “2.2.4” 項色譜條件進樣， 分別測定峰面積，計算回收率， 結(jié)果見表2。

表 2 葉黃素加樣回收試驗結(jié)果 （n=6）

2.2.9 重復(fù)性試驗 精密稱取烏蘇里瓦韋藥材 2.00 g樣品， 按 “2.2.2” 項下方法制備， 采用 “2.2.4” 項色譜條件進樣 5 次， 測定并計算得到 RSD為 1.30%。

2.2.10 樣品測定 精密稱取樣品烏蘇里瓦韋藥材 2.00 g，5 份， 按 “2.2.2” 項中的方法制備， 將樣品稀釋 5 倍， 進樣 10 μL， 經(jīng)測定葉黃素平均含有量為 110 μg/g， RSD為 1.50%。

3 討論與結(jié)論

在綠原酸測定過程中，藥典記載的金銀花和菊花中綠原酸的定量測定， 波長分別選擇為327 nm和340 nm， 通過紫外檢測， 綠原酸在 325 nm處有最大吸收。 但在實驗過程中， 采用 DAD檢測器， 分別對波長 327 nm和 340 nm的結(jié)果進行了監(jiān)測， 結(jié)果這 2 個波長與 325 nm的波長， 色譜圖相似， 但分離度沒有 325 nm好， 故選擇 325 nm作為烏蘇里瓦韋中綠原酸的檢測波長。

在葉黃素測定過程中， 先后采用甲醇-水 （90 ∶10）、甲醇-水 （95 ∶5）、 甲醇-水 （98 ∶2）、 100%甲醇為流動相，結(jié)果表明在采用前3種條件做流動相時，其葉黃素保留時間較短， 且葉黃素的分離度不高； 在 100%甲醇為流動相時，分離效果好，操作簡便，色譜峰形最佳，保留時間適中，且具有良好的分離度。

選用以上方法測定烏蘇里瓦韋中綠原酸和葉黃素，準確、快速，具有較高的準確度和良好的重現(xiàn)性，干擾少。測定結(jié)果表明采用 《中國藥典》 記載的綠原酸提取方法，提取烏蘇里瓦韋中的綠原酸，經(jīng)測定其綠原酸量較高。烏蘇里瓦韋中葉黃素的量比大多數(shù)葉類蔬菜中量高［11］。 綠原酸［12-13］和葉黃素［14-15］都有廣泛的藥理作用， 因此烏蘇里瓦韋是一種有很大開發(fā)價值的藥用植物。

［ 1 ］ 國家中醫(yī)藥管理局 《中華本草》 編委會.中華本草［M］.上海： 上?？茖W技術(shù)出版社， 1999： 238.

［ 2 ］ 廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究所.廣西藥用植物名錄［M］.南寧： 廣西人民出版社， 1986： 34.

［ 3］ 劉克明.湖南藥物志［M］.長沙： 湖南科學技術(shù)出版社，2000： 870.

［ 4］ 朱有昌.東北藥用植物［M］.哈爾濱： 黑龍江科學技術(shù)出版社， 1989： 39.

［5］ 閔春艷，游本剛，許瓊明，等.正交試驗比較金銀花藥材中綠原酸與木犀草苷的乙醇提取工藝［J］.中成藥， 2011，33（10）： 1815-1818.

［ 6 ］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典： 2010 年版一部［S］.北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2010， 1： 205.

［ 7 ］ 盧金清， 何雪峰， 吳丹慧， 等.HPLC測定神農(nóng)香菊提取物中綠原酸、 木犀草素的含量［ J］.中成藥， 2009， 31（5）： 799-800.

［ 8 ］ 李喜鳳， 師繪敏， 陳隨清， 等.HPLC同時測定蒲公英中咖啡酸和綠原酸的含量 ［J］.中成藥， 2008， 30 （10）：1553-1555.

［9］ 韓 磊，宋曙輝.植物葉黃素的高效液相色譜分析測定［J］.中國農(nóng)學通報， 2005， 21（1）： 73-75.

［10］ 王子昕， 林曉明.北京地區(qū)常見蔬菜中葉黃素、 玉米黃素和 β-胡蘿卜素的測定及其含量［J］.營養(yǎng)學報， 2010， 32（3）： 290-293.

［11］ 趙志紅， 張逢秋， 朱 慧.反相高效液相色譜法測定食品中的葉黃素［J］.食品科技， 2009， 34（1）： 261-263.

［12］ dos Santos M D， Almeida M C， Lopes N P， et al.Evaluation of the Anti-inflammatory， Analgesic and Antipyretic Activities of the Natural Polyphenol Chlorogenic Acid［ J］.Biolog harmaceutil Bullet， 2006， 29（11） ： 2236-2240.

［13］ Shan Jianhua， Fu Jin ， Zhao Zhihui， et al.Chlorogenic acid inhibits lipopolysaccharide-induced cyclooxygenase-2 expression in RAW264.7 cells through suppressing NF-κB and JNK/AP-1 activation ［ J］ .Inter Immunopharmacol， 2009， 9 （ 9 ）：1042-1048.

［14］ Wang Mingchen ， Tsao Rong， Zhang Shanfeng， et al.Antioxidant activity， mutagenicity/anti-mutagenicity， and clastogenicity/anti-clastogenicity of lutein from marigold flowers［ J］.Food Chem Toxicol， 2006， 44（9） ： 1522-1529.

［15］ Kim JE， Clark R M.， Park Y， et al.Lutein decreases oxidative stress and inflammation in liver and eyes of guinea pigs fed a hypercholesterolemic diet［J］ .Nutr Res Pract.2012， 6（2）：113-119.

284.1

： B

： 1001-1528（2014）03-0654-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.051

2013-03-12

黑龍江省教育廳課題 （12521529）

王麗紅 （1968—） ， 女， 博士生， 教授， 從事植物藥的研究與開發(fā)利用。 TEL： 13846175975， E-mail： wlh_6663@163.com

*通信作者： 穆立薔 （1966—） ， 女， 教授， 主要從事植物資源開發(fā)利用的研究工作。 E-mail： m lq0417@163.com