黃藥子體外抗胃癌活性成分的篩選及分析

李春峰， 邱軍強， 苗晶囡， 張 翀， 張 寧， 劉樹民*

（1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院胃腸外科， 黑龍江 哈爾濱 150000； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院， 黑龍江 哈爾濱 150040）

黃藥子體外抗胃癌活性成分的篩選及分析

李春峰1，2， 邱軍強2， 苗晶囡2， 張 翀2， 張 寧2， 劉樹民2*

（1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院胃腸外科， 黑龍江 哈爾濱 150000； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院， 黑龍江 哈爾濱 150040）

目的 通過 MTT體外實驗觀察黃藥子 4 種不同提取物及從石油醚提取物中分離得到的黃獨乙素和 β-扶桑甾醇作用于 MGC803、 BGC823 和 SGC7901 3 種人胃癌細胞株， 探討黃藥子不同提取物及兩個單體對3 種胃癌細胞株的增殖情況的影響， 從而篩選出黃藥子有效抗胃癌活性成分。 方法 采用 MTT法檢測 0.5、 1、 2、 4、 6、 8、 10、 12 mg/mL的不同質(zhì)量濃度的黃藥子石油醚萃取物、 乙酸乙酯萃取物、 水層萃取物、 醇提物和最終質(zhì)量濃度為 1 ×10-4、 5 × 10-4、 1 ×10-3、 5 ×10-3、 1 ×10-2、 5 ×10-2、 1 ×10-1、 5 ×10-1mg/mL的黃獨乙素和 β-扶桑甾醇分別作用于 MGC 803、 BGC823 和 SGC 7901 細胞株 24 h 后對細胞增殖的影響。 結(jié)果 石油醚萃取物、 醇提物、 黃獨乙素和 β-扶桑甾醇均有不同程度的抑制腫瘤細胞生長的作用，而乙酸乙酯萃取物和水萃取物低劑量有不同程度的促進腫瘤細胞生長的作用； 大劑量表現(xiàn)為抑制腫瘤細胞生長的作用。 結(jié)論 從石油醚提取物中分離得到的黃獨乙素和 β-扶桑甾醇對胃癌細胞均有抑制作用。

黃藥子； 黃獨乙素； β-扶桑甾醇； 癌； MGC803； BGC823； SGC7901

黃藥 子 為 薯 蕷 科 植 物黃 獨 Dioscorea bulbifera L.的 塊莖，又名黃藥根、鐵秤砣等。藥性寒味苦，有毒，歸肺、肝經(jīng)。具有化痰散結(jié)、消癭止瘤、清熱解毒、涼血止血、抗癌的功效，其藥用價值較高，歷代本草對其治療癭疾、血證、 外科諸證的良效均有詳盡記載［1-6］。 近些年黃藥子的抗腫瘤功效逐 漸被大 家重視， 其對 S180( 小 白 鼠 肉瘤)、U14( 宮頸癌) 、 H22( 小鼠肝 癌) 等 均有抑制作 用［7-9］。 黃藥子的化學(xué)成分研究表明，其干燥莖塊中含有多種糖類、甾體皂苷和皂苷元、黃獨素等，從黃藥子中提取的不同成分按一定方式重組后抗癌療效高于傳統(tǒng)的酒泡［10-15］。 其中黃藥子 A， B， C以及薯蕷皂苷等均具有抗腫瘤作用。

本實驗采用 MTT法觀察黃藥子 4種不同提取物對 3種胃癌細胞株增殖抑制情況，分析不同提取物化學(xué)成分對于胃癌細胞的影響。進而發(fā)現(xiàn)石油醚提取物對腫瘤細胞的增殖有較好的抑制作用，將從石油醚提取物中分離得到的黃獨乙素和 β-扶桑甾醇分別采用 MTT法觀察二者對腫瘤細胞的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品和細胞株 黃藥子為市售中藥飲片， 購自哈藥集團世一堂飲片廠。經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究院付克教授鑒定， 所購中藥飲片為薯蕷科植物黃獨 Dioscorea bulbifera L.的塊根。 實驗用胃癌細胞株 MGC 803、 BGC823 和SGC 7901 由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院惠贈， 在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院細胞室傳代備用。

1.1.2 試劑 四甲基偶氮唑藍 (MTT)(Sigma公司產(chǎn)品)， RPMI1640 培養(yǎng)基、 胰蛋白酶、 胎牛血清、 青霉素-鏈霉素溶液 (賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司產(chǎn)品)。

1.1.3 黃藥子石油醚、 乙酸乙酯、 水和乙醇提取物的制備

準(zhǔn)確稱取黃藥子飲片 1 kg， 粉碎過 60 目篩， 將藥粉用95%乙醇回流提取得總浸膏 112.7 g， 并作為乙醇提取物，出膏率為 11.3%。 乙醇提取物經(jīng)石油醚萃取 4 次合并萃取液濃縮干燥得到略帶清香味的暗黃色固體， 得率 0.34%，稱石油醚提取物。石油醚萃取后分別用乙酸乙酯、水按極性依次萃取得各提取物， 得率分別為 1.31%、 2.64%。 黃獨乙素和 β-扶桑甾醇為石油醚提取物分離得到， 實驗時將各提取物及單體用優(yōu)級純 DMSO和無菌水 (20 ∶80) 配成所需質(zhì)量濃度后備用。

1.1.4 實驗儀器 KDC-160HR型高速冷凍離心機 ( 科大創(chuàng)新股份有限公司) ， MP-501A超級 恒溫箱， MK-3 型酶標(biāo)儀、 超低溫冰箱 (賽默飛世爾儀器有限公司)， HZQ-C型空氣浴振蕩器、 DL-CJ-WD型醫(yī)用型潔凈工作臺 ( 哈市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)， HF-90 型二氧化碳培養(yǎng)箱 (力康發(fā)展有限公司) ， CKX-41-SF型倒置顯微鏡 ( 美國 philippines公司)， 超純水機 (密理博上海貿(mào)易有限公司)。

2 實驗部分

MTT法測定 3 種細胞生長抑制率［16-19］選擇對數(shù)生長期胃癌細胞， 調(diào)整細胞計數(shù)為 1 ×105個/L接種于 96 孔板，每孔 100 μL， 每個質(zhì)量濃度設(shè) 6 孔重復(fù)， 邊緣空白孔加100 μL PBS 保持濕度， 設(shè)定空白對照只加培養(yǎng)基和溶劑，對照組加細胞培養(yǎng)基并給予溶劑。實驗組分別給予各提取物終質(zhì)量濃度為 0.5、 1、 2、 4、 6、 8、 10 和 12 mg/mL的不同提取物和最終計數(shù)分別為 1 ×10-4、 5 ×10-4、 1 × 10-3、 5 ×10-3、 1 ×10-2、 5 ×10-2、 1 ×10-1、 5 ×10-1mg/mL的黃獨乙素和 β-扶桑甾醇， 培養(yǎng) 24 h 后， 每孔分別加入 10 μL MTT 37 ℃ 孵育 4 h， 吸取上清， 加入 100 μL DMSO在平板搖床微振蕩 20 min 后， 用酶標(biāo)儀在波長 570 nm處 檢 測 每孔吸光 度 (A)， 計算 細 胞 生長抑制率(%)=1-(A實驗-A本底)/(A對照-A本底) ×100%。

3 結(jié)果及分析

3.1 提取物對 3 種胃癌細胞株的生長抑制情況 將接種于96 孔板的胃癌細胞株 MGC803、 BGC823 和 SGC7901 正常培養(yǎng) 24 h 后， 加入不同提取物繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 觀察細胞的存活率， 發(fā)現(xiàn) 0.5 mg/mL石油醚提取物作用于細胞株 BGC823和 SGC 7901 的抑制率分別是42.1%和60.2%， 而2mg/mL的石油醚提取物作用 于細胞 株 MGC803 的抑制 率約為61%， 與對照組比均有顯著性差異 (P＜0.05)， 見圖 1。

圖1 石油醚提取物對3種胃癌細胞的抑制作用 （n=3， ˉ）

0.5 mg/m L乙醇提取物作用于胃癌細胞株 MGC 803 抑制率 48.0%， 與對照組比有極顯著性差異； 作用于細胞株SGC 7901 抑制率為 49.0%， 與對照組比有顯著差異 (P＜0.01)， 見圖 2。

乙酸乙酯提取物作用于細胞株 MGC803 細胞在低劑量表現(xiàn)為促生長作用， 質(zhì)量濃度為 1 mg/mL時有促生長作用， 促生長率為 29.6%， 且與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)； 水提取物作用于細胞株 MGC 803 質(zhì)量濃度為1 mg/mL時促生長率為 43.9%， 與對照組相比有顯著性差異 (P＜0.05)； 6mg/mL的乙酸乙酯提取物作用于細胞株SGC 7901 表現(xiàn)為抑制生長， 抑制率為 13.6%且有顯著性差異 (P＜0.05)， 見圖 3。

圖2 乙醇提取物對 3種胃癌細胞的抑制作用 （n=3， ˉ）

圖3 乙酸乙酯提取物對 3種胃癌細胞的抑制作用 （ n=3， ˉ）

4 mg/mL水提取物作用于細胞株 SGC 7901 表現(xiàn)為抑制生長， 抑制率達 15.9%， 與對照組相比有顯著 性差異(P＜0.01)， 見圖 4。

圖4 水提取物對3種胃癌細胞的抑制作用 （ n=3， ˉ）

3.2 黃獨乙素和 β-扶桑甾醇對 3 種胃癌細胞株增殖的抑制作用 加入黃獨乙素和 β-扶桑甾醇繼續(xù)培養(yǎng) 24 h， 發(fā)現(xiàn)不同質(zhì)量濃度的黃獨乙素對胃癌細胞株胃癌細胞株 BGC823和 SGC7901 的抑制率較低， 且隨質(zhì)量濃度加大抑制率變化不大， 而對胃癌細胞株 MGC803 的抑制作用較強， 且隨質(zhì)量濃度變化抑制率逐漸增強， 見圖 5； β-扶桑甾醇對于胃癌細胞株 BGC823 和 SGC7901 在 1 ×10-4mg/mL抑制作用顯著， 與對照組相比差異顯著； 對胃癌細胞株 MGC803 的增殖抑制作用較小，見圖6。

圖5 黃獨乙素對3種胃癌細胞株增殖的影響

圖 6 β-扶桑甾醇對 3 種胃癌細胞株增殖的影響

4 討論

隨著現(xiàn)代社會腫瘤患者的增多，西藥毒副作用大，同時傳統(tǒng)的中醫(yī)藥在國際上的認可度的提高，從天然藥用植物中發(fā)現(xiàn)新的抗癌的藥物的興趣正逐步顯示出來，開發(fā)抗腫瘤效果好且毒副作用低的傳統(tǒng)中藥亟需解決。本實驗通過體外培養(yǎng) MGC 803、 BGC823 和 SGC 7901 3 種胃癌細胞株，研究黃藥子不同提取物的抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)石油醚提取物和乙醇提取物抑制腫瘤生長的效果最好，且與劑量呈一定的線性關(guān)系， 與文獻［20］報道一致， 同時也驗證了黃藥子作為傳統(tǒng)中藥對胃癌有顯著療效。同時發(fā)現(xiàn)從石油醚提取物中分離得到的黃獨乙素和 β-扶桑甾醇對胃癌細胞株的增殖均有不同程度的抑制作用，同時首次在黃藥子中分離得到的甾醇類 β-扶桑甾醇的抗癌作用顯著， 二萜內(nèi)酯類黃獨乙素的抗癌作用較弱。石油醚提取物發(fā)揮抗腫瘤藥理作用可能是其含有的薯蕷皂苷元和二萜內(nèi)酯類成分發(fā)揮作用［21-27］， 為黃藥子抗腫瘤作用提 供了一定的依據(jù)。 為下一步開展黃藥子活性成分抗腫瘤作用機制的研究探討提供基礎(chǔ)。

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R285.5

:B

:1001-1528(2014)02-0387-04

=388,ebook=173

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.039

2013-03-12

黑龍江省衛(wèi)生廳科研項目 (2011-145)； 國家自然基金面上項目 (30572368)

李春峰 (1978—) ， 男， 主任醫(yī)師， 研究方向: 胃癌腹腔轉(zhuǎn)移機制及中藥治療。 Tel:18745787187， E-mail:lichunfeng007@ 163.com

*通信作者: 劉樹民 (1963—) ， 男， 副教授， 博士生導(dǎo)師， 研究方向: 中藥學(xué)中藥藥理。 Tel:(0451)87266988， E-mail:keji-liu@ 163.com