廣西苦丁茶不同活性部位抑菌活性研究

蔡 鵑， 黃敏桃， 黃云峰， 賴茂祥， 黃庶識*， 劉華鋼

（1.廣西科學(xué)院 生物物理實驗室， 廣西 南寧 530007； 2.江西贛州衛(wèi)生學(xué)校 藥劑藥化教研室， 江西 贛州341100； 3.廣西中醫(yī)研究院， 廣西 南寧 530022； 4.廣西醫(yī)科大學(xué)， 廣西 南寧 530021）

廣西苦丁茶不同活性部位抑菌活性研究

蔡 鵑1，2， 黃敏桃1， 黃云峰3， 賴茂祥3， 黃庶識1*， 劉華鋼4*

（1.廣西科學(xué)院 生物物理實驗室， 廣西 南寧 530007； 2.江西贛州衛(wèi)生學(xué)校 藥劑藥化教研室， 江西 贛州341100； 3.廣西中醫(yī)研究院， 廣西 南寧 530022； 4.廣西醫(yī)科大學(xué)， 廣西 南寧 530021）

目的 考察苦丁茶不同極性部位對革蘭氏陰性菌、陽性菌的抑制作用，確定苦丁茶抑菌活性的藥效部位，為研究苦丁茶抑菌活性成分提供依據(jù)。 方法 采用系統(tǒng)溶劑提取法得到7個不同極性部位， 通過 96孔板測定不同極性部位的最低抑菌濃度 （MIC）， 牛津杯法測定其抑菌圈直徑， 并通過 HPLC法分別測定其中熊果酸、 齊墩果酸、 槲皮素、山柰素量，苯酚硫酸法測定多糖量，分析5種物質(zhì)量與抑菌能力之間的關(guān)系。結(jié)果 不同極性部位抑菌結(jié)果顯示石油醚無抑菌活性，三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇提取物抑菌活性中等，乙醇、甲醇抑菌活性強(qiáng)，水提取物的抑菌活性最強(qiáng)。結(jié)論 槲皮素、熊果酸和多糖類為苦丁茶抑菌活性成分。

苦丁茶；極性部位；槲皮素；山柰素；熊果酸；齊墩果酸；多糖；抑菌

廣西苦丁茶為冬青科苦丁茶冬青 Ilex kudingcha C.J. Tseng， 又名茶丁、 苦登茶， 主產(chǎn)于廣 西、 廣 東、 海南等地。葉含黃酮、多種皂苷及多糖類化合物，具有清熱解毒、健胃消積、止咳化痰、生津止渴、提神醒腦、明目益智等功效［1］。 苦丁茶 在 抗 菌 抑 菌 方 面 具 有 顯 著 藥 理 活 性［2-4］，但是對于其抑菌的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究成果鮮見報道。本研究采用系統(tǒng)溶劑提取法，用極性不同的7種溶劑提取苦丁茶中的化學(xué)成分，根據(jù)不同極性部位的抑菌效果初步推測其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，并測定苦丁茶中含有的熊果酸、齊墩果酸、槲皮素、山柰素、多糖，探究這5種物質(zhì)與抑菌能力的相關(guān)性。

1 儀器與材料

1.1 實 驗 儀 器 瑞 士 梅 特 勒-托 利 多 超 越 型 分 析 天 平（ Mettler Toledo XS105DU） 。 紫外分光光 度計 （ 北京瑞利分析儀器公司）， 超凈工作臺 （蘇州凈化設(shè)備廠）， 平板振蕩器 （北京海淀電子醫(yī)療儀器廠）， 戴安 U3000 高效液相儀（包括四元泵、自動進(jìn)樣器、 紫外可見檢測器、 柱溫箱、 變色龍工作站） ， LichrospherTMC18（5 μm， 4.6mm×250mm）柱、 Zorbax ODS （5 μm， 4.6mm×250mm） 柱， 冰箱 （海爾藥品保存箱）， 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 （上海亞榮生化儀器廠）， 循環(huán)水式真空泵 （鄭州長城科工貿(mào)有限公司）， 數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱 （上海博迅實業(yè)有限公司）， 離心機(jī) （SIGMA 1-15P），恒溫?fù)u床 （上海天呈）， 96 孔板 （美國 Bio-Rad 公司）， 牛津杯 （天津思利達(dá)）， 0.22 μm微孔濾膜 （天津津騰公司）。

1.2 實驗材料

1.2.1 藥材 苦丁茶樣品于 2011 年 7 月采自廣西南寧市地委大院，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員鑒定為冬青科冬青屬苦丁茶冬青 Ilex kudingcha C.J.Tseng， 采回后陰干，取其干燥葉片粉碎、烘干，置于干燥器保存待用。

熊果酸 （ 批號： 709-8501）， 齊墩果酸 （ 批號： 0709-9803）， 槲皮素 （批號： 100081-200406）， 山柰素 （批號：110861-200405）， 均購于中國藥品生物制品檢定所。

1.2.2 細(xì)菌 大腸桿菌 Escherichia coli（ ATCC44102 ） 、 金黃 色 葡 萄 球 菌 Staphyloccocus aureus Rosenbach（ ATCC26003 ）、 綠 膿 桿 菌 Pseudomonas aeruginosa（ATCC27583） 均購 自美國模式 培養(yǎng)物 集存庫 （ American Type Culture Collection） 。

1.2.3 試劑 石油醚、 正丁醇、 乙酸乙酯、 三氯甲烷， 無水乙醇、 甲醇 （均為天津富宇精細(xì)化工， 分析純）， 硫酸（廉江市愛廉化試劑有限公司， 分析純）， MH瓊脂培養(yǎng)基、MH肉湯、 營養(yǎng)肉湯 （均為廣東環(huán)凱公司）， 氯化三苯四氮唑 TCC染色劑 （ Amresco公司） ， 甲醇 （ fisher公司， 色譜純）， 磷酸 （天津科密歐化學(xué)試劑， 色譜純）。

2 方法

2.1 苦丁茶不同極性提取物的提取方法 分別稱取 7 份5.0 g的苦丁茶葉片粉末， 分別加入不同極性提取溶劑 （石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、無水乙醇、甲醇、水） 200 mL， 超聲提取3 次， 每次2 h， 過濾合并， 濃縮揮干， 各 不 同 極 性 部 位 得 膏 率 （ g/g） 分 別 為 5.72%、7.62%、 27.29%、 26.02%、 23.82%、 24.86%、 29.86%。有機(jī)溶劑提取物用甲醇定容至 10 mL量瓶， 水提物用水定容至 10 mL量瓶中。 得到不同極性苦丁茶提取物， 用 0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌后， 用96 孔板法和牛津杯法分別評價其抑菌濃度效果。 用 HPLC法直接測定其中熊果酸、齊墩果酸量， 苯酚硫酸法測定多糖量。 移取2 mL提取物，加入 500 μL 25%HCl， 超聲 4 h， 甲醇定容至 10 m L量瓶中， 得苦丁茶水解液后， HPLC法測定其中槲皮素、 山柰素量。

2.2 菌種的培養(yǎng) 將解凍、 活化后的菌液接種到營養(yǎng)瓊脂平板， 37 ℃培養(yǎng)， 挑取單個菌落接種于 4 mL液體培養(yǎng)基內(nèi)， 37 ℃恒溫震搖培養(yǎng) 12 h。 取菌液于 4 ℃ 10 000 r/min離心 10 min， 棄上清， 沉淀用生理鹽水洗 2 次， 生理鹽水校正濃度至吸光度為 0.1， 待用。

2.3 微量稀釋法測定樣品對細(xì)菌的生長抑制作用 將苦丁茶不同極性提取物倍比稀釋，將提取液用滅菌MH培養(yǎng)基稀釋 5 倍， 加入 96 孔板中， 每孔 100 μL， 每藥重復(fù) 3 孔。將細(xì)菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期， 并校正到吸光度為 0.1 的菌液，將其稀釋 100 倍， 每孔定量接種 100 μL。 則 1 ～10 列最終作用質(zhì)量濃度分別為 50、 50、 50、 25、 12.5、 6.25、 3.13、1.57、 0.78、 0.39 mg/mL（生藥濃度）， 保證每孔甲醇體積分?jǐn)?shù)為 10%， 第 11 列為不加藥的 10%甲醇陰性對照組，第12列為不加藥的滅菌水陰性對照組， 每藥一行重復(fù)。 孔板加蓋置微型震蕩器振蕩培養(yǎng)，使各孔內(nèi)溶液混勻，封口膠密封， 35 ℃濕盒孵育 18 ～20 h。 孵育結(jié)束前 3 h 每孔加入 2.5 mg/mL氯化三苯四氮唑 （TTC） 溶液 10 μL， 繼續(xù)孵育1～3 h后有細(xì)菌生長孔呈紅色， 抑制細(xì)菌肉眼未見生長的最低藥物質(zhì)量濃度為該藥對細(xì)菌的最低抑菌濃度。實驗重復(fù) 3 次， 實驗結(jié)果以最低抑菌濃度 （MIC） 值表示。

2.4 牛津杯法測定樣品對細(xì)菌的生長抑制作用 菌株生長至對數(shù)生長期， 用無菌生理鹽水調(diào)至吸光度為0.1， 按1 ∶100 倍稀釋。 將稀釋后的菌液吸取 50 μL（綠膿桿菌 30 μL） 涂布均勻于 MH瓊脂平板表面， 稍干后將牛津杯等距離放置于瓊脂表面， 向牛津杯中定量加入 200 μL按照“2.1” 項方法下提取的甲醇和水定容的 5.0 g/mL（生藥濃度） 苦丁茶提取液， 4 ℃冰箱放置 10 h使其擴(kuò)散， 再置于35 ℃恒溫箱培養(yǎng) 18 ～20 h， 觀察并用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，每個藥物抑菌實驗重復(fù)3次，抑菌結(jié)果為3次實驗平均值。 陰性對照組為 0.22 μm除菌過濾的純甲醇溶液和滅菌水溶液。 抑菌圈直徑結(jié)果用 ±SD表示。

2.5 HPLC測定苦丁茶不同極性部位熊果酸、 齊墩果酸、槲皮素、 山柰素 取苦丁茶不同極性部位提取液， 采用 LichrospherTMC18（5 μm， 4.6 mm×250 mm） 柱， 以甲醇-水-磷酸 （85 ∶15 ∶0.1） 為流動相， 檢測波長為220 nm， 體積流量為 0.8 mL/min， 柱溫 30 ℃， 測定其中熊果酸、 齊墩果酸的量［5］。

取苦丁茶不同極性鹽酸水解液測定其槲皮素、山柰素量。 采用 Zorbax ODS （5 μm， 4.6 mm×250 mm） 柱， 以甲醇-0.4%磷酸水 （50 ∶50） 為流動相， 檢測波長為 360 nm，體積流量 0.7mL/min， 柱溫 40 ℃， 測定［6］。

2.6 苯酚硫酸法測定苦丁茶不同極性部位多糖量 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備： 精密稱取無水葡萄糖純品 20.03 mg、20.08mg， 一份用水定容于 100mL量瓶中， 一份用甲醇定容于 100 mL量瓶中， 分別吸取葡萄糖溶液0.4、 0.6、 0.8、1.0、 1.2、 1.4、 1.6、 1.8 mL， 并分別以水 （甲醇） 補(bǔ)至2.0mL， 加入 6%苯酚 1.0 mL及濃硫酸 5.0 mL， 靜置 10 m in， 搖勻， 室溫放置 20m in 后， 480 nm測吸光度， 以 2.0 mL水 （甲醇） 按同樣顯色操作為空白， 測定葡萄糖水溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線和葡萄糖甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。

換算因素的測定 稱取苦丁茶 10 g， 置圓底燒瓶中，用 300 mL水超聲提取 4 次， 每次 3 h， 過濾合并濾液， 濃縮至 50 mL。 95%乙醇沉淀多糖， 乙醚、 丙酮、 無水乙醇溶劑系統(tǒng)反復(fù)沖洗，真空低溫干燥。得苦丁茶粗多糖。

精密稱取干燥至恒重的苦丁茶粗多糖 5.12 mg、 5.32 mg、 5.58 mg 3 份， 用去離子水定容于 100 mL量瓶， 得濃度為 c1、 c2、 c3的苦丁茶多糖。 取 2mL按照苯酚硫酸法測定其吸光度 A1、 A2、 A3， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將 A1、 A2、 A3換算成 C1、 C2、 C3， 則

苦丁茶樣品多糖量 對照標(biāo)準(zhǔn)曲線將苦丁茶多糖吸光度換算成苦丁茶多糖中葡萄糖濃度，則：

苦丁茶樣品中多糖測定 吸取不同極性部位提取液0.01 mL， 甲醇定容的提取液用甲醇稀釋至 2 mL， 水定容的提取液用水稀釋至2 mL， 按苯酚硫酸法操作測定其吸光度，并分別代入甲醇、水制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成葡萄糖濃度。

2.7 槲皮素、 山柰素、 熊果酸、 齊墩果酸以及多糖與 3 種菌間的相關(guān)性分析 數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析通 過 SPSS Statistics 17 軟件， 采用雙變量相關(guān)分析 Spearman 分析法， 對苦丁茶提取物中5種物質(zhì)含有量與其對3種菌的抑菌圈直徑做相關(guān)性分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 微量稀釋法測定不同極性提取物對革蘭氏陽性菌、 陰性菌的生長抑菌效果 96孔板中， 經(jīng)苦丁茶不同極性提取物作用18 h后， 大腸桿菌、 金黃色葡萄球菌、 綠膿桿菌 3種菌生長均受到抑制，兩組陰性對照組菌均生長良好。如表1所示，水提物對3種菌的抑菌效果最優(yōu)，最低抑菌質(zhì)量濃度 （生藥濃度） 分別為 6.25、 3.13、 6.25 mg/mL， 甲醇和乙醇次之。結(jié)果顯示苦丁茶提取物對革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑制作用均強(qiáng)于革蘭氏陰性菌的大腸桿菌和綠膿桿菌。

表 1 樣 品 對 3 種 菌 的 最 低 抑 菌 質(zhì) 量 濃 度 （mg·m L-1）（生藥濃度）

3.2 牛津杯法測定不同極性提取物對革蘭氏陰性菌、 陽性菌的抑菌效果 用牛津杯法測定的苦丁茶不同極性提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌的抑菌結(jié)果顯示（表2）， 水提物對3 種菌的抑菌效果最強(qiáng)， 抑菌圈直徑分別為19.56mm、 32.78mm、 22.20mm， 甲醇、 乙醇提取物次之，甲醇和乙醇提取物抑菌效果差異不顯著?？喽〔杼崛∥飳Ω锾m氏陽性菌金黃色葡萄球菌的抑制作用強(qiáng)于革蘭氏陰性菌 大腸桿菌 和 綠 膿桿菌， 與 96 孔 板 法 測 定 結(jié) 果一致。

表 2 樣品作用于 3 種菌的抑菌圈直徑/mm

3.3 不同極性部位槲皮素、 山柰素、 熊果酸、 齊墩果酸以及多糖量 HPLC測定結(jié)果顯示 （表 3）， 隨著溶劑極性的增加，槲皮素、熊果酸、齊墩果酸量均呈增加趨勢，山柰素則在低極性溶劑提取物中含有量較高。

表3 樣品中5種成分測定結(jié)果

3.4 槲皮素、 山柰素、 熊果酸、 齊墩果酸以及多糖與 3 種菌間的相關(guān)性分析 由表4可知，苦丁茶提取液中多糖量、熊果酸量與抑菌能力呈極顯著的正相關(guān)性，特別是多糖量與其對金黃色葡萄球菌的抑菌能力之間 r=1 （P＜0.01），線性相關(guān)。槲皮素量與3種菌的抑菌能力之間相關(guān)系數(shù)在0.85 左右 （P＜0.01）， 顯著性相關(guān)。 齊墩果酸與其對 3 種菌的抑菌圈直徑在 0.2 左右， 低度線性相關(guān)， 山柰素量與 3種菌的抑菌圈直徑趨近于0， 無相關(guān)性。

表4 樣品中 5種成分與3種菌的相關(guān)性分析

4 討論

實驗結(jié)果顯示，苦丁茶提取物抑菌活性與其多糖的量、熊果酸量完全相關(guān)，與槲皮素量高度相關(guān)，與齊墩果酸的量低相關(guān)，與山柰素量不相關(guān)，說明多糖、槲皮素、熊果酸是苦丁茶中重要的抑菌活性成分。目前已知多種中藥的水溶性多糖具有多樣的生物學(xué)功能，有顯著的抗菌活性［7-8］， 苦丁茶水溶性多糖也具有抗菌活性［3］， 但對于苦丁茶多糖的抑菌原理有待研究。熊果酸抗傷寒桿菌、金葡菌的作用比氯霉素強(qiáng)［9］。 抑菌原理可能為作用于細(xì)菌細(xì)胞外膜，抑制細(xì)菌生物被膜形成，引起形態(tài)改變導(dǎo)致細(xì)菌自溶而產(chǎn)生抗革蘭陽性菌 作用［10-11］； 或 可通過抑制 肽聚糖的更新， 改變細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)， 并促進(jìn)其自溶［12］。 槲皮素是一種廣譜抗菌物質(zhì)，可用于防治各種細(xì)菌感染性疾病，其抗菌消炎的機(jī)制可能與炎癥因子的 調(diào)節(jié)有關(guān)［13-15］。 也有研究表明槲皮素的抑菌作用與 DNA的改變有關(guān)［16］。

苦丁茶水提物中的多糖量遠(yuǎn)高于其他極性部位，而水提物抗菌性最強(qiáng)，提示苦丁茶水溶性多糖可能在抗菌活性上也起到一定作用。由于極性提取物中同時含有槲皮素、熊果酸和多糖成分，具體哪種成分在抗菌活性方面起主要作用或者多種成分在抗菌活性中是否有起協(xié)調(diào)作用，還有待做深入研究?？喽〔枋且环N保健茶，民間習(xí)用方法是以泡茶方式飲用為主，其保健作用可能與水提液中活性物質(zhì)含有量高有關(guān)。

本實驗通過系統(tǒng)溶劑法提取苦丁茶的化學(xué)成分作用于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌，結(jié)果表明不同極性部位提取物的抑菌效果隨著提取溶劑的極性增加而增強(qiáng)，水溶性提取物對3種細(xì)菌的抑制作用效果最強(qiáng)。

苦丁茶的抑菌活性可能與提取物中熊果酸、槲皮素、多糖的量相關(guān)，而與齊墩果酸、山柰素量無關(guān)?？喽〔杼崛∥飳Ω锾m氏陽性菌的抑制效果優(yōu)于革蘭氏陰性菌。

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R285.5

： B

： 1001-1528（2014）01-0198-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.052

2013-03-15

國家科技支撐計劃項目 （2011BAI01B04） ； 廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃 （0992003A-20）

蔡 鵑 （1988—） ， 女， 碩士生， 從事中藥質(zhì)量控制研究。 TEL： （0771） 2503990， E-mail： cjlzl123@126.com

*通信作者： 黃庶識， 研究員， 博士， 從事中藥質(zhì)量控制研究。 TEL： （0771） 2503990 ， E-mail： hshushi@gxas.cn劉華鋼， 教授， 博士， 從事中藥質(zhì)量控制研究。 Tel： （0771） 5350964， E-mail： lhg@gxfda.gov.cn