頭痛滴丸不同提取工藝指紋圖譜比較研究

劉 悅， 龔蘇曉， 張鐵軍*， 王思路， 胡 喬

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)， 天津 300070； 2.天津藥物研究院釋藥技術(shù)與藥物代謝動力學(xué)國家重點實驗室，天津 300193； 3.天津藥物研究院中藥現(xiàn)代制劑與中藥質(zhì)量控制技術(shù)國家和地方工程實驗室， 天津 300193）

頭痛滴丸不同提取工藝指紋圖譜比較研究

劉 悅1，2，3， 龔蘇曉2，3， 張鐵軍2，3*， 王思路1，2，3， 胡 喬1，2，3

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)， 天津 300070； 2.天津藥物研究院釋藥技術(shù)與藥物代謝動力學(xué)國家重點實驗室，天津 300193； 3.天津藥物研究院中藥現(xiàn)代制劑與中藥質(zhì)量控制技術(shù)國家和地方工程實驗室， 天津 300193）

目的 優(yōu)選頭痛滴丸 （川芎、藁本、 菊花、 白芷、 鉤藤） 最佳提取方法。方法 采用高效液相色譜法， 建立頭痛滴丸的化學(xué)成分指紋圖譜的測定方法，以阿魏酸、木犀草苷、藁本內(nèi)酯3種對照品進(jìn)行色譜峰指認(rèn)，確定特征色譜峰的藥材歸屬， 比較頭痛滴丸的水回流提取、 傳統(tǒng)水煎煮、 80%乙醇回流提取、 80%乙醇滲漉提取 4 種提取方法的特征色譜峰數(shù)目和相對峰面積大小， 優(yōu)選出最佳提取方法。 結(jié)果 醇滲漉提取工藝樣品中共標(biāo)記了45個色譜峰， 其中有21個藥材特征峰， 且醇滲漉提取工藝相比其他提取工藝， 特征色譜峰的數(shù)量和相對峰面積均具有明顯優(yōu)勢， 其中有19個藥材特征峰相對峰面積最大。 結(jié)論 通過頭痛滴丸4種不同的提取工藝的對比， 確定醇滲漉提取工藝優(yōu)于其他工藝。

頭痛滴丸；化學(xué)成分；指紋圖譜；提取工藝

頭痛滴丸方為臨床經(jīng)驗方，由川芎、藁本、菊花、白芷、鉤藤等8味藥組成，具有疏風(fēng)止痛、清熱平肝熄風(fēng)的功效，臨床常用來治療偏頭痛。川芎、藁本中的有機(jī)酸和揮發(fā)油類成分，菊花中黃酮及苷類成分，白芷中的揮發(fā)油和香豆素類成分以及鉤藤中的生物堿類成分均為治療頭痛的主要指標(biāo)成分［1-5］。 方中川芎、 藁本為君藥， 阿魏酸、 藁本內(nèi)酯是兩藥的共有成分，阿魏酸能夠抗凝血，具有抗炎鎮(zhèn)痛的作用［6］。 藁本內(nèi)酯具有鎮(zhèn)靜、 鎮(zhèn)痛、 解痙、抗驚厥等作用，被認(rèn)為是治療偏頭痛的物質(zhì)基礎(chǔ)［7］。 菊花為臣藥， 疏散清熱，主要藥效成分為木犀草苷， 具有抗炎和鎮(zhèn)痛作用［8］。 中藥藥效是多成分、多靶點整體作用的結(jié)果，在對中藥的提取工藝篩選過程中，若只采用某單一化學(xué)成含有量為指標(biāo)，不能較全面地表征出復(fù)方全貌的特點，具有一定的局限性。本實驗運用高效液相色譜法建立了頭痛滴丸不同提取工藝的化學(xué)成分指紋圖譜，盡可能多的得到各成分的色譜峰，相對完整地反映出全方的化學(xué)成分，以不同提取工藝的特征峰面積的數(shù)量和相對峰面積 （以相應(yīng)對照藥材色譜圖為基準(zhǔn)計算）的大小為依據(jù)來評價不同提取工藝的優(yōu)劣，并用各單一對照藥材對全方化學(xué)成分指紋圖譜峰進(jìn)行鏡像比對，以確定不同特征峰歸屬。

1 儀器與試藥

Dionex Summit高效液相色譜儀 （美國戴安公司）； Lab Alliance高效液相色譜儀 （ 美國蘭博公司）； 超聲波提取器 AS3120 （江蘇漢邦科技有限公司） ； AB204-N電 子 天 平 （ 萬 分 之 一， Mettler-Toledo）； BP211D電子天平 （ 十萬分之一，Sarlorius）；R501B星海旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 （無錫市星海王生化設(shè)備有限公司）； 電加熱套 PTHW型 （河南豫華儀器有限公司）。

阿魏酸對照品 （批號 110773-200611， 購自中國藥品生物制品檢定所）、木犀草苷對照品 （批號11720-201106， 購自中國食品藥品檢定研究院）、藁本內(nèi)酯對照品 （自制， 批號 20130301）。 甲醇（天津市康科德科技有限公司） 為分析純和色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

方中各味藥材均購自天津中藥飲片廠，經(jīng)天津藥物研究院張鐵軍研究員鑒定， 均符合 2010 年版《中國藥典》 規(guī)定。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品的制備 精密稱取阿魏酸、 木犀草苷、藁本內(nèi)酯對照品適量， 置于25 m L量瓶中， 加甲醇溶解，定容并稀釋至刻度，搖勻，得混合對照貯備液； 取其中1 mL貯備液置10 m L量瓶中， 加甲醇稀釋至刻度， 搖勻， 得每 1 m L含阿魏酸20.56 μg、木犀草苷 26.80 μg、 藁本內(nèi)酯 34.10 μg的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 工藝 1 樣品的制備 稱取 6 倍處方量的川芎、 藁本、 白芷、 菊花等藥材， 砸碎， 10 倍量水冷浸 60 min， 回流提取 3 次， 每次 1.5 h， 合并 3次提取液放冷，減壓濃縮得稠膏，作為樣品1 （每1 g稠膏約含2 g生藥）。

2.2.2 工藝 2 樣品的制備 稱取 6 倍處方量的川芎、藁本、白芷、菊花等藥材，砸碎，加水冷浸30 min， 加水量為沒過藥材 5 cm， 煎煮 2 次， 第 1煎 30 min， 加水量為 2 000 m L， 紗布過濾。 第 2 煎20 min， 加水量為 1 200 mL， 紗布過濾。 合并兩次濾液， 減壓濃縮至稠膏， 作為樣品2 （每1 g稠膏約含2 g生藥）。

2.2.3 工藝 3 樣品的制備 稱取 6 倍處方量的川芎、 藁本、 白芷、 菊花等藥材， 砸碎， 10 倍量80%乙醇冷浸 60 min， 回流提取 3 次， 每次 1.5 h，合并3次提取液放冷，減壓濃縮得稠膏，作為樣品3 （每1 g稠膏約含2 g生藥）。

2.2.4 工藝 4 樣品的制備 稱取 6 倍處方量的川芎、藁本、白芷、菊花等藥材，粉碎成粗粉，過10 目篩， 3 倍量 80%乙醇浸泡過夜后， 開始滲漉，滲漉體積流量為 5 m L/（ min·kg）， 溶劑用量為 14倍量，收集滲漉液，混勻，減壓濃縮得稠膏，作為樣品4 （每1 g稠膏約含2 g生藥）。

2.2.5 對照藥材溶液制備 稱取川芎對照藥材，按照混合提取工藝中相應(yīng)工藝進(jìn)行提取，制得川芎對照藥材溶液；同法制得藁本、菊花、白芷、鉤藤、全蝎、郁金、細(xì)辛對照藥材溶液。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性 Dikma Diamonsil-C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm， 5 μm）， 流動相為甲醇 （A）-0.05%磷酸溶液 （B） 梯度洗脫 （0 ～14 min， 35%→50%A； 14 ～16 min， 50% →75%A；16 ～35 min， 75% →77%A； 35 ～36 min， 77%→35%A； 36 ～40 min， 35%A）。 柱溫 30 ℃， 體積流量 1 mL/min， 波長 282 nm。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取工藝 4 樣品，連續(xù)進(jìn)樣 6次， 按 “2.3” 項色譜條件進(jìn)行測定， 計算各特征色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的 RSD值，結(jié)果分別為 0.65% ～1.86%、1.23% ～2.34%，表明該儀器精密度良好 （相對峰面積以 39 號峰藁本內(nèi)酯為參比峰）。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗 取工藝 4 樣品， 室溫放置， 分別于 0、 2、4、 8、 16、 24 h 取樣， 按 “2.3”項色譜條件測定，每次進(jìn)樣量均為 10 μL， 計算各特征色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的 RSD值，結(jié)果分 別為 0.78% ～1.92%、 1.42% ～2.44%，表明供試品溶液室溫放置 24 h 內(nèi)穩(wěn)定 （相對峰面積以 39 號峰藁本內(nèi)酯為參比峰）。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取工藝 4 樣品， 按供試品溶液制備方法制備 6 份， 按 “2.3” 項下色譜條件測定，計算各特征色譜峰的相對保留時間和相對峰面積 的 RSD 值，結(jié) 果 分 別 為 0.87% ～1.76%、1.56% ～2.63%， 表明該方法的重復(fù)性良好 （相對峰面積以 39 號峰藁本內(nèi)酯為參比峰）。

2.5 樣品測定

2.5.1 不同提取工藝樣品指紋圖譜比較 取等生藥量樣品， 溶于 25 mL甲醇中， 超聲處理 30 min，過 0.45 μm微孔濾膜， 備用。 按 “2.3” 項色譜條件進(jìn)行測定， 并進(jìn)行主要色譜峰的指認(rèn)。 如圖1、2所示。

圖1 混合對照品色譜圖Fig.1 Chromatogram ofm ixed reference substances

圖2 頭痛滴丸不同提取方法的 HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerPrints of Toutong DroPPing Pills sam Ples w ith d ifferent extraction methods

2.5.2 特征峰的藥材歸屬 醇滲漉工藝共標(biāo)記了45個色譜峰， 以醇滲漉提取工藝為基準(zhǔn)， 分別對各藥材工藝樣品進(jìn)行鏡像比對，確定了21個色譜峰的藥材歸屬，如圖3～8所示。歸屬的特征峰如表1所示。

圖3 頭痛滴丸醇滲漉提取和川芎鏡像圖Fig.3 Ethanol Percolation extraction of Toutong DroPPing Pills and Chuanxiong Rhizoma comParison chart

圖4 頭痛滴丸醇滲漉提取和藁本鏡像圖Fig.4 Ethanol Percolation extraction of Toutong DroPPing Pills and Ligustici Rhizoma com Parison chart

圖5 頭痛滴丸醇滲漉提取和白芷鏡像圖Fig.5 Ethanol Percolation extraction of Toutong D roPPing Pills and Angelica dahurica Rhizoma com Parison char t

圖6 頭痛滴丸醇滲漉提取和菊花鏡像圖Fig.6 Ethanol Percolation extraction of Tou tong DroPPing Pills and Chrysanthem i Flos com-Parison chart

2.5.3 不同工藝樣品特征峰的相對峰面積比較以相應(yīng)的對照藥材色譜圖為基準(zhǔn)，計算4個不同工藝樣品相應(yīng)特征峰的相對峰面積，如表2所示。

圖7 頭痛滴丸醇滲漉提取和鉤藤鏡像圖Fig.7 Ethanol Percolation extraction of Toutong DroPPing Pills and Uncaria rhynchophylla com Parison char t

2.5.4 數(shù)據(jù)分析 通過藥材歸屬和各工藝特征峰的相對峰面積的計算，得出工藝4樣品的特征色譜峰數(shù)目和相對峰面積均具有明顯優(yōu)勢。工藝3和工藝4的特征色譜峰為 16個。 疏風(fēng)止痛類藥材共歸屬了11個色譜峰， 其中工藝4樣品 9個峰的相對峰面積最大， 2個峰的相對峰面積略小于工藝3。清熱平肝熄風(fēng)類藥材共歸屬了 12個色譜峰， 其中工藝4樣品8個峰的相對峰面積最大，2個峰的相對峰面積略小于工藝3， 另2個峰的相對峰面積略小于工藝 1。溫經(jīng)散寒類藥材共歸屬了 4個色譜峰，其中工藝4樣品3個峰的相對峰面積最大，1個峰的相對峰面積略小于工藝一。

圖8 頭痛滴丸醇滲漉提取和細(xì)辛鏡像圖Fig.8 Ethanol Percolation extraction of Toutong DroPPing Pills and Asari Herba com Parison chart

表1 色譜峰的藥材歸屬Tab.1 ChromatograPhic Peaks belonging to herbs

表2 不同提取方法樣品色譜峰相對峰面積比較Tab.2 Relative Peak areas of different sam Ples

續(xù)表2

3 結(jié)論與討論

3.1 在中藥復(fù)方提取工藝的篩選過程中， 目前多以干浸膏得率、單體含有量和化學(xué)部位含有量為指標(biāo)評價不同工藝的優(yōu)劣，此種方法不能較全面地表征出中藥復(fù)方的全貌，具有一定局限性。指紋圖譜技術(shù)是目前公認(rèn)的能較全面反映中藥整體化學(xué)特征的手段［9］。 本實驗建立了頭痛滴丸方不同提取工藝的指紋圖譜，測定了復(fù)方提取液的高效液相色譜（HPLC） 指紋圖譜數(shù)據(jù)， 并結(jié)合功效類別對其進(jìn)行信息提取和統(tǒng)計，較之于以往可以更全面地掌握復(fù)方多成分的信息。

3.2 本實驗的復(fù)方化學(xué)成分較多，各特征峰吸收波長不一致， 通過DAD檢測器， 進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 282 nm下色譜峰信息較全面， 故確定檢測波長為 282 nm。

3.3 根據(jù)復(fù)方中各藥材的化學(xué)成分及其藥理作用，初步擬定了4種不同的提取工藝，建立了不同提取工藝的 HPLC圖譜， 之后進(jìn)行了藥材歸屬。 通過圖譜可知，醇滲漉提取和醇回流提取工藝的特征色譜峰多于傳統(tǒng)水煎和水回流提取工藝，醇滲漉提取工藝的特征色譜峰數(shù)目和相對峰面積明顯優(yōu)于其他工藝，故初步確定醇滲漉提取工藝為最佳提取工藝，為后期的制劑工藝和藥效學(xué)實驗研究奠定了基礎(chǔ)。

3.4 雖然此化學(xué)成分指紋圖譜可以提供較為豐富的中藥提取物信息，但本實驗采用紫外檢測器，只能提供提取液中具有紫外吸收的成分的相對含量信息，且色譜峰所對應(yīng)成分的藥效作用尚不完全清楚，今后有待于建立藥液的液質(zhì)聯(lián)用指紋圖譜，借助質(zhì)譜等更加靈敏、通用的檢測系統(tǒng)，進(jìn)行全成分的高效分析、檢測，提高中藥復(fù)方的提取效率，為制劑的前處理提供更多的理論依據(jù)。

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Com Parison of fingerPrints of different extraction Processes of Toutong DroPPing Pills

LIU Yue1，2，3， GONG Su-xiao2，3， ZHANG Tie-jun2，3， WANG Si-lu1，2，3， HU Qiao1，2，3
（1.Tianjin University of Traditional ChineseMedicine， Tianjin 300073， China； 2.Tianjin Instituteof Pharmaceutical Research， State Key Laboratory of Drug Delivery Technologies and Drug Metabolism， Tianjin 300193， China； 3.Tianjin Instituteof Pharmaceutical Research， The National and Local Engineering Laboratory of the Modernized Chinese Medicine and Chinese Medicine Quality Control Techniques， Tianjin 300193， China）

Toutong Dropping Pills； chemical constituent；chromatographic fingerprint； extraction process

R284.2

： A

： 1001-1528（2014）01-0085-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.021

2013-03-14

劉 悅 （1987—） ， 女， 碩士生， 研究方向： 中藥制劑。 Tel： 15822365678， E-mail： ldkmeng@sina.com

*通信作者： 張鐵軍 Tel： （022） 23006848