五子衍宗丸對(duì) ATRA誘導(dǎo)的神經(jīng)管畸形防治作用初探

樊慧杰， 柴 智， 解 軍， 王永輝， 周 然*

（1.山西中醫(yī)學(xué)院， 山西 太原 030024； 2.山西醫(yī)科大學(xué)， 山西 太原 030001）

五子衍宗丸對(duì) ATRA誘導(dǎo)的神經(jīng)管畸形防治作用初探

樊慧杰1， 柴 智1， 解 軍2， 王永輝1， 周 然1*

（1.山西中醫(yī)學(xué)院， 山西 太原 030024； 2.山西醫(yī)科大學(xué)， 山西 太原 030001）

目的 初步研究五子衍 宗 丸 對(duì) 全 反 式 維 甲 酸 （ all-trans-retinoic acid， ATRA） 誘 導(dǎo) 的 神經(jīng)管畸形 （ neural tube defects， NTDs） 的防治作用， 并篩選出五子衍宗丸防治 NTDs的最佳給藥方式。 方法 BALB/c雄鼠和雌鼠以 1 ∶2 比例合籠， 有陰栓者為孕鼠。 將 110 只孕鼠隨機(jī)分為正常組、 模型組、 五子衍宗丸先給組、 五子衍宗丸和 ATRA同時(shí)干預(yù)組、 五子衍宗丸后給組， 后 3 組又各分為五子衍宗丸高 （4.20 g/kg）、 中 （2.10 g/kg）、 低 （1.05 g/kg） 劑量 3 個(gè)亞組。 孕11 d時(shí)處死各組孕鼠， 解剖取出子宮， 顯微鏡下分離胚胎， 光鏡鑒定神經(jīng)管畸形， 計(jì)算發(fā)生率。 結(jié)果 與正常組比較， 除五子衍宗丸高劑量先給組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P ＞0.05）， 其余各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜0.05）。與模型組比較， 五子衍宗丸中、 高劑量先給組， 五子衍宗丸中、 高劑量和 ATRA同時(shí)干預(yù)組神經(jīng)管畸形發(fā)生率顯著降低， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）； 但是五子衍宗丸中、 高劑量后給組和五子衍宗丸低劑量各組神經(jīng)管畸形發(fā)生率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。 分別與五子衍宗丸中、 高劑量和 ATRA同時(shí)干預(yù)組比較， 五子衍宗丸中、 高劑量先給組神經(jīng)管畸形發(fā)生率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。 分別與五子衍宗丸中劑量先給、 同時(shí)給予組比較， 五子衍宗丸高劑量先給、 同時(shí)給予組神經(jīng)管畸形發(fā)生率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。 結(jié)論 五子衍宗丸對(duì) ATRA誘導(dǎo)的神經(jīng)管畸形有防治作用； 本實(shí)驗(yàn)中 4.20 g/kg五子衍宗丸預(yù)先給藥是防治神經(jīng)管畸形的最佳給藥方式。

五子衍宗丸；神經(jīng)管畸形；腎主生殖

神經(jīng)管畸形是一種影響腦和脊髓的先天性新生兒出生缺陷［1］， 表現(xiàn)為無(wú)腦畸形、 腦積水和脊柱裂等［2］。 我國(guó)北方是神經(jīng)管畸形的高危地區(qū)， 發(fā)病率為 5.57 ‰， 是世界平均發(fā)病率的 10 倍［3-5］。 神經(jīng)管畸形 病因復(fù) 雜， 環(huán)境因素和遺傳因素均可引發(fā)神經(jīng)管畸形。目前只通過(guò)口服葉酸未能完全阻斷神經(jīng)管畸形的發(fā)生。來(lái)源于父母的先天之精構(gòu)成胚胎， 若 “腎精不足” 則可致先天性發(fā)育異常。 五子衍宗丸為 《攝生眾妙方》 中的補(bǔ)腎方劑， 方中各藥共發(fā)揮補(bǔ)腎益精之效。 本研究給孕鼠灌胃全反式維甲酸 （ATRA） 建立小鼠神經(jīng)管畸形模型，分別在模型建立前、同時(shí)、后給予補(bǔ)腎方劑五子衍宗丸對(duì)孕鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察五子衍宗丸對(duì)神經(jīng)管畸形的防治作用，篩選出五子衍宗丸防治神經(jīng)管畸形的最佳劑量和最佳給藥時(shí)間。

1 材料

1.1 動(dòng)物 健康成年 BALB/c小鼠， 雌雄比例為 2 ∶1， 體質(zhì)量 （23 ±2） g， 由北京華阜康生物科技股份有限公司提供， 動(dòng)物合格證號(hào) SCXK （京） 2009-0004。 飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好， 自由攝取水食， 按晝夜節(jié)律自然照明、 室溫 （22 ± 2） ℃、 濕度 45% ～55%。

1.2 藥物和試劑 五子衍宗丸 （由枸杞子、 菟絲子、 覆盆子、五味子、車(chē)前子組成）由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠生產(chǎn) （批號(hào) 2035248）， 用蒸餾水將成藥配制為混懸液， 給予小鼠灌胃的高、 中、 低劑量分別是 4.20、2.10、 1.05 g/kg（劑量按體表面積折算， 分別相當(dāng)于成人臨床推薦日用量的 2 倍、 1 倍、 0.5 倍）。 ATRA購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.3 儀器 BS224S 型萬(wàn)分之一電子天平 （德國(guó)賽多利斯集團(tuán)）； KQ-300VDE超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）； SMZ-168 體視顯微鏡 （麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）。

2 方法

2.1 建立神經(jīng)管畸形胎鼠模型 BALB/c雄鼠和雌鼠 1 ∶2比例于中午12時(shí)合籠， 次日早上8時(shí)分籠并檢查陰栓， 有陰栓者為孕鼠。 將發(fā)現(xiàn)陰栓的當(dāng)天中午 12 時(shí)定為胚胎（embryo， E） 0.5 d。 用香油溶解 ATRA粉末， 按 50 mg/kg劑量灌胃干預(yù) E7d 孕鼠， 正常組灌服等體積的香油。 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)， 用 ATRA對(duì) E7d 孕鼠進(jìn)行干預(yù)， 胎鼠于E9.5d 開(kāi)始出現(xiàn)神經(jīng)管畸形， 且神經(jīng)管畸形發(fā)生進(jìn)程一直到 E11.5d （神經(jīng)管發(fā)育完成） 結(jié)束， 所以本實(shí)驗(yàn) 選取E11d 胎鼠進(jìn)行研究。 解剖 E11d 孕鼠取出胎鼠， 參照正常組，光鏡下觀察胎鼠神經(jīng)管的形態(tài)，鑒定神經(jīng)管畸形的發(fā)生［6］。

2.2 分組及給藥

2.2.1 分組 ①正常組、 ②模型組、 ③五子衍宗丸先給組、 ④五子衍宗丸和 ATRA同時(shí)干預(yù)組、 ⑤五子衍宗丸后給組。③、④、⑤組又分別按照五子衍宗丸高、中、低劑量的不同分為3個(gè)亞組。 每組10只孕鼠， 以其胎鼠為研究對(duì)象。

2.2.2 給藥 模型組孕鼠分別在 E4d、 E5d、 E6d 灌胃給予蒸餾水， 每天 1 次， 連續(xù) 3 d， E7d 一次性灌胃給予孕鼠ATRA， 在 E8d、 E9d、 E10d 灌胃給予蒸餾水， 每天 1 次，連續(xù)3 d。 五子衍宗丸先給組的3個(gè)亞組按五子衍宗丸高、中、 低劑量在 E4d、 E5d、 E6d 灌胃給予孕鼠， 每天 1 次，連續(xù) 3 d， E7d 一次性灌胃給予孕鼠 ATRA， 在 E8d、 E9d、E10d 灌胃給予蒸餾水， 每天 1 次， 連續(xù) 3 d。 五子衍宗丸和 ATRA同時(shí)干預(yù)組的 3 個(gè)亞組在 E4d、 E5d、 E6d 灌胃給予蒸餾水， 每天1次， 連續(xù)3 d， 按五子衍宗丸高、 中、 低劑量在 E7d 一次性灌胃給予孕鼠， 同時(shí)灌胃給予孕鼠 ATRA， 在 E8d、 E9d、 E10d 灌胃給予蒸餾水， 每天 1 次， 連續(xù) 3 d。 五子衍宗丸后給組的 3 個(gè)亞組在 E4d、 E5d、 E6d灌胃給予蒸餾水， 每天 1 次， 連續(xù) 3d， 在 E7d 一次性灌胃給予孕鼠 ATRA， 在 E8d、 E9d、 E10d 按五子衍宗丸高、中、 低劑量灌胃給予孕鼠， 每天1次， 連續(xù)3 d。 正常對(duì)照組孕鼠在 E4d ～E10d 時(shí)間段， 除 E7d 給予等體積香油外，其余時(shí)間給予等體積的蒸餾水，每天1次。灌胃體積均為20 mL/kg， 稱(chēng)重并根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量。

2.3 樣品制備及指標(biāo)檢測(cè) E11d 時(shí)頸椎脫臼法處死各組孕鼠，仰臥固定四肢于手術(shù)臺(tái)上。于腹中線(xiàn)剪開(kāi)皮膚和肌肉，暴露腹腔，可見(jiàn)子宮，剪斷子宮系膜，將成串子宮取出， 用 PBS 清洗后， 移入盛有 PBS 的玻璃培養(yǎng)皿中， 解剖顯微鏡下小心剝離胎盤(pán)和胎膜組織，取出胚胎，光鏡下鑒定神經(jīng)管畸形的發(fā)生情況，用神經(jīng)管畸形發(fā)生率 （每只孕鼠神 經(jīng) 管 畸 形 胎 鼠 數(shù)/每 只 孕 鼠 總 胎 鼠 數(shù) ×100%）表示［6］。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)， 所得結(jié)果 用表 示。 應(yīng) 用 單 因 素 方 差 分 析 （ one-way ANOVA） 比較各組間均數(shù)。 P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 神經(jīng)管畸形胎鼠模型的形態(tài)學(xué)鑒定 正常組孕鼠的胚胎數(shù)為7 ～15 個(gè)， 母鼠子宮無(wú)充血， 吸收胎少見(jiàn)， 解剖顯微鏡下可見(jiàn)多為活胎、偶有死胎、無(wú)畸形胎，活胎外形完整圓潤(rùn)飽滿(mǎn)、腦泡閉合完全、脊柱表面無(wú)可見(jiàn)裂口、神經(jīng)管正常閉合。模型組孕鼠子宮有充血瘀血現(xiàn)象，吸收胎多見(jiàn)，解剖顯微鏡下可見(jiàn)活胎發(fā)育遲緩、死胎增多、有神經(jīng)管畸形胎，神經(jīng)管畸形胎外觀瘦小、形態(tài)崎嶇各異、不完整，可見(jiàn)無(wú)腦、脊柱裂、甚有整個(gè)神經(jīng)管未閉合的現(xiàn)象。造神經(jīng)管畸形胎鼠模型成功。

3.2 五子衍宗丸對(duì)胎鼠神經(jīng)管畸形的干預(yù)結(jié)果 與正常組比較，除五子衍宗丸高劑量先給組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）， 其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。與模型組比較，五子衍宗丸中、高劑量先給組，五子衍宗丸中、 高劑量和 ATRA同時(shí)干預(yù)組胎鼠神經(jīng)管畸形發(fā)生率明顯降低， 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）； 但是五子衍宗丸中、高劑量后給組和五子衍宗丸低劑量組 （先給、同時(shí)、 后給） 神經(jīng)管畸形發(fā)生率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。 將對(duì)神經(jīng)管畸形有防治作用的 4 組進(jìn)行劑量之間、給藥時(shí)間之間的比較；分別與五子衍宗丸中、高劑量和ATRA同時(shí)干預(yù)組比較， 五子衍宗丸中、 高劑量先給組胎鼠神經(jīng)管畸形的發(fā)生率有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 分別與五子衍宗丸中劑量先給、 同時(shí)給予組比較，五子衍宗丸高劑量先給、同時(shí)給予組胎鼠神經(jīng)管畸形的發(fā)生率有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＞0.05）。 見(jiàn)表 1。

表1 五子衍宗丸對(duì)胎鼠神經(jīng)管畸形發(fā)生率的影響 （，n=10）

表1 五子衍宗丸對(duì)胎鼠神經(jīng)管畸形發(fā)生率的影響 （，n=10）

注： 與模型組比較，*P＜0.05； 與正常組比較，▲P＜0.05

組別 劑量/（ g·kg-1）神經(jīng)管畸形發(fā)生率/%正常組-0模型組 - 54.00 ±15.06▲五子衍宗丸高劑量先給組 4.20 9.00 ±3.16*五子衍宗丸中劑量先給組 2.10 19.00 ±7.38*▲五子衍宗丸低劑量先給組 1.05 47.00 ±12.52▲五子衍宗丸高劑量和 ATRA同時(shí)干預(yù)組4.20 16.00 ±6.99*▲五子衍宗丸中劑量和 ATRA同時(shí)干預(yù)組2.10 24.00 ±7.01*▲五子衍宗丸低劑量和 ATRA同時(shí)干預(yù)組1.05 52.00 ±14.76▲五子衍宗丸高劑量后給組 4.20 44.00 ±9.66▲五子衍宗丸中劑量后給組 2.10 51.00 ±11.97▲五子衍宗丸低劑量后給組 1.05 52.00 ±13.17▲

4 討論

精包括 “先天之精” 和 “后天之精”［7］。 《醫(yī)宗金鑒·卷二十六·刪補(bǔ)名醫(yī)方論卷一》云： “先身而生， 謂之先天”， 以及張錫純所言 “以未生為先天， 已生為后天者”，則 “出生” 是 “ 先天” 和 “后天” 的分界線(xiàn)［8］。 子代先天之精受于父母生殖之精，是構(gòu)成胚胎的原始物質(zhì)；后天之精則是由自己臟腑所化生，是水谷之精微。有學(xué)者提出，“先天之精” 指的是遺傳信息的內(nèi)容和遺傳信息讀取全過(guò)程即中心法則，而遺傳信息的化學(xué)存在方式和遺傳信息讀取過(guò)程的化學(xué)存在方式是腎臟的 “后天之精”； “先天之精” 和 “后天之精” 的關(guān)系是過(guò)程和實(shí)體、 信息和物質(zhì)的關(guān)系［9］。 顯然 “ 先 天之精” 是 決定人 生 長(zhǎng) 發(fā) 育 的 基 礎(chǔ)。《靈樞·經(jīng)脈》曰： “人始生， 先成精， 精成而腦髓生……”，說(shuō)明先天稟受的父母之精化生腦髓。若先天稟賦不足，髓海失充，元神失養(yǎng)，可導(dǎo)致大腦先天發(fā)育異常。神經(jīng)管畸形是先天性發(fā)育異常的疾病，腦積水、學(xué)習(xí)障礙、腿部癱瘓、大小便失禁等臨床表現(xiàn)與中醫(yī)所言 “腎精不足”內(nèi)涵密切相關(guān)。所以，神經(jīng)管畸形屬于中醫(yī)先天稟賦不足之范疇，腎精虧損為其主要原因。五子衍宗丸中菟絲子溫腎益精，枸杞子滋腎填精，兩藥相合陰陽(yáng)并補(bǔ)，共為君藥；五味子益氣補(bǔ)虛強(qiáng)陰澀精，覆盆子溫腎而不燥固精而不凝，共為臣藥；車(chē)前子澀中兼通，補(bǔ)而不滯，用為佐藥［10］。 全方共奏補(bǔ)腎益精之功， 理論上恰可對(duì)證神經(jīng)管畸形胎兒的先天稟賦不足之源。

本實(shí)驗(yàn)用五子衍宗丸對(duì)孕鼠進(jìn)行不同時(shí)期的干預(yù)，在E11d 時(shí)解剖孕鼠鑒定神經(jīng)管畸形的發(fā)生情況。 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)神經(jīng)管畸形有防治作用的4組分別是五子衍宗丸高劑量先給組、五子衍宗丸中劑量先給組、五子衍宗丸高劑量和ATRA同時(shí)干預(yù)組、 五子衍宗丸中劑量和 ATRA同時(shí)干預(yù)組；低劑量組和五子衍宗丸后給組均無(wú)防治作用；結(jié)合各干預(yù)組與正常組的比較結(jié)果， 顯示出高劑量4.20 g/kg的五子衍宗丸預(yù)先給藥是防治神經(jīng)管畸形的最佳給藥方式。本實(shí)驗(yàn)為后續(xù)的五子衍宗丸干預(yù)神經(jīng)管畸形的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為臨床防治神經(jīng)管畸形提供了一種新的思路。

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R285.5

： B

： 1001-1528（2014）05-1054-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.038

2013-07-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81102552）

樊慧杰 （1978—）， 女， 博士， 講師， 研究方向： 中藥分子生物學(xué)。 Tel： （0351） 2272378， E-mail： fanhuijie.happy@163.com

*通信作者： 周 然 （1958—） ， 男， 博士， 教授， 博士生導(dǎo)師， 研究方向： 方劑效用及其物質(zhì)基礎(chǔ)。 Tel： （0351 ） 2272390， E-mail：zhour58@sohu.com

日期： 2013-09-04

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