小鼠淋巴瘤 tk 基因突變?cè)囼?yàn)檢測(cè)雄黃的致突變性

商慶華， 黃盼華， 吳文斌， 湯家銘*

（1.上海基賽生物醫(yī)藥科技有限公司， 上海 201203； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 上海 201203）

小鼠淋巴瘤 tk 基因突變?cè)囼?yàn)檢測(cè)雄黃的致突變性

商慶華1， 黃盼華1， 吳文斌2， 湯家銘2*

（1.上?；惿镝t(yī)藥科技有限公司， 上海 201203； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 上海 201203）

目的 用小鼠淋巴瘤 tk基因突變?cè)囼?yàn)檢測(cè)雄黃浸出液的致突變性。 方法 在加或不加 S9 （萃巴比妥鈉 +β萘黃酮誘導(dǎo)鼠肝勻漿上清液） 條件下， 用不同質(zhì)量濃度雄黃浸出液可溶性砷處理小鼠淋巴瘤 L5178Y細(xì)胞， 采用微孔板法進(jìn)行細(xì)胞毒、平板接種效率和突變頻率測(cè)定，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果 非活化條件下用雄黃浸出液處理3 h和24 h后， 隨著浸出液可溶性砷質(zhì)量濃度的增加， 小鼠淋巴瘤細(xì)胞的平板效率 （PE0和 PE2）、 相對(duì)存活率 （RS0）、 相對(duì)懸浮生長(zhǎng) （RSG）、 相對(duì)總生長(zhǎng)率 （RTG） 逐漸下降， 24 h 作用后最高劑量 3.0 μg/mL的 RS0僅為 6.72%、 RSG僅為 3.94%、 RTG僅為 0.34%， 表明雄黃對(duì)小鼠淋巴瘤細(xì)胞有明顯的毒性， 且作用時(shí)間長(zhǎng)細(xì)胞毒性更明顯。 隨著浸出液可溶性砷質(zhì)量濃度的上升， 抗性突變頻率 （MF） 呈現(xiàn)上升趨勢(shì)， 表明雄黃具有致突變性。 延長(zhǎng)處理時(shí)間， 雄黃的致突變性增強(qiáng)。 活化條件下小鼠淋巴瘤細(xì)胞的 PE0、 PE2、 RS0、 RSG、 RTG和 MF的變化與非活化條件下結(jié)果相似，表明浸出液可溶性砷的毒性和致突變性不依賴于 S9 的活化。 結(jié)論 雄黃浸出液可溶性砷對(duì)小鼠淋巴瘤 L5178Y細(xì)胞具有致突變性。

小鼠淋巴瘤 L5178Y細(xì)胞； tk基因突變； 雄黃； 可溶性砷； 致突變

小鼠淋巴瘤細(xì)胞 tk基因突變?cè)囼?yàn) （mouse lymphoma tk genemutation assay，MLA）是一種體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞遺傳毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)方法，已被廣泛用于檢測(cè)藥物和化合物的遺傳毒性，被認(rèn)為是最敏感的體外致突變?cè)囼?yàn)之 一［1-4］。該方法不但可檢 出點(diǎn)突變、染色體畸變和重組等，而且還可檢出非整倍體誘導(dǎo)劑等依賴于細(xì)胞周期的突變劑，因此早已被藥品注冊(cè)審批國(guó)際協(xié)調(diào)組織 （ICH） 推薦的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)系列組成 部分［5］。 在 ICH最新版的 《指導(dǎo)原則》中， MLA被認(rèn)為可以替代體外 CHL細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)或體外微核試驗(yàn)，與其他遺傳毒性試驗(yàn)組合使用。特別是當(dāng)受試物為抗生素時(shí)，抗生素的抑菌作用影響 Ames試驗(yàn)的判斷，需要增加 MLA進(jìn)行檢測(cè)［6］。

雄黃是一味常用的礦物類中藥，主含二硫化二砷，具有抗菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)痙、止痛和殺蟲(chóng)等功效， 在2010 年版的 《中華人民共和國(guó)藥典》 收錄的中成藥中有 24 種含雄黃，占全部中成藥的4.6%［7］。為了全 面 評(píng) 價(jià)雄 黃 的 遺 傳 毒 性， 采 用ICH和我國(guó) 《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》［8］推薦的多種遺傳毒性試驗(yàn)方法進(jìn)行了研究。現(xiàn)將其中用 MLA檢測(cè)雄黃的致突變性試驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料

1.1 受 試 物 雄 黃 浸 出 液， 將 批 號(hào) 為H2007052401 的雄黃 （產(chǎn)自湖南石門(mén)雄黃礦業(yè)）1.0 g溶于10mL的平衡鹽溶液 （HBSS）中形成混懸液， 37 ℃水浴搖床以 100 r/min 水浴震蕩 4 h 后靜止20 h， 取上清液過(guò)濾后制成雄黃浸出液， 經(jīng)上海市食品藥品檢驗(yàn)所測(cè)定可溶性砷質(zhì)量濃度為1.20 mg/mL，冷藏保存?zhèn)溆谩?陽(yáng)性對(duì)照甲基磺酸甲 酯 （ MMS， sigma， 批 號(hào) 78697 ） 、 環(huán) 磷 酰 胺（CP， 江蘇恒瑞）， 選擇突變劑三氟胸苷 （TFT，sigma， 批號(hào) T2255）

1.2 細(xì)胞 小鼠淋巴瘤 L5178Y tk+/-，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。

1.3 培養(yǎng)基和試劑 RPMI1640 培養(yǎng)基、 馬血清、雙抗 （GIBCO公 司）、 丙 酮 酸 鈉 （ sigma公 司），NaHCO3、胸腺嘧啶脫氧核苷、 次黃嘌呤、 甘氨酸（均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司） 和甲氨喋呤（sigma公司） 組成的 THMG和 THG培養(yǎng)液。

1.4 代謝活化劑 S9 由苯巴比妥鈉與 β-萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)大鼠，取肝勻漿后離心獲得上清，臨用前S9 與 180 mg/mL的 6-磷酸葡萄糖、 25 mg/m L的NADP、 150 mmol/L的 KCl以體積比 2 ∶1 ∶1 配制成 S9 混合液，S9 混合液終體積分?jǐn)?shù)為 2%。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取清除自發(fā)突變細(xì)胞后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 細(xì) 胞， 以 2 ×105個(gè)/mL的 密 度 在 THMG（0.1 μg/mL甲氨喋呤、3 μg/mL胸腺嘧啶脫氧核苷、 5 μg/mL次黃嘌呤和 7.5 μg/mL甘氨酸） 培養(yǎng)液中培養(yǎng) 1 d， 條件為 37 ℃、 5%CO2、 飽和濕度。 1 000 r/min， 10 min 離心細(xì)胞， 棄去上清， 用RPMI 1640 培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞， 轉(zhuǎn)入 THG （3 μg/mL胸 腺 嘧 啶 脫 氧 核 苷、5 μg/mL次 黃 嘌 呤 和7.5 μg/mL甘氨酸） 培養(yǎng)基中， 培養(yǎng) 2 d， 每日計(jì)數(shù)細(xì)胞， 并調(diào)整細(xì)胞密度為 2 ×105個(gè)/m L。

2.2 細(xì)胞的受試物暴露 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞調(diào)整密度為 5 ×105個(gè)/mL， 按 1%體積加入受試物使雄黃浸出液可溶性砷終質(zhì)量濃 度為 0.75、 1.5、3.0、 6.0 μg/mL， 同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照 組 （-S9：3 h， 10 μg/mL MMS， 24 h， 5 μg/mLMMS； +S9：3 μg/mL CP）， 37 ℃震搖處理3/24 h， 離心， 棄上清液， 用 RPMI1640 培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞 2 遍， 重新懸浮細(xì)胞于含 10%馬血清的RPMI1640 培 養(yǎng) 液 中， 并 調(diào) 整 細(xì) 胞 密 度 為 2 × 105個(gè)/mL。

2.3 0 天平板接種效率 PE0測(cè)定 取適量細(xì)胞懸液， 作梯度稀釋至 8 個(gè)細(xì)胞 /mL， 接種 96 孔板（每孔加 200 μL， 即平均 1.6 個(gè)細(xì)胞/孔）， 每個(gè)劑量做2塊板， 陰性及陽(yáng)性對(duì)照做 4 塊板， 37 ℃，5%CO2， 飽和濕度條件下培養(yǎng) 12 d， 計(jì)數(shù)每塊平板有集落生長(zhǎng)的孔數(shù)。

2.4 表達(dá)培養(yǎng) 將步驟 “2.2”項(xiàng)所得細(xì)胞懸液作2 d表達(dá)培養(yǎng)，每天計(jì)數(shù)細(xì)胞密度并保持密度在106個(gè) /m L以下。 計(jì)算相對(duì)懸浮生長(zhǎng) （ Relative Suspension Growth， RSG） 。

2.5 第2 天平板接種效率 PE2測(cè)定 2 d 表達(dá)培養(yǎng)結(jié)束后， 取適量細(xì)胞懸液， 按步驟 “2.3”項(xiàng)作梯度稀釋并接種 96 孔板， 培養(yǎng) 12 d 后計(jì)數(shù)每塊平板有集落生長(zhǎng)的孔數(shù)。

2.6 TFT抗性突變頻率測(cè)定 2 d 表達(dá)培養(yǎng)結(jié)束后， 取適量細(xì)胞懸液， 調(diào)整細(xì)胞密度為 1 ×104個(gè)/m L， 加入 TFT（終質(zhì)量濃度為 3 μg/m L）， 混勻， 接種 96 孔板 （每孔加 200 μL， 即平均 2 000個(gè)細(xì)胞/孔）， 96 孔板四周各孔加 200 μL PBS，每個(gè)劑量做2塊板，陰性及陽(yáng)性對(duì)照做4塊板，于37 ℃， 5%CO2， 飽和濕度條件下培養(yǎng) 12 d， 計(jì)數(shù)有突變集落生長(zhǎng)的孔數(shù)。 突變集落按大集落 （LC：直徑 ≥ 1/4 孔 徑， 密 度 低） 和小 集 落 （SC： 直徑 ＜1/4 孔徑，密度高） 分別計(jì)數(shù)， 極小集落可再繼續(xù)培養(yǎng)3 d后計(jì)數(shù)。

2.7 結(jié)果計(jì)算和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2.7.1 平板效率 （ PE0和 PE2） PE={ ［ -ln（EW/TW）］ /1.6} ×100% 式中 EW 為無(wú)集落生長(zhǎng)的孔數(shù)； TW為總孔數(shù)； 1.6 為每孔接種細(xì)胞數(shù)。2.7.2 相對(duì)存活率 （RS） RS= ［PE（處理） / PE（對(duì)照）］ ×100%

2.7.3 相對(duì)懸浮生長(zhǎng)（RSG） RSG= （處理組表達(dá)期間細(xì)胞增殖倍數(shù)/對(duì)照組表達(dá)期間細(xì)胞增殖倍數(shù)） ×100%

2.7.4 相對(duì)總生長(zhǎng)率（RTG）RTG=RSG×RS2×100%， 式中 RSG為相對(duì)懸浮生長(zhǎng)， RS2為第二天的相對(duì)存活率。

2.7.5 TFT抗性突變頻率 （MF） MF（ ×10-6） =［ -ln（EW/TW）］ /2 000/PE2式中： EW 為無(wú)集落生長(zhǎng)的孔數(shù)； TW 為總孔數(shù)； 2 000 為每孔接種細(xì)胞數(shù)。

2.7.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用 IBM SPSSStatistics19 對(duì)突變頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，受試物各劑量組與陰性對(duì)照比較， P＜0.05 為具有顯著意義，P＜0.01 為具有極顯著意義。

3 結(jié)果

3.1 非活化條件下用雄黃浸出液 3 h/24 h 處理小鼠淋巴瘤 L5178Y細(xì)胞結(jié)果 表 1、 表 2 顯示， 非活化條件下 用 雄黃浸出液 處 理3 h 和24 h后， 隨著浸出液可溶性砷質(zhì)量濃度的增加，小鼠淋巴瘤細(xì)胞的 PE0、 PE2、 RS0、 RSG、 RTG逐 漸 下 降， 其 中3 h作用后浸出液可 溶 性砷質(zhì)量濃度在 3.0 μg/mL以上時(shí) PE0、 PE2均在 60%以下； 24 h 作用后雄黃浸出液可溶性砷質(zhì)量濃度在 0.75 μg/mL以上時(shí)PE0、 PE2均 在 60%以 下。 24 h 作 用 后 最 高 劑 量3.0 μg/mL的 RS0僅為 6.72%、 RSG僅為 3.94%、RTG僅為 0.34%，表明雄黃對(duì)小鼠淋巴瘤細(xì)胞有明顯的毒性，且作用時(shí)間長(zhǎng)細(xì)胞毒性更明顯。

表 1 -S9/3 h條件下 雄 黃浸出液 的 小鼠淋巴 瘤 tk 基因突 變 試驗(yàn)Tab.1 M ouse lym phoma tk genemutation assay by using realgar extract under the condition of 3 h co-culture w ithout S9

表 2 -S9/24 h條 件 下雄黃浸 出 液的小鼠 淋 巴瘤 tk 基 因 突變?cè)囼?yàn)Tab.2 M ouse lym phom a tk genemutation assay by using realgar extract under the condition of 24 h co-cultu re w ithout S9

隨著浸出液可溶性砷質(zhì)量濃度的上升，MF呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，表明雄黃具有致突變性。用雄黃浸出液處理3 h 后， 可溶性砷質(zhì)量濃度達(dá)到3 μg/mL以上時(shí)，各劑量組與陰性對(duì)照比較，差異有極顯著意義（P＜0.01）；處理 24 h 后，可溶性砷質(zhì) 量濃度達(dá)到0.75 μg/mL以上時(shí)，各劑量組與陰性對(duì)照比較，差異有極顯著意義 （P＜0.01）， 說(shuō)明延長(zhǎng)處理時(shí)間，雄黃的致突變性增強(qiáng)。3.2 活化條件下用雄黃浸出液 3 h 處 理小鼠淋巴瘤 L5178Y細(xì)胞結(jié)果表3顯示， 在活化條件下用雄黃浸出液處理3 h后， 隨著浸出液可溶性砷質(zhì)量濃度的增加，小鼠淋巴瘤細(xì)胞的 PE0、 PE2、 RS0、RSG、 RTG逐漸下降，與非活化條件下的結(jié)果相似，表明雄黃可溶性砷對(duì)小鼠淋巴瘤細(xì)胞的毒性不依賴于S9的活化。

表 3 +S9/3 h條件下 雄 黃浸出液 的 小鼠淋巴 瘤 tk 基因突 變 試驗(yàn)Tab.3 M ouse lymphoma tk genemutation assay by using realgar extract under the condition of 3 h co-culture with S9

隨著浸出液可溶性砷質(zhì)量濃度的上升， MF亦呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但與非活化條件下相比，同一劑量的MF并沒(méi)有明顯上升，說(shuō)明雄黃的致突變性亦不依賴于S9的活化。

4 討論

MLA是用于檢測(cè)藥物或化合物致突變?cè)囼?yàn)方法， 被 ICH推薦為藥物遺傳毒性評(píng)價(jià)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外試驗(yàn)之一［6］。 我國(guó)在食品、保健食品、藥品、化妝品等安全性評(píng)價(jià)領(lǐng)域也將此試驗(yàn)列入推薦方法之一［9］。 特別是對(duì)一些抗生素類藥物或本身具有抗菌、抑菌作用的中藥、天然藥物進(jìn)行致突變性評(píng)價(jià)時(shí)， Ames試驗(yàn)所用的各鼠傷寒沙門(mén)氏菌株會(huì)受到受試物的抑制而無(wú)法獲得可靠的結(jié)果，此時(shí)應(yīng)用MLA就具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。 本課題組在研究中藥雄黃的遺傳毒性， 用 Ames試驗(yàn)時(shí)就發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象， 因而增加 MLA檢測(cè)方法， 從致突變性方面評(píng)價(jià)其遺傳毒性。

在先前的研究中已經(jīng)證實(shí)雄黃的毒性存在于可溶性砷部分［10］， 因而可直接用雄黃浸出液作為供試品進(jìn)行研究。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道， MLA可采用短期處理 （3 h） 和長(zhǎng)期處理 （24 h） 結(jié)合的方法， 以提高檢測(cè)的敏感性， 檢出短 期 處 理呈 陰 性 的某 些 化 學(xué) 物［11-13］。 本研究分別采用短期 （3 h） 和長(zhǎng)期 （24 h） 處理、有或無(wú)代謝活化系統(tǒng) （S9） 處理評(píng)價(jià)雄黃的致突變性。

本次試驗(yàn)中， 無(wú)論是有或無(wú) S9， 3 h 或 24 h，小鼠淋巴瘤細(xì)胞的 PE0、 PE2、 RS0、 RSG、 RTG隨著可溶性砷的質(zhì)量濃度升高而逐漸下降，最高質(zhì)量濃度時(shí)這些指標(biāo)均在 20%以下， 表明可溶性砷對(duì)細(xì)胞的毒性較大，這與此前的研究中發(fā)現(xiàn)可溶性砷對(duì) CHL細(xì)胞毒性較大［14］相一致。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著雄黃浸出液可溶性砷濃度增大， 小鼠淋巴瘤細(xì)胞 tk基因的突變頻率有升高的趨勢(shì)。

在非活化條件下3 h處理后，可溶性砷終質(zhì)量濃度為 3.0 μg/mL以上時(shí)， 即對(duì)淋巴瘤細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的誘變性，其 MF為陰性對(duì)照的4倍以上。24 h 處理后， 可溶性砷終質(zhì)量濃度降 至 0.75 μg/mL以上時(shí)， 亦可對(duì)淋巴瘤細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的誘變性， MF高于陰性對(duì)照 100 ×10-6以上； 當(dāng)可溶性砷終質(zhì)量濃度為 3.0 μg/mL以上時(shí)， 其 MF為陰性對(duì)照的6倍以上，表明可溶性砷與小鼠淋巴瘤細(xì)胞作用時(shí)間越長(zhǎng)，其毒性就越大。

在活化條件下3 h處理后，可溶性砷終質(zhì)量濃度為 1.5 μg/mL以上時(shí)， 即對(duì)淋巴瘤細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的誘變性，其MF為陰性對(duì)照的2倍以上?？紤]到在活化條件下的MF與同劑量下非活化條件下的MF并沒(méi)有明顯增大，另外可溶性砷是無(wú)機(jī)物，在體內(nèi)并不需要在肝臟代謝，因而認(rèn)為可溶性砷的致突變性可能是藥物直接對(duì)細(xì)胞作用的結(jié)果。

在先前的研究中，用小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)和彗星試驗(yàn)、 CHL細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)和倉(cāng)鼠體內(nèi)染色體畸變實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了雄黃具有較強(qiáng)的遺傳毒性［14-15］。 本次 實(shí) 驗(yàn)結(jié) 果 表 明， 雄 黃 浸出 液 對(duì) 小 鼠淋巴瘤 L5178Y細(xì)胞也具有致突變性。

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Detection ofmutagenicity of realgar by mouse lym phoma tk genemutation assay

SHANG Qing-hua1， HUANG Pan-hua1， WUWen-bin2， TANG Jia-ming2*
（1.Shanghai Gene-cell Biotech Co.， Ltd.， Shanghai201203， China； 2.Laboratory Animal Center， Shanghai University of TCM， Shanghai201203，China）

mouse lymphoma L5178Y cell； tk genemutation； realgar； soluble arsenic； mutagenicity

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）05-0917-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.05.007

2013-04-17

科技部重大新藥創(chuàng)制基金 （2009ZX09502-002）

商慶華 （1985—） ， 女， 碩士， 主要從事細(xì)胞藥理研究。 E-mail： shangqinghuajisai@163.com

*通信作者： 湯家銘 （1952—） ， 男， 研究員， 主要從事中藥毒理方面研究。 E-mail： tangjiaming@hotmail.com