Box-Behnken設(shè)計(jì)及正交設(shè)計(jì)優(yōu)選復(fù)方龍砂顆粒提取工藝

曾 銳， 任桂友， 王 爽， 瞿 燕， 盛 蓉

（1.西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院，四川成都610041；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都611137；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川成都 610075）

Box-Behnken設(shè)計(jì)及正交設(shè)計(jì)優(yōu)選復(fù)方龍砂顆粒提取工藝

曾 銳1， 任桂友1， 王 爽1， 瞿 燕2*， 盛 蓉3

（1.西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院，四川成都610041；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都611137；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，四川成都 610075）

目的 優(yōu)選復(fù)方龍砂顆粒的提取工藝。方法 采用響應(yīng)面法，以揮發(fā)油體積為響應(yīng)值，選取加水量、浸泡時(shí)間和蒸餾時(shí)間三個(gè)因素進(jìn)行中心組合試驗(yàn)優(yōu)化揮發(fā)油提取工藝；采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以黃芩苷量和干膏率二者的綜合評(píng)分值為指標(biāo)，對(duì)揮發(fā)油提取殘?jiān)c地龍等其余6味藥材合并后所進(jìn)行的提取工藝中的加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)進(jìn)行優(yōu)選。結(jié)果 揮發(fā)油提取最佳工藝為加10倍量水，浸泡36 min，蒸餾提取5.5 h；水提取最佳工藝為提取3次，每次加水10倍，提取1 h。結(jié)論 實(shí)驗(yàn)合理的利用了兩個(gè)設(shè)計(jì)方案的特點(diǎn)，所優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行。

Box-Behnken；復(fù)方龍砂顆粒；提取工藝；正交設(shè)計(jì)

復(fù)方龍砂顆粒原為中藥處方湯劑劑型，由地龍、砂仁、黃芩、蒼術(shù)等九味中藥組成，具有利尿通淋、活血祛毒的功效，臨床用于糖尿病合并高尿酸血癥的治療。因湯劑煎煮不便，服用量大，不適于現(xiàn)代用藥的需求，故將湯劑改為顆粒劑。

本處方中砂仁、蒼術(shù)等共三味藥材中含有揮發(fā)油成分，同屬芳香化濕藥，可用于濕盛困脾、脘痞腹脹等癥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明該類藥物揮發(fā)油多具有抗炎、止瀉、鎮(zhèn)痛作用，其中蒼術(shù)揮發(fā)油還具有利尿、降血糖作用，且揮發(fā)油利尿作用強(qiáng)于水煎液［1-3］。Box-Behnken［4-5］是一種可以評(píng)價(jià)指標(biāo)和因素之間非線性關(guān)系的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，且無(wú)需多次試驗(yàn)，故選用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)此三味含揮發(fā)油的藥物進(jìn)行提取，并以響應(yīng)面法優(yōu)選提取工藝。而黃芩中的主要成分黃芩苷具有改善糖尿病腎病及治療糖尿病慢性并發(fā)癥的作用［6-7］，因此另以黃芩苷轉(zhuǎn)移率及干膏率兩者綜合評(píng)分作為指標(biāo)，以加水量、提取時(shí)間和提取次數(shù)為影響因素，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選水提工藝，以期將該處方的提取工藝最優(yōu)化并保證臨床療效。

1 儀器與試藥

Waters 2695/2996型高效液相色譜儀 （包括真空脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱，2996 PDA檢測(cè)器，Empower化學(xué)工作站，美國(guó) Waters公司）；DiamonsilC18（2）（5 μm，150 mm×4.6 mm）色譜柱；電子天平 （沈陽(yáng)龍騰電子有限公司，ESJ200-4）；ZDHW型調(diào)溫電熱套 （北京）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海申生科技有限公司，SENCO-R系列）附帶恒溫水浴鍋 （上海申生科技有限公司，SENCO-R系列W201）；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

地龍、砂仁、黃芩、蒼術(shù)、黃連等九味藥材均購(gòu)于四川省新荷花中藥飲片股份有限公司，經(jīng)西南民族大學(xué)民族醫(yī)藥研究院劉圓教授鑒定。地龍為鉅蚓科參環(huán)毛蚓Pheretima aspergillum（E.perrier）干燥體，砂仁為姜科植物陽(yáng)春砂Amomum villosum Lour.的干燥成熟果實(shí)，黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，蒼術(shù)為菊科植物北蒼術(shù)Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.；黃芩苷對(duì)照品 （由中國(guó)生物制品鑒定所提供，批號(hào) （110715-201117）；乙醇 （95%）分析純；其他試劑均為色譜純。

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 提取工藝 將砂仁、蒼術(shù)等含有揮發(fā)油的藥材提取揮發(fā)油，殘?jiān)c地龍等其余六味藥材合并，加適量的水進(jìn)行提取，測(cè)定提取液中黃芩苷質(zhì)量濃度，計(jì)算黃芩苷量。

黃芩苷含有量=提取液中黃芩苷的質(zhì)量濃度×提取液體積/黃芩藥材的質(zhì)量

2.2 干膏率的測(cè)定 精密吸取各提取液50 mL，置已恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，按《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄 IX G干燥失重測(cè)定法測(cè)定，計(jì)算干膏率。

2.3 黃芩苷的測(cè)定方法

2.3.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水-磷酸 （47∶53∶0.2）為流動(dòng)相；柱溫為30℃；體積流量為1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。在選定色譜條件下，理論塔板數(shù)按黃芩苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 500，分離度＞1.5，陰性無(wú)干擾。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 取在60℃減壓干燥4 h的黃芩苷對(duì)照品，精密稱取黃芩苷對(duì)照品4.73 mg，置于5 mL量瓶中，加適量流動(dòng)相甲醇超聲處理10 min，放冷，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，精密量取1 mL溶液置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，置5 mL棕色量瓶中，加流動(dòng)相甲醇至刻度，搖勻，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積 （Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得回歸方程為y=30 282 891.806 7x+113 730.533 3，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9（n=6）。表明黃芩苷在56.9～682.8 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 供試品溶液的制備 精密量取提取液適量于量瓶中，加流動(dòng)相甲醇適量，超聲處理10 min，放冷，再加流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3.5 測(cè)定方法 分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算提取液中黃芩苷的含有量。

2.3.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取黃芩苷對(duì)照品溶液0.6 mL，置10 mL棕色量瓶中，加流動(dòng)相甲醇至刻度，搖勻，即得。按前述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積RSD為0.25%，表明儀器精密度良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取同一份供試品溶液10 μL，分別于0、1、2、4、6、8 h進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，測(cè)得峰面積RSD為0.33%，表明樣品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密量取6份供試品溶液10 μL，按前述色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算供試品中黃芩苷的量，結(jié)果RSD為0.88%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量供試品溶液6份，分別精密加入一定量的黃芩苷對(duì)照品，按上述供試品制備與測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算黃芩苷檢出量，結(jié)果測(cè)得黃芩苷平均回收率為100.13%，RSD為0.018%。

2.3.10 陰性對(duì)照試驗(yàn) 按處方比例，稱取除黃芩藥材外的其余各味藥材，分別加10倍水，煎煮3次，每次1 h，減壓濃縮至500 mL，按上述供試品溶液的制備方法制備陰性供試品溶液。按上述方法測(cè)定，結(jié)果表明，陰性對(duì)照溶液在黃芩苷相應(yīng)位置無(wú)吸收，處方中其他藥味對(duì)本測(cè)定無(wú)干擾。

2.4 揮發(fā)油提取工藝優(yōu)選

2.4.1 Box-Behnken設(shè)計(jì) 依照《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄X D揮發(fā)油測(cè)定法甲法提取揮發(fā)油。以揮發(fā)油體積為響應(yīng)值，加水量、浸泡時(shí)間及蒸餾時(shí)間為影響因素，通過(guò)Box-Behnken設(shè)計(jì)［8-11］進(jìn)行響應(yīng)面分析，優(yōu)化揮發(fā)油提取條件。各因素水平見表1。

2.4.2 響應(yīng)面法分析 實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果 （見表2、表3）經(jīng)Design Expert 8.0.5b軟件進(jìn)行多元回歸擬合及優(yōu)化，得到揮發(fā)油體積對(duì)加水量A、浸泡時(shí)間B和蒸餾時(shí)間C優(yōu)化后的二元回歸方程：

揮發(fā)油體積 =－4.550+1.12A－4.922×10－3B+0.088C+7.500×10－4AB－0.057A2－3.556×10－5B2－7.722×10－3C2

對(duì)該回歸模型進(jìn)行方差分析，從表3中可以看出，P＜0.000 1，表明響應(yīng)回歸模型達(dá)到了極顯著水平；失逆差＞0.05，不顯著；模型的修正系數(shù)R2=0.979 9，說(shuō)明模型擬合度良好；模型修正相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.964 2，說(shuō)明該方程較好的反應(yīng)了加水量，浸泡時(shí)間和蒸餾時(shí)間與揮發(fā)油體積的關(guān)系。

表2 揮發(fā)油提取響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

表3 回歸模型方差分

2.4.3 提取工藝預(yù)測(cè) 由Design Expert 8.0.5b軟件分析得出的響應(yīng)曲面及等高線圖 （見圖1）可知，加水量對(duì)揮發(fā)油體積影響最大。經(jīng)Design Expert軟件分析篩選，得到揮發(fā)油提取的最佳工藝條件為：加水量10.02倍，浸泡時(shí)間35.80 min，蒸餾時(shí)間為5.71 h，提取揮發(fā)油體積的預(yù)測(cè)值為1.19 mL?？紤]實(shí)際操作不便，故將實(shí)驗(yàn)條件改為加水量10倍，浸泡時(shí)間36 min，蒸餾時(shí)間5.5 h。

圖1 交互因素作用對(duì)揮發(fā)油體積影響的效應(yīng)面及等高線

2.4.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 按處方比例取豆蔻、砂仁和蒼術(shù)藥材，共3份，按優(yōu)選的工藝條件提取揮發(fā)油。3次試驗(yàn)揮發(fā)油體積分別為1.21、1.19、1.18 mL，RSD為1.28%，表明該工藝穩(wěn)定可行，重復(fù)性好。

2.5 水提工藝條件優(yōu)選

2.5.1 正交試驗(yàn) 采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)［12-15］，以加水量、提取時(shí)間、提取次數(shù)為考察因素，每個(gè)因素確定3個(gè)水平，選取正交表L9（34），以黃芩苷轉(zhuǎn)移率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)水提工藝進(jìn)行優(yōu)選，因素水平表見表4，結(jié)果見表5，方差分析見表6。

表4 正交試驗(yàn)因素水平

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 正交試驗(yàn)方差分析

結(jié)果分析：由表5直觀分析可知，影響本制劑提取效果的因素順序?yàn)椋杭逯蟠螖?shù)＞加水量＞煎煮時(shí)間，煎煮次數(shù)對(duì)提取效果影響最大。經(jīng)方差分析，煎煮次數(shù)對(duì)提取效果有極顯著影響，加水量和煎煮時(shí)間對(duì)提取無(wú)顯著影響，考慮工廠實(shí)際工作需要，故確定提取工藝為A2B3C2，即加10倍水，煎煮3次，每次1 h。

2.5.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 取處方量藥材，平行3份，按確定的最佳水提工藝進(jìn)行提取，見表7。結(jié)果顯示，驗(yàn)證試驗(yàn)的黃芩苷轉(zhuǎn)移率優(yōu)于正交試驗(yàn)中大部分試驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明確定的最佳水提工藝穩(wěn)定可行。

表7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 中藥成分復(fù)雜，多通過(guò)配伍組合或者配伍之后產(chǎn)生新的藥效成分進(jìn)而發(fā)揮治療效果，比較重視整體觀念。經(jīng)查閱相關(guān)資料得知，該處方中砂仁、蒼術(shù)等三味藥材的揮發(fā)油具有一定的抗炎、鎮(zhèn)痛、降血糖作用。因此，本實(shí)驗(yàn)將揮發(fā)油整體單獨(dú)選作考察指標(biāo)，以優(yōu)化提取工藝。同時(shí)黃芩藥材中的有效成分黃芩苷具有很好的治療糖尿病慢性并發(fā)癥的作用，且易溶于水，故以水為溶劑進(jìn)行提取，并采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化確保臨床療效。

3.2 Box-Behnken設(shè)計(jì)多用于確信試驗(yàn)因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)在非線性影響條件下因素與指標(biāo)之間的分析，與中心復(fù)合設(shè)計(jì)相比，其可不必連續(xù)進(jìn)行多次試驗(yàn)，且因素?cái)?shù)相同時(shí)，Box-Behnken要比中心復(fù)合設(shè)計(jì)試驗(yàn)組合數(shù)要少。本實(shí)驗(yàn)選擇該設(shè)計(jì)方法進(jìn)行揮發(fā)油提取工藝的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并通過(guò)擬合二元回歸方程，繪制響應(yīng)面與等高線圖，可直接得出影響因素的變化規(guī)律，清晰、準(zhǔn)確。另以正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法優(yōu)選水提工藝，在保證試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確的同時(shí)減少試驗(yàn)次數(shù)，節(jié)約成本，節(jié)省時(shí)間。

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國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃 （2012BAI27B07）；四川省科技廳科技支撐項(xiàng)目 （2011SZ0071，2011SZ0076）

曾 銳 （1976—）男，副教授，博士，主要從事藥物制劑及民族藥的研究。Tel：（028）85522315，E-mail：Mackzeng@gmail.com

*通信作者：瞿 燕，女，主要從事中藥新制劑與新劑型研究。Tel：（028）61800231，E-mail：quyan028@126.com