無機介孔材料在第三代電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用研究

張 玲，矯松林，張瀠之，范 蘊，張洪波，段紀東

（沈陽師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，沈陽 110034）

0 引 言

在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境保護、臨床檢驗以及食品工業(yè)等領(lǐng)域，為了監(jiān)控產(chǎn)品質(zhì)量，往往要求在很短的時間內(nèi)完成樣品檢測，有的甚至要求在線或活體內(nèi)直接檢測。生物傳感器作為直接或間接檢測生物分子、生理或生化過程相關(guān)參數(shù)的分析器件，由于具有靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)快、操作簡便、樣品需要量少、可微型化、價格低廉、可以實現(xiàn)連續(xù)在位檢測等特點，在生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、食品醫(yī)藥工業(yè)等領(lǐng)域展現(xiàn)出十分廣闊的應(yīng)用前景［1］。

生物傳感器（Biosensor）是以生物活性物質(zhì)（如酶，抗體，核酸，細胞等）為生物敏感基元，通過信號轉(zhuǎn)換器將生物化學(xué)信號轉(zhuǎn)化為相應(yīng)物理化學(xué)信號的裝置。其中以生物活性物質(zhì)為敏感基元，以電化學(xué)電極為信號轉(zhuǎn)換器，以電勢、電流或電容為特征檢測信號的生物傳感器稱為電化學(xué)生物傳感器（Electrochemical Biosensor），也稱為生物電極［2］。

根據(jù)媒介體的不同，電化學(xué)生物傳感器的發(fā)展可分為3個階段：第一代、第二代和第三代生物傳感器（部分1）。第一代生物傳感器（葡萄糖生物傳感器）是在1962年由Clark和Lyons首先發(fā)明的［3］。在這種生物傳感器中，氧氣作為媒介體來實現(xiàn)蛋白質(zhì)和電極間電子轉(zhuǎn)移。盡管第一代生物感應(yīng)器仍在商業(yè)中扮演重要角色，它們也有很多缺點，如：過電勢高，氧氣的干擾，制作過程復(fù)雜等。以人工合成的電活性小分子為電子媒介體的電化學(xué)生物傳感器稱為第二代電化學(xué)生物傳感器。具有檢測電勢低，受環(huán)境干擾小，可在復(fù)雜的有機、生化樣品中進行快速分析檢測等優(yōu)點，明顯克服了第一代的一些缺點。然而，電子媒介體促進氧化還原蛋白質(zhì)電子轉(zhuǎn)移的同時，還會發(fā)生各種各樣的副反應(yīng)以及存在污染檢測液等問題［4］。在第三代生物傳感器中，由于蛋白質(zhì)的直接電子轉(zhuǎn)移避免了電子媒介體的使用，從而為生物傳感器提供了更好的選擇性。首先，它們能夠在氧化還原蛋白質(zhì)本身的電勢值附近工作，因此產(chǎn)生的副反應(yīng)少；其次，一些蛋白質(zhì)和酶是底物的專屬催化劑，對底物具有更好的選擇性和更高的親和性。然而，在裸露電極表面，直接實現(xiàn)蛋白質(zhì)的直接電子轉(zhuǎn)移比較困難，這是由于氧化還原蛋白質(zhì)的分子很大，氧化還原中心被多肽鏈包圍，深埋在氧化還原蛋白中心，處于具有三維結(jié)構(gòu)的裂隙中且不易暴露，且這些裂隙具有高度的疏水性，因此很難接近電極表面，阻礙了其與電極間的電子轉(zhuǎn)移。實現(xiàn)氧化還原蛋白的直接電化學(xué)，要滿足以下條件：一是縮短氧化還原蛋白的活性中心與電極間的距離；二是保持氧化還原蛋白的生物活性，能夠催化底物［5］。

自從1977年Hill［6］和Kuwana［7］發(fā)表了使用電子促進劑4，4′－聯(lián)吡啶促進Cyt C的電化學(xué)反應(yīng)的報告后，近些年來關(guān)于第三代生物感應(yīng)器的研究得到了廣泛地發(fā)展。迄今為止，各種各樣的新型電極材料和多種蛋白質(zhì)已經(jīng)被應(yīng)用于第三代生物傳感器的研究。鑒于能夠?qū)崿F(xiàn)直接電子轉(zhuǎn)移的蛋白質(zhì)種類有限，新型材料的發(fā)現(xiàn)和使用為第三代生物傳感器的發(fā)展拓寬了道路。表面活性劑［8］，聚合物［9－10］，凝膠［11－12］以及無機材料［13－16］都被證明是蛋白質(zhì)很好的固載材料并可以促進氧化還原蛋白質(zhì)的直接電子轉(zhuǎn)移。相對于有機材料來說，無機材料因具有規(guī)整的結(jié)構(gòu)，可調(diào)節(jié)的孔結(jié)構(gòu)，很好的機械穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性等優(yōu)良性質(zhì)，而受到生物材料研究者的廣泛關(guān)注。

無機介孔材料因其納米孔道具有的小尺寸效應(yīng)、表面與界面效應(yīng)使其呈現(xiàn)出獨特性能。而且，一般生物大分子如蛋白質(zhì)、酶、核酸等，當它們的分子質(zhì)量在1～100萬時尺寸小于10nm，相對分子質(zhì)量在1 000萬左右的病毒其尺寸在30nm左右。有序無機介孔材料的孔徑可在2～50nm連續(xù)調(diào)節(jié)和無生理毒性的特點使其非常適用于酶、蛋白質(zhì)等的固定和分離。1996年Díaz和Balkus［17］發(fā)表了第一篇關(guān)于分子篩固載蛋白質(zhì)的文章，自此無機介孔材料應(yīng)用于固載蛋白質(zhì)的研究有了飛速的發(fā)展。目前，使用無機介孔材料固載蛋白質(zhì)已經(jīng)在生物分離和催化領(lǐng)域得到了深入研究。一系列蛋白質(zhì)和酶（例如血紅蛋白、過氧化氫酶和蛋白水解酶）已被用于制備多種生物－介孔雜化材料［14，18－19］。研究表明，盡管被固定酶的活性通常低于溶液中的酶，但被固定在介孔基底上的酶與溶液中的酶相比，往往具有更高的穩(wěn)定性。無機介孔材料在第三代電介孔材料的引入，為構(gòu)建新型、高效的生物傳感器體系提供了機會。

1 硅基介孔材料在第三代電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用

自20世紀90年代早期發(fā)現(xiàn)介孔結(jié)構(gòu)的硅基材料以來，多種不同的無機介孔材料均被發(fā)展用于固載蛋白質(zhì)，除了介孔硅材料［17，20］，還有介孔金屬氧化物［21］和介孔碳材料［22－23］。

介孔硅材料，尤其是有序介孔硅酸鹽，在蛋白質(zhì)固載領(lǐng)域的應(yīng)用最為廣泛。這是因為它們具有生物相容性，孔道規(guī)則有序，比表面積巨大等優(yōu)點。固載于介孔硅材料上的酶由于介孔的納米孔道的保護通常顯示出良好的穩(wěn)定性。

使用介孔硅固載蛋白質(zhì)在生物分離，生物催化等方面發(fā)揮了巨大的優(yōu)勢。然而，2000年，Washmon－Kriel才首次將介孔硅材料應(yīng)用于第三代生物傳感器的研究［24］。Washmon－Kriel研究了細胞色素C（Cyt.C）在有序介孔分子篩 MCM－48（2～4nm）和SBA－15（5～30nm）上的固載。實驗發(fā)現(xiàn)，在蛋白質(zhì)易變性的溶液中，固載于分子篩中的蛋白質(zhì)仍保持很好的生物活性和穩(wěn)定性，在接下來的幾個月的時間里，循環(huán)伏安結(jié)果表明固載后的Cyt.C仍保留著它的氧化還原活性。與石墨和Cyt.C混合壓片的樣品做對比，發(fā)現(xiàn)盡管固載于介孔硅上的Cyt.C表現(xiàn)出較弱的直接電子轉(zhuǎn)移信號，但固定后的Cyt.C的穩(wěn)定性是非常明顯的。也許受前期制備的介孔二氧化硅的孔徑較小等原因的影響，介孔硅在第三代生物傳感器中的應(yīng)用的研究非常有限。4年后，鞠熀先組才報道了使用六邊形有序介孔硅材料（HMS）固載系列氧化還原蛋白質(zhì)用于直接電化學(xué)的研究。在研究中使用的氧化還原蛋白質(zhì)包括：血紅蛋白（Hb）、肌蛋紅白（Mb）和辣根過氧化酶（HRP）［18－19］。HMS根據(jù)合成時使用的表面活性劑的不同，孔徑不同。其中，使用十八烷基胺（ODA）做表面活性劑得到的介孔HMS的孔徑為4.04nm，使用十二烷基胺（DDA）做表面活性劑得到的介孔孔徑為3.35nm。研究表明固載于HMS上的氧化還原蛋白質(zhì)均表現(xiàn)出了直接電子轉(zhuǎn)移性能。其中，在ODA－HMS上被固定的HRP比在DDA－HMS上表現(xiàn)出了更明顯的電化學(xué)響應(yīng)，研究者推斷是這種更顯著的電化學(xué)響應(yīng)是因為ODA－HMS具有更大的孔徑從而利于HRP吸附。在此基礎(chǔ)上，固載于HMS上的氧化還原蛋白質(zhì)還被應(yīng)用于過氧化氫和亞硝酸鹽的電化學(xué)催化研究。此外，固載于六邊形有序介孔硅材料（MCM－41）的葡萄糖氧化酶也表現(xiàn)出很好的直接電化學(xué)響應(yīng)［25］。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，近年來，具有大尺寸孔徑的介孔硅材料越來越受到人們的關(guān)注，因為大尺寸孔徑增加了對不同尺寸蛋白質(zhì)的選擇性，為后續(xù)介孔材料的化學(xué)修飾提供了更大的可利用空間，為增加介孔材料的功能性提供了可能性［26－28］。朱俊杰組使用SBA－15（直徑30nm）固載Hb獲得了Hb的直接電子轉(zhuǎn)移，并且實現(xiàn)了對過氧化氫的還原催化［29］。李景虹組選擇了具有雙孔徑分布的介孔硅（BMS）作為固載Hb的基底，它具有10～40nm的較大孔徑和2～3nm小孔孔徑。固載的Hb表現(xiàn)出很好的直接電化學(xué)響應(yīng)，并且與沒有BMS時相比，顯示了更好的電化學(xué)催化性能。研究者推斷這種高效的電化學(xué)催化性能可能是由于BMS雙孔徑的分布結(jié)構(gòu)，即大的孔道為蛋白質(zhì)的固載提供了有效空間，而它的小孔則為物質(zhì)的傳輸提供了便利［30］。

隨著介孔材料在第三代生物傳感器研究的深入，為了提高固載蛋白質(zhì)的直接電化學(xué)信號，金、量子點（QDs）、鉑納米粒子作為促進劑也被嘗試著應(yīng)用于介孔硅固載蛋白質(zhì)體系［31－34］。金利通研究組對比了介孔SBA－15固載Hb修飾電極和Au摻雜SBA－15（Au－SBA－15）固載Hb兩體系的直接電化學(xué)行為，發(fā)現(xiàn)Hb在兩體系中均具有直接電化學(xué)信號。然而，固載于Au－SBA－15中的Hb修飾電極表現(xiàn)出更高的電子轉(zhuǎn)移速率。使用計時安培法對比研究Hb／SBA－15和Hb／Au－SBA－15對氫過氧化的催化活性，發(fā)現(xiàn)Hb／Au－SBA－15對過氧化氫的響應(yīng)電流是Hb／SBA－15的響應(yīng)電流的3倍，具有更寬的線性檢測范圍和和更小的Michaelis常數(shù)（Km）。李景虹組應(yīng)用了量子點（DQs）來促進固載于介孔硅材料MCF中的Mb的電子轉(zhuǎn)移，并且獲得了與金利通組相似的實驗結(jié)果［33］。Azadeh Azadbakht在最新發(fā)表的文章中使用雙金屬Au－Pt納米纖維制備修飾電極，然后涂覆MCM－41固載Hb的nafion混合液，發(fā)現(xiàn)該電極對痕量過氧化氫具有良好響應(yīng)［35］。

綜上所述，無機介孔硅材料是一種有效的、可保持蛋白質(zhì)活性的適宜載體。使用具有恰當孔徑大小的的介孔硅并用恰當?shù)姆绞綄崿F(xiàn)蛋白質(zhì)在介孔硅材料上的固載，可以使固載蛋白質(zhì)表現(xiàn)出直接電化學(xué)信號。在諸如金、量子點等促進劑的輔助下，固載蛋白質(zhì)的直接電化學(xué)性能可以被大大地提高。總而言之，介孔硅為蛋白質(zhì)的直接電子轉(zhuǎn)移和第三代生物傳感器的構(gòu)建提供了有效的平臺［14］。

2 非硅基介孔材料在第三代電化學(xué)生物傳感器中的應(yīng)用

除了無機介孔硅基材料，許多科研工作者也發(fā)現(xiàn)了其他介孔材料在第三代生物傳感器上的應(yīng)用潛力，例如：介孔碳、介孔硅－碳及介孔金屬氧化物。

介孔碳由于它的低成本和在導(dǎo)電方面出色的表現(xiàn)，在固載蛋白質(zhì)方面受到研究者們的關(guān)注。馮九菊等研究者使用殼聚糖作為介孔碳（CMK－3，孔徑3.2nm）和玻碳電極表面之間的連接劑，通過層層組裝的方法制備了（Hb／CMK－3）n多層膜［36］。修飾層達到六層之前，隨著層數(shù)的增加，Hb的氧化還原信號也在增加，這就意味著多層固載Hb參與了直接電子轉(zhuǎn)移。當n＝6的時候，峰電流最大。層數(shù)繼續(xù)增長后，電流逐漸趨于平穩(wěn)。另外，（Hb／CMK－3）6電極對氧氣具有良好的催化效果，其催化能力比固載于二氧化鈦多層膜的Hb還要好［37］。孫威等人使用介孔碳作為葡萄糖氧化酶的載體并混合離子液體，制備新型碳糊電極。固載葡萄糖氧化酶表現(xiàn)出良好的直接電子轉(zhuǎn)移信號，且對葡萄糖具有靈敏的響應(yīng)和較低的米氏常數(shù)。該研究者同時也強調(diào)該方法具有一定的普適性，可以固載其他氧化還原蛋白質(zhì)用于第三代生物傳感器中的研究［38］。磁性介孔碳因其既具有介孔結(jié)構(gòu)可以固載酶的優(yōu)點同時也具有磁性的易分離特性，因此受到了研究者們的關(guān)注［39－40］。于晶晶首次利用磁性介孔碳固載葡萄糖氧化酶實現(xiàn)了酶的直接電化學(xué)［39］。

吳壽等報道了關(guān)于使用介孔二氧化硅－碳泡沫復(fù)合材料（MSCF）固載蛋白質(zhì)用于第三代生物傳感的研究［41］。MSCF具有4納米的孔道，內(nèi)部通過更細小的瓶頸通道相連接。使用交流阻抗技術(shù)進行表征發(fā)現(xiàn)MSCF擁有類似單壁碳納米管和多壁碳納米管的的良好導(dǎo)電性，這是由于碳參雜于硅介孔結(jié)構(gòu)中所引起的。研究發(fā)現(xiàn)，MSCF結(jié)合了介孔碳的生物相容性和介孔二氧化硅材料的親水性。固載于介孔硅－碳中的葡萄糖氧化酶中心FAD／FADH2（FAD：黃素腺嘌呤二核苷酸）表現(xiàn)出良好的了直接電子轉(zhuǎn)移信號，對葡萄糖的響應(yīng)具有檢測范圍寬、穩(wěn)定性強和選擇性好等特點。在空氣飽和的條件下，該電極對葡萄糖的檢測范圍為0.05～5.0mM，大于氧敏葡萄糖生物傳感器的所能檢測的極限2mM［42］。

除了介孔碳和介孔硅－碳，有些金屬氧化物介孔材料也在制造第三代生物傳感器方面吸引了人們的關(guān)注。目前能夠固載并實現(xiàn)蛋白質(zhì)直接電化學(xué)的介孔金屬氧化物主要有：二氧化鈦［43］，，，氧化銦錫［45］，ZnO［47］等。Frank Marken組分別將 Hb［37］和Cyt.C固載于二氧化鈦自組裝層狀膜中獲得了蛋白質(zhì)的直接電子轉(zhuǎn)移［48－49］。隨著膜厚的增加，Cyt.C的直接電化學(xué)響應(yīng)增強。固載于二氧化鈦膜中的Hb也表現(xiàn)出同樣的直接電化學(xué)信號，通過動力學(xué)分析，膜中的電子轉(zhuǎn)移屬于有限擴散模式。該研究表明，二氧化鈦介孔空間為蛋白質(zhì)提供了適宜環(huán)境，有利于蛋白質(zhì)的直接電子轉(zhuǎn)移，而且隨著膜厚的增加，不僅僅是電極表面的蛋白質(zhì)參與了直接電子轉(zhuǎn)移。除此之外，實驗證明，鎢的介孔氧化物和介孔Nb2O5也都可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)的直接電子轉(zhuǎn)移［5，13］。制備得到的 Hb／WO3和HRP／Nb2O5電極對和H2O2具有良好的檢測性能。Yeni Astuti等人報道了伴隨質(zhì)子參與的黃素氧化還原蛋白（Fld）的光譜電化學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)Fld能夠在介孔二氧化錫電極發(fā)生直接電子轉(zhuǎn)移［50］。Stefano Frasca等研究者使用透明的介孔化銦錫（ITO電極）固載Cyt.C，在光譜檢測的同時進行了電化學(xué)檢測并獲得了Cyt.C在電極表面的直接電子轉(zhuǎn)移，固載的Cyt.C能夠催化，該研究結(jié)合了電極表面氧化物的介孔結(jié)構(gòu)特征及材質(zhì)透明的特點，展現(xiàn)了該類透明氧化物材料在催化體系研究的魅力，為構(gòu)建其他過氧化物檢測體系提供了一種新方法［45］。

3 結(jié) 語

無機介孔材料是固載蛋白質(zhì)構(gòu)建第三代電化學(xué)生物傳感器的適宜材料。具有生物相容性好，蛋白質(zhì)固載量高，孔徑可調(diào)，機械性能高穩(wěn)定性好等優(yōu)點。隨著材料合成技術(shù)的發(fā)展，多種新型介孔材料的出現(xiàn)豐富了固載蛋白質(zhì)的種類，為深入研究介孔孔道結(jié)構(gòu)、孔徑與第三代生物傳感器性能之間的關(guān)系提供了模型。使用無機介孔材料構(gòu)建第三代電化學(xué)生物傳感器為改善其敏感度、擴大其檢測范圍提供了美好前景。

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