表面活性劑脂肪醇聚氧乙烯醚對鹽藻的毒性研究

耿慶華，姜 莉，張 侃，丁建峰

（1.沈陽出入境檢驗檢疫局，沈陽 110016；2.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023）

0 引 言

脂肪醇聚氧乙烯醚（AE），又稱為聚乙氧基化脂肪醇，是非離子表面活性劑中發(fā)展最快、用量最大的品種，廣泛用于日常生活中，如在洗滌行業(yè)作為洗手液、洗衣液、金屬清洗劑等的主要活性成分；在紡織印染行業(yè)作為紡織印染助劑起乳化作用；在造紙行業(yè)可作為脫墨劑，另外在農(nóng)藥中可作為乳化劑等。隨著表面活性劑在人們生活中的大量應(yīng)用，愈來愈多的表面活性劑會隨著廢水排放進(jìn)入水環(huán)境中。由于人們環(huán)保意識的不斷加強(qiáng)，表面活性劑使用的安全性，以及對水環(huán)境的污染情況越來越受到關(guān)注和重視，人們開始擔(dān)心含有大量表明活性劑的生活和工業(yè)污水是否會對水生動植物造成危害，是否會通過食物鏈進(jìn)入到人體而對健康造成危害。因而開展表面活性劑的安全性評價和毒性研究具有很重要的意義。

鹽藻（Dunaliellasalina）屬綠藻門，綠藻綱，團(tuán)藻目，鹽藻科，鹽藻屬，是一種單細(xì)胞真核藻類。單胞藻具有利用太陽能效率高，營養(yǎng)豐富，生長繁殖迅速等重要特征，因而受到重視。在海洋環(huán)境中作為初級生產(chǎn)者，它們光合作用放出大量氧氣，是地球上生物圈中的氧氣循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，并且吸收水中的富營養(yǎng)化成分作為碳源，是水體自凈的重要保障，在海洋環(huán)境中的地位尤其重要。又因為本研究所選用的鹽藻為餌料藻，它作為海洋食物鏈的低層基石，其受污染的程度直接影響海洋其他動植物的生存環(huán)境和健康狀況，研究表面活性劑對鹽藻的毒性，可以在一定程度反應(yīng)出表面活性劑對海洋水環(huán)境的影響，其意義不言而喻。

因此，本實(shí)驗利用鹽藻作為試驗對象，研究不同濃度脂肪醇聚氧乙烯醚對鹽藻的毒性作用，為深入了解脂肪醇聚氧乙烯醚對鹽藻的毒性作用機(jī)制，以及開展對其安全性評價方法的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗材料

1.1.1 實(shí)驗藻種

實(shí)驗所用鹽藻藻種取自大連海洋大學(xué)遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室。培養(yǎng)海水取自大連市黑石礁近岸海域，沉淀后經(jīng)0.45μm篩網(wǎng)過濾，煮沸消毒，冷卻曝氣后配制培養(yǎng)液，培養(yǎng)液選用f／2營養(yǎng)鹽配方，由大連海洋大學(xué)遼寧省水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室提供。脂肪醇聚氧乙烯醚，使用濾菌海水配制成濃度為1g／100mL的原液。

1.1.2 實(shí)驗儀器

光照培養(yǎng)箱（GXZ，寧波江南）、超聲波細(xì)胞破碎儀（scientz，寧波新芝）、低溫高速冷凍離心機(jī)（三洋，日本）、酶標(biāo)儀（Bio－Tek，美國）。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 鹽藻預(yù)培養(yǎng)

用于培養(yǎng)鹽藻5L三角燒瓶先用次氯酸浸泡24h，沖洗干凈后加入過濾海水4L，煮沸10min后自然冷卻，加入f／2培養(yǎng)液，接種處于指數(shù)生長期的原始鹽藻，放入光照培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。設(shè)定培養(yǎng)溫度為24℃，光照強(qiáng)度2 500～3 500Lux，光照周期：光期／暗期＝14hr／10hr，每天上下午各搖瓶1次。試驗期間，每天用血球計數(shù)板計數(shù)，觀察鹽藻的生長情況。鹽藻密度達(dá)到時進(jìn)行分裝。

1.2.2 實(shí)驗鹽藻分裝

用于實(shí)驗培養(yǎng)的250mL三角燒瓶先用高壓滅菌鍋滅菌20min，烘干后分別加入100mL預(yù)培養(yǎng)的密度為106個／mL鹽藻。分別加入脂肪醇聚氧乙烯醚原液，使其的終濃度分別為0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0mg／L，每組設(shè)3組重復(fù)。按2.2.1方法進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.3 藻類細(xì)胞計數(shù)

實(shí)驗期間，每天各個培養(yǎng)瓶搖勻后分別吸取藻液1mL，加入5μL魯哥氏碘液固定后，使用血球計數(shù)板，顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)并計算細(xì)胞密度。

1.2.4 測定樣品前處理

在實(shí)驗的第9d，每個培養(yǎng)瓶吸取15mL藻液，使用0.45μm的纖維素酯微孔濾膜過濾后用于葉綠素的測定。每組各另取50mL藻液，3 000r／min離心5min后，加入PBS緩沖液2mL，使用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎藻細(xì)胞，8 000r／min離心5min，將上清液轉(zhuǎn)移到一個新的EP管中用于后續(xù)指標(biāo)的測定。

1.2.5 葉綠素a含量的測定

葉綠素a的測定參照《海洋檢測規(guī)范 第七部分：近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測》（中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)［GB 17378.7—2007］，由中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局和中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會2007－10－18發(fā)布，2008－05－01實(shí)行）中的分光光度法。將過濾樣品的濾膜放入具塞離心管中，加入10mL丙酮溶液（丙酮∶水＝900∶100），搖蕩，放置于冰箱儲存室中24h后，取出，4 000r／min離心10min，將上清液注入比色杯中。用丙酮做參比，分別在630、647、664、750nm波長處測定吸光值，并分別將波長630、647、664nm下測得的吸光值減去750nm下的吸光值，得到校正后的吸光值E630nm、

按下式計算葉綠素a的含量ρ：

式中：V0為樣品提取液的體積（mL）；V為藻液樣品實(shí)際用量（L）；L為測定池光程（cm）。

1.2.6 可溶性蛋白含量、總谷胱甘肽（T－GSH）含量、丙二醛（MDA）含量、過氧化氫（H2O2）含量和銅－鋅超氧化物歧化酶（CuZn－SOD）等含量測定

鹽藻可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法，測定使用南京建成生物工程研究所的蛋白測定試劑盒進(jìn)行?？偣入赘孰模═－GSH）含量采用微量酶標(biāo)法，測定使用南京建成生物工程研究所的谷胱甘肽測試盒（A061－1）進(jìn)行。丙二醛（MDA）含量使用南京建成生物工程研究所的植物丙二醛（MDA）測定試劑盒進(jìn)行測定。過氧化氫（H2O2）含量使用分光光度法進(jìn)行測定，使用南京建成生物工程研究所的過氧化氫（H2O2）測試盒（A064－1）進(jìn)行測定。銅－鋅超氧化物歧化酶（CuZn－SOD）含量使用南京建成生物工程研究所的銅－鋅超氧化物歧化酶測定試劑盒進(jìn)行測定。測定樣品使用上述1.2.4中處理后的藻類上清液，具體測定方法參照試劑盒提供的說明書進(jìn)行。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實(shí)驗數(shù)據(jù)使用SPASS 20.0軟件分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD）表示，均采用單因素方差分析。

2 實(shí)驗結(jié)果

2.1 不同濃度AE對鹽藻生長的影響

不同濃度AE對鹽藻生長的影響結(jié)果如圖1所示。在實(shí)驗的0～192h內(nèi)，含有濃度為2.0mg／L和4.0mg／L AE組的鹽藻生長受到了抑制，其他3個濃度組與對照組比未表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用。由以上實(shí)驗結(jié)果得出：較高濃度的AE在短期內(nèi)對藻類的生長具有一定的抑制作用。

圖1 不同濃度AE對鹽藻細(xì)胞總數(shù)影響

圖2 不同濃度AE對鹽藻葉綠素a含量影響

2.2 不同濃度AE培養(yǎng)下鹽藻葉綠素a含量比較

不同濃度AE對鹽藻葉綠素a含量影響比較如圖2所示。在不同濃度的AE中培養(yǎng)9d后，各組鹽藻葉綠素a的含量未表現(xiàn)出顯著差異。

2.3 不同濃度AE培養(yǎng)下鹽藻可溶性蛋白含量比較

不同濃度AE對鹽藻可溶性蛋白含量比較如圖3所示。在不同濃度的AE中培養(yǎng)9d后，4.0mg／L AE組鹽藻可溶性蛋白含量顯著低于對照組和低濃度（0.25mg／L）組（p＜0.05）。

圖3 不同濃度AE對鹽藻可溶性蛋白含量影響

圖4 不同濃度AE對鹽藻總谷胱甘肽（T－GSH）含量影響

2.4 不同濃度AE培養(yǎng)下鹽藻總谷胱甘肽（T－GSH）含量比較

不同濃度AE對鹽藻T－GSH含量比較如圖4所示。在培養(yǎng)9d后，不同濃度的AE中鹽藻T－GSH的含量較對照組都有所升高，但各組與對照組比較差異不顯著。

2.5 不同濃度AE培養(yǎng)下鹽藻丙二醛（MDA）含量比較

經(jīng)不同濃度AE處理的鹽藻 MDA含量比較如圖5所示。0.25mg／L組和4.0mg／L組與1.0mg／L組相比差異較大，且差異顯著（p＜0.05）；其他各組之間差異不顯著。

2.6 不同濃度AE培養(yǎng)下鹽藻過氧化氫（H2O2）含量比較

經(jīng)不同濃度AE處理的鹽藻H2O2含量比較如圖6所示。2.0mg／L組和4.0mg／L組與0.25mg／L組和0.5mg／L相比差異顯著（p＜0.05）；其他各組之間差異不顯著。

圖5 不同濃度AE對鹽藻丙二醛（MDA）含量影響

圖6 不同濃度AE對鹽藻過氧化氫（H2O2）含量影響

2.7 不同濃度AE培養(yǎng)下鹽藻銅－鋅超氧化物歧化酶（CuZn－SOD）含量比較

經(jīng)不同濃度處理后，鹽藻中CuZn－SOD含量的比較如圖7所示。濃度為0.25mg／L和1.0 mg／L組顯著低于對照組和0.25mg／L組（p＜0.05）；濃度4.0mg／L組顯著高于與0.25、0.5和1.0mg／L組（p＜0.05）。

圖7 不同濃度AE對鹽藻銅－鋅超氧化物歧化酶（CuZn－SOD）含量影響

3 討 論

表面活性劑（又稱界面活性劑）是指能使目標(biāo)溶液表面張力顯著下降的物質(zhì)，以及降低兩種液體之間表面張力的物質(zhì)。根據(jù)其在水中的電離性狀，合成表面活性劑可分為：陰離子型、陽離子型、非離子型和兩性電解質(zhì)型4大類。非離子表面活性劑在水中不會解離，是中性化合物，其親水部分都含有羥基及多個醚鍵［1］。不與金屬離子或硬水作用，對酸堿也較穩(wěn)定，是一類在表面活性劑的開發(fā)研究的進(jìn)程中屬于新興的類別，本實(shí)驗所采用的脂肪醇聚氧乙烯醚就是屬于此類，廣泛用于洗滌行業(yè)、紡織印染行業(yè)、造紙行業(yè)和農(nóng)藥中等日常生活的方方面面［2］。近年來，隨著人們環(huán)保意識的日益提高，同時由于生活工業(yè)污水等導(dǎo)致的環(huán)境災(zāi)害事件頻發(fā)，對包括表面活性劑在內(nèi)的化學(xué)制劑的安全問題為越來越多的研究人員所重視，人們擔(dān)心含有大量活性劑的生活和工業(yè)污水是否會對水生動植物造成危害，并通過食物鏈進(jìn)入到人體而對健康造成危害。有研究表明：雖然聚氧乙烯類非離子型表面活性劑本身的毒性較低，但是某些種類聚氧乙烯類非離子型表面活性劑代謝產(chǎn)物的毒性很高，能夠?qū)λ镌斐晌：?，如壬基酚聚氧乙烯醚的降解產(chǎn)物NP（烷基酚）是美國環(huán)境保護(hù)局出的70種環(huán)境激素的化學(xué)物質(zhì)之一，具有致癌性、致畸性和致突變性，對水生生物具有一定的毒性作用［3］。

此前研究認(rèn)為，脂肪醇聚氧乙烯醚（AE）結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，是毒性最低的一類，對水生生物沒有表現(xiàn)出毒性［5］。但本研究中發(fā)現(xiàn)，較高濃度的AE（2.0mg／L和4.0mg／L）對鹽藻的生長表現(xiàn)出了一定的抑制作用。同時，4.0mg／L AE組鹽藻可溶性蛋白含量顯著低于對照組和0.25mg／L濃度組。表明高濃度AE抑制藻類生長和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成。其作用機(jī)理可能是由于AE具有強(qiáng)表面活性，容易吸附在具有膜層結(jié)構(gòu)的藻細(xì)胞器表面，而影響和破壞其正常功能，導(dǎo)致整個細(xì)胞死亡［6］。另外，亦可能由于本研究使用的脂肪醇聚氧乙烯醚為工業(yè)用原料，可能含有其他對藻類生長具有抑制作用的成分導(dǎo)致。

藻類細(xì)胞3種色素包括葉綠素a、b和c 3種，其中尤以葉綠素a變化較為敏感，因此一般作為生理毒性指標(biāo)。研究已經(jīng)證實(shí)：水環(huán)境中的重金屬和有機(jī)污染物可以通過高濃度脅迫引起葉綠體膨脹破裂，類囊體膜解體和抑制葉綠素酸酯還原酶活性和影響氨基－γ－戊酮酸的合成兩條途徑而導(dǎo)致藻類葉綠素含量減少［7］。但在本研究中，雖然各濃度AE處理組鹽藻的生長速度不同，但葉綠素a的含量并未表現(xiàn)出顯著差異。這與周曉見的研究結(jié)果相一致，其原因可能是由于高濃度的AE導(dǎo)致脫鎂葉綠素a的含量顯著增加，說明表面活性劑脅迫下的藻類產(chǎn)生大量的脫鎂葉綠素，其游離于細(xì)胞之外，所以雖然細(xì)胞密度低，但葉綠素a含量卻很高［8］。

本研究中，鹽藻AE處理組中的CuZn－SOD活性的表現(xiàn)出不同的變化，其中AE濃度為0.25mg／L和1.0mg／L組鹽藻CuZn－SOD活性顯著低于對照組（p＜0.05），而AE濃度4.0mg／L組鹽藻CuZn－SOD活性顯著高于與0.25、0.5和1.0mg／L組（p＜0.05）。有研究表明：長時間較低濃度的污染物或者毒性較低的污染物對藻類相關(guān)酶活性會產(chǎn)生先誘導(dǎo)激活而后抑制的過程［9－10］。本研究0.25 mg／L和1.0mg／L組鹽藻CuZn－SOD活性顯著低于對照組，其原因可能是由于實(shí)驗周期較長而導(dǎo)致CuZn－SOD活性被抑制的結(jié)果。而4.0mg／L組鹽藻CuZn－SOD活性表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性，可能是由于高濃度脅迫導(dǎo)致鹽藻細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過多的氧離子自由基誘導(dǎo)的結(jié)果。李睿等研究發(fā)現(xiàn)雙酚A對微藻SOD具有低濃度和高濃度誘導(dǎo)兩種現(xiàn)象［11］，這與本研究所使用AE對鹽藻CuZn－SOD活性影響的結(jié)果相一致。

GSH作為一種抗氧化劑，是抗氧化系統(tǒng)的重要成分，谷胱甘肽系統(tǒng)中的各種抗氧化酶酶均以其為中心起作用。在本研究中，雖然各濃度AE處理組鹽藻T－GSH未表現(xiàn)出顯著差異，但是與對照組相比都有一定程度增加的趨勢。姜爽等相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，兩種多溴聯(lián)苯醚BDE－47和BDE－209脅迫下米氏凱倫藻GPx、GST、GR的活性出現(xiàn)先誘導(dǎo)激活而后抑制的過程［12］。表明GSH活性變化與脅迫時間有關(guān)，本研究出現(xiàn)的GSH升高現(xiàn)象應(yīng)該與AE的脅迫有關(guān)。

H2O2作為藻類抗氧化系統(tǒng)中的一個中間產(chǎn)物，其變化可以反映機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)性能的狀態(tài)，從總體上反映機(jī)體防御體系抗氧化能力的高低［13］。而田丹等使用重金屬鎘脅迫小球藻和湛江等鞭金藻時發(fā)現(xiàn)，這兩中微藻內(nèi)H2O2含量均出現(xiàn)了增加的過程［22］。而本研究中鹽藻H2O2含量在2個較低濃度處理組（0.25mg／L組和0.5mg／L）出現(xiàn)了增加的過程，這與上述研究的結(jié)果一致。而經(jīng)2個較高濃度（2.0mg／L和4.0mg／L）AE處理的鹽藻H2O2含量卻出現(xiàn)了減少的現(xiàn)象，其原因可能是由于處理時間較長一部分藻細(xì)胞死亡所致，本研究中對鹽藻的計數(shù)結(jié)果也證實(shí)了這一可能。

活性氧能夠?qū)⒅舅徂D(zhuǎn)化為有毒的過氧化物，破壞生物膜，造成MDA累積，因此MDA作為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，可作為植物脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)［14］。本研究中各處理組鹽藻MDA與對照組相比并未表現(xiàn)出顯著的差異，但0.25、0.5和1.0mg／L濃度組 MDA表現(xiàn)出隨處理濃度升高的過程，且1.0mg／L處理組鹽藻MDA濃度顯著高于0.25mg／L濃度處理組，這與田丹等使用重金屬鎘脅迫小球藻和湛江等鞭金藻MDA的變化趨勢相一致［13］。而2.0mg／L濃度組和4.0mg／L濃度處理鹽藻 MDA測定含量較低也可能與藻細(xì)胞數(shù)量較少有一定的關(guān)系。

本研究證實(shí)了不同濃度活化劑脂肪醇聚氧乙烯醚對鹽藻的生長具有抑制作用，導(dǎo)致體內(nèi)活性氧含量、抗氧化酶CuZn－SOD活性、以及GSH和MDA等含量發(fā)生變化，初步證實(shí)AE對鹽藻具有一定的毒性作用，為活化劑AE的合理使用和安全評價提供了理論依據(jù)。

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