含RGD修飾的丹參酮ⅡA多級靶向納米粒的制備及工藝優(yōu)化

王炎等

[摘要] 目的 探討丹參酮ⅡA多級靶向納米粒的制備及其工藝優(yōu)化。 方法 采用乳化溶劑蒸發(fā)法制備丹參酮ⅡA多級靶向納米粒；考察單因素在納米粒制備過程中的影響，包括TSⅡA載藥納米粒中的藥物濃度、乳化劑濃度、有機相/外水相、超聲時間和強度等的改變；并通過正交設計優(yōu)化TSⅡA多級靶向納米粒的制備工藝。 結果 本實驗成功制備了含RGD修飾的丹參酮ⅡA多級靶向納米粒，優(yōu)選工藝參數(shù)為：藥物濃度1mg/mL，載體材料濃度20mg/mL，有機相/外水相為1∶10，超聲強度和時間分別為200W，20×5s。 結論 此丹參酮ⅡA多級靶向納米粒的制備工藝切實可行。所制備的TNP包封率和載藥量較高，為丹參酮ⅡA的臨床應用提供了更廣闊的前景。

[關鍵詞] 丹參酮ⅡA；載藥納米粒；RGD；腫瘤靶向

[中圖分類號] TQ461 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）03-09-04

丹參酮ⅡA（Tashinone ⅡA，TSⅡA）為傳統(tǒng)中藥丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）中的有效脂溶性成分。近年來研究表明，TSⅡA對多種腫瘤細胞均有明顯的細胞毒作用[1-2]，但因丹參酮ⅡA難溶于水、體內(nèi)代謝快、生物利用率低等缺點，限制其在臨床上的廣泛應用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA聚乳酸載藥納米粒（TSⅡA-PLA NPs）對肝癌有較好療效[3-5]。本研究采用乳化溶劑蒸發(fā)法，制備含

RGD修飾的丹參酮ⅡA多級靶向納米粒（TSⅡA-mPEG-PLGA-PLL-cRGD NPs），可以增加藥物半衰期，延長藥物在體內(nèi)的作用時間，同時顯著提高對腫瘤的靶向作用。

1 儀器與材料

1.1 試劑

丹參酮ⅡA對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110766-200417，純度99.3%）；Poloxamer188（德國BASF公司）；mPEG-PLGA-PLL、mPEG-PLGA-PLL-cRGD（上海市腫瘤研究所段友容課題組提供）；吉非羅齊（中國藥品生物制品檢定所，批號：100284-199801）；甲醇為色譜醇；其他試劑為分析純。

1.2 主要儀器

激光粒度散射儀（Nicomp 380/ZLS，美國）；紫外分光光度計（德國Eppendorf公司）；微量電子分析天平（Sartotius CP225D）； Centrifuge 5804R低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）；質(zhì)譜儀（API 3000，美國ABI公司）；XW-80A 型旋渦混合儀（上海醫(yī)科大學儀器廠）。

2 實驗方法

2.1 丹參酮ⅡA多級靶向納米粒制備

將含RGD修飾的空白納米粒溶解于TSⅡA二氯甲烷溶液（0.8mg/mL）中，取mPEG-PLGA-PLL-cRGD（濃度20mg/mL）200μL，加入0.5%的乳化劑F-68的水溶液10mL，進行超聲乳化。隨后將制備的納米粒溶液置入燒杯中，攪拌揮發(fā)有機溶劑，即得丹參酮ⅡA多級靶向納米粒[6]。

2.2 藥物濃度測定方法

2.2.1 HPLC檢測的色譜條件 色譜柱為Zorbax XDB-C18（150mm×4.6 mm，5μm），流動相為甲醇-水（85︰15），流速為1mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為270nm，進樣量為20μL。

2.2.2 標準曲線的建立 精密稱取TSⅡA 5mg，置250mL的量瓶中，加無水乙醇溶解并定容，作為丹參酮對照品儲備液。分別精密量取一定量的對照品儲備液稀釋，得濃度為0.001，0.01，0.1，0.5，1，2，5，8，10，20μg /mL的標準溶液，HPLC測定。標準曲線由濃度（Concentration）對峰面積（Peak area）做線性回歸所得。

2.2.3 單因素考察 改變載藥納米粒中的藥物濃度，載體濃度，乳化劑濃度，有機相與外水相體積比，超聲強度和超聲時間等條件，制備丹參酮ⅡA多級靶向載藥納米粒，考察單因素對載藥納米粒的影響，篩選出較優(yōu)的工藝參數(shù)。

2.2.4 正交實驗 根據(jù)2.2.3實驗結果，選擇對載藥納米粒粒徑大小、包封率、載藥量影響較大的四個因素，分別為：藥物/材料，乳化劑F-68濃度，有機相與外水相體積比和超聲次數(shù)，每個因素3個水平進行正交實驗設計。綜合評價各因素的影響，確定最佳的載藥納米粒的處方和工藝。

3 結果

3.1 繪制標準曲線

標準曲線以藥物濃度（Concentration）對峰面積（Peak area）做線性回歸，見圖1。

3.2 單因素考察

3.2.1 藥物濃度 在實驗中如選用較低的TSⅡA藥物濃度時，載藥納米粒包封率會比較高，但載藥量會隨之降低，而選用較高的TSⅡA藥物濃度時載藥納米粒的包封率又會隨之降低。綜合實驗結果，我們選擇的最佳TSⅡA濃度為1mg/mL。

3.2.2 載體材料濃度 其他條件相同時，如想提高包封率，可增加載體材料的濃度，使平均分配到每個載藥納米粒載體上的藥物減少。在本實驗中，我們選擇的載體濃度是20mg/mL。見表1。

3.2.3 有機相/外水相體積比（O/W） O/W體積比能夠影響載藥納米粒的粒徑，O/W減少，納米粒的粒徑會增大，O/W增大，納米粒的粒徑會減小。綜合本實驗的數(shù)據(jù)，選擇較合適的O/W為1︰10。

3.2.4 超聲時間 超聲時間對粒徑大小和包封率影響不大，本實驗中選擇的超聲時間為20×5s。

3.2.5 超聲強度 選擇適當?shù)某晱姸仍谥苽漭d藥納米粒的過程中非常重要，超聲強度過大容易導致載藥納米粒被破壞；功率太小又會導致載藥納米粒粒徑較大且分散不均勻。綜合本實驗中所制備的TSⅡA載藥納米粒包封率及載藥量等各項數(shù)據(jù)，選擇超聲強度為200W。endprint

3.3 正交設計優(yōu)化制備工藝

由正交實驗結果可見：以包封率為指標的最佳工藝為A2B2C2D1，影響的顯著性為D>C>B>A，其中D藥物-材料比例具有顯著性影響；以載藥量為指標的最佳工藝為A2B1C2D2，影響的顯著性為C>D>B>A，影響無顯著性。由于D1和

D2水平時載藥量結果相差不大，但包封率的結果相差很大，并且該因素對于包封率具有顯著性影響，因此選擇D1；B1和B2水平時載藥量的結果相差不大，包封率的結果相差也不大，但對于包封率的影響大于載藥量，因此選擇D2。而因此確定最佳工藝為A2B2C2D1，即mPEG-PLGA-PLL 20mg，加0.8mg/ml的丹參酮二氯甲烷溶液1mL溶解，加10mL 0.5% F-68溶液，冷水浴超聲（200W）40s×10次，室溫攪拌除去二氯甲烷，8000r/min×5min離心除沉淀，即得納米粒水分散體。見表2。

4 討論

目前在臨床上對腫瘤的藥物治療想達到的效果主要是使腫瘤局部的藥物濃度盡可能達到最大化，以期達到增效減毒的作用。隨著對納米技術的運用，有學者發(fā)現(xiàn)納米粒包裹藥物制備成載藥納米粒后，藥物具有較好的靶向作用，可以使藥物在腫瘤中得到蓄積，因此得到了廣泛關注。研究發(fā)現(xiàn)通過納米載體包裹制備的新型藥物劑型，有如下的一些優(yōu)點和特性：（1）提高藥物的生物利用度[7-8]；（2）增強藥物的腫瘤靶向性[9-10]；納米粒徑的改變可使藥物到達體內(nèi)不同的部位，并使藥物在肝臟和腫瘤中得到蓄積；（3）具有較好的控（緩）釋性，載藥納米粒在進入體內(nèi)后，藥物可以從納米材料中釋緩慢釋放出來，避免了“暴釋效應”[11-12]。另外，載藥納米?？梢杂行У脑黾铀幬锇胨テ?，延長藥物的作用時間，與游離藥物相比抗腫瘤效果得到進一步提高 [13-15]。

本實驗采用乳化溶劑蒸發(fā)法制備含RGD修飾的丹參酮ⅡA多級靶向納米粒，該制備方法操作簡便，穩(wěn)定性好，并有較好的可重復性。優(yōu)選工藝參數(shù)為：藥物濃度1mg/mL，載體材料濃度20mg/mL，O/W為1∶10，超聲強度和時間分別為200W， 20×5s。

[參考文獻]

[1] Lin C，Wang L，Wang H，et al. Tanshinone IIA inhibits breast cancer stem cells growth in vitro and in vivo through attenuation of IL-6/STAT3/NF-kB signaling pathways[J]. J Cell Biochem，2013，114（9）：2061-2070.

[2] 王炎，李琦，范忠澤，等.丹參酮ⅡA介導p38MAPK信號轉導誘導人肝癌細胞凋亡[J].世界華人消化雜志， 2009， 17（2）：124-129.

[3] Li Q，Wang Y，F(xiàn)eng N，et al.Novel polymeric nanoparticles containing tanshinone IIA for the treatment of hepatoma[J].J Drug Target，2008，16（10）：725-732.

[4] 王炎，李琦，馮年平，等.丹參酮ⅡA納米粒治療小鼠肝癌及其對Cyclin E表達的影響[J].上海中醫(yī)藥雜志， 2007，41（9）：74-77.

[5] 李琦，王炎，范忠澤，等.丹參酮ⅡA及其納米粒誘導肝癌細胞凋亡及對p38MAPK、TGFβ1信號蛋白表達的影響[J].腫瘤，2008，28（1）：8-12.

[6] Yin P，Wang Y，Qiu Y，Hou L，et al. Bufalin-loaded mPEG-PLGA-PLL-cRGD nanoparticles：preparation， cellular uptake，tissue distribution，and anticancer activity[J].Int J Nanomedicine，2012，7：3961-3969.

[7] Kushwaha AK，Vuddanda PR，Karunanidhi P，et al.Development and evaluation of solid lipid nanoparticles of raloxifene hydrochloride for enhanced bioavailability[J].Biomed Res Int，2013，2013：584549.

[8] Veeranarayanan S，Poulose AC，Mohamed MS，et al. Synthesis and application of luminescent single CdS quantum dot encapsulated silica nanoparticles directed for precision optical bioimaging[J].Int J Nanomedicine，2012，7：3769-3786.

[9] Morales-Avila E，F(xiàn)erro-Flores G，Ocampo-García BE，et al. Engineered multifunctional RGD-gold nanoparticles for the detection of tumour-specific alpha（v）beta（3） expression：chemical characterisation and ecotoxicological risk assessment[J].J Biomed Nanotechnol，2012，8（6）：991-999.endprint

[10] Kotagiri N，Lee JS，Kim JW. Selective pathogen targeting and macrophage evading carbon nanotubes through dextran sulfate coating and PEGylation for photothermal theranostics[J].J Biomed Nanotechnol，2013，9（6）：1008-1016.

[11] Liang X，Sun Y，Liu L，et al. Folate-functionalized nanoparticles for controlled ergosta-4，6，8（14），22-tetraen-3-one delivery[J].Int J Pharm，2013，441（1-2）：1-8.

[12] Yang S，Li N，Chen D，et al. A facile way to prepare magnetic nanoparticles encapsulated by targetable pH-sensitive copolymer for controlled drug release[J].J Control Release，2013，172（1）：e66-67.

[13] Díaz MR，Vivas-Mejia PE.Nanoparticles as Drug Delivery Systems in Cancer Medicine：Emphasis on RNAi-Containing Nanoliposomes[J].Pharmaceuticals （Basel），2013，6（11）：1361-1380.

[14] Ma L，Kohli M，Smith A. Nanoparticles for combination drug therapy[J].ACS Nano，2013，7（11）：9518-9525.

[15] Jia X，Yin J，He D，et al. Polyacrylic acid modified upconversion nanoparticles for simultaneous pH-triggered drug delivery and release imaging[J].J Biomed Nanotechnol，2013，9（12）：2063-2072.

（收稿日期：2013-12-11）endprint

[10] Kotagiri N，Lee JS，Kim JW. Selective pathogen targeting and macrophage evading carbon nanotubes through dextran sulfate coating and PEGylation for photothermal theranostics[J].J Biomed Nanotechnol，2013，9（6）：1008-1016.

[11] Liang X，Sun Y，Liu L，et al. Folate-functionalized nanoparticles for controlled ergosta-4，6，8（14），22-tetraen-3-one delivery[J].Int J Pharm，2013，441（1-2）：1-8.

[12] Yang S，Li N，Chen D，et al. A facile way to prepare magnetic nanoparticles encapsulated by targetable pH-sensitive copolymer for controlled drug release[J].J Control Release，2013，172（1）：e66-67.

[13] Díaz MR，Vivas-Mejia PE.Nanoparticles as Drug Delivery Systems in Cancer Medicine：Emphasis on RNAi-Containing Nanoliposomes[J].Pharmaceuticals （Basel），2013，6（11）：1361-1380.

[14] Ma L，Kohli M，Smith A. Nanoparticles for combination drug therapy[J].ACS Nano，2013，7（11）：9518-9525.

[15] Jia X，Yin J，He D，et al. Polyacrylic acid modified upconversion nanoparticles for simultaneous pH-triggered drug delivery and release imaging[J].J Biomed Nanotechnol，2013，9（12）：2063-2072.

（收稿日期：2013-12-11）endprint

[10] Kotagiri N，Lee JS，Kim JW. Selective pathogen targeting and macrophage evading carbon nanotubes through dextran sulfate coating and PEGylation for photothermal theranostics[J].J Biomed Nanotechnol，2013，9（6）：1008-1016.

[11] Liang X，Sun Y，Liu L，et al. Folate-functionalized nanoparticles for controlled ergosta-4，6，8（14），22-tetraen-3-one delivery[J].Int J Pharm，2013，441（1-2）：1-8.

[12] Yang S，Li N，Chen D，et al. A facile way to prepare magnetic nanoparticles encapsulated by targetable pH-sensitive copolymer for controlled drug release[J].J Control Release，2013，172（1）：e66-67.

[13] Díaz MR，Vivas-Mejia PE.Nanoparticles as Drug Delivery Systems in Cancer Medicine：Emphasis on RNAi-Containing Nanoliposomes[J].Pharmaceuticals （Basel），2013，6（11）：1361-1380.

[14] Ma L，Kohli M，Smith A. Nanoparticles for combination drug therapy[J].ACS Nano，2013，7（11）：9518-9525.

[15] Jia X，Yin J，He D，et al. Polyacrylic acid modified upconversion nanoparticles for simultaneous pH-triggered drug delivery and release imaging[J].J Biomed Nanotechnol，2013，9（12）：2063-2072.

（收稿日期：2013-12-11）endprint