福建省臨床分離非結(jié)核分枝桿菌菌種分布研究

黃明翔，萬(wàn)康林，陳力舟，張麗水，李 丹

非結(jié)核分枝桿菌(NTM)是指結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及麻風(fēng)分枝桿菌以外的分枝桿菌，種類繁多，至今已發(fā)現(xiàn)150余種。NTM廣泛存在于環(huán)境中，其中大部分為腐物寄生菌，僅少部分對(duì)人體致病。NTM可以侵犯人體肺臟、淋巴結(jié)、骨骼、關(guān)節(jié)、皮膚和軟組織等組織器官并可引起全身播散性疾病。近年來(lái)，NTM的分離率和發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，2010年第5次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查表明，NTM 分離率為22.9%，較1990年的4.9%明顯上升[1]。為了解福建省臨床分離菌株中NTM的菌種類型分布情況，我們對(duì)我院2009年1月-2012年12月分離的6 362株分枝桿菌菌株進(jìn)行菌群鑒定，對(duì)鑒定為NTM的菌株應(yīng)用PRA-hsp65和PRA-rpoB進(jìn)行菌種鑒定，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料方法

1.1材料

1.1.1菌株來(lái)源 標(biāo)本來(lái)源于我院2009年1月-2012年12月經(jīng)BACTEC MGIT 960 培養(yǎng)分離出分枝桿菌菌株6 362株。分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株來(lái)源于中國(guó)藥品生物制品檢定所和美國(guó)ATCC，所有菌株均由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所結(jié)核病室傳代培養(yǎng)、保藏，并提供作為參照。

1.1.2試劑 限制性內(nèi)切酶、DNA Ladder 購(gòu)自日本TaKaRa公司，2×Taq MasterMix 、DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司， Metaphor?低分子量瓊脂糖購(gòu)自美國(guó)Lonza公司。羅氏培養(yǎng)基(L-J)、對(duì)硝基苯甲酸(PNB)、噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室按2006年中國(guó)防癆協(xié)會(huì)出版的《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》要求配制。

1.2方法

1.2.1分枝桿菌培養(yǎng)及菌群鑒定 分枝桿菌培養(yǎng)采用BACTEC MGIT 960系統(tǒng)、改良羅氏法；結(jié)核分枝桿菌復(fù)合菌與NTM分群主要通過對(duì)硝基苯甲酸 (PNB) 生長(zhǎng)試驗(yàn)、耐熱觸酶試驗(yàn)、28 ℃生長(zhǎng)試驗(yàn)和觀察菌株的菌落形態(tài)、顏色等生物特征進(jìn)行區(qū)分[2]。

1.2.2細(xì)菌DNA的制備 將分枝桿菌菌群鑒定為NTM的菌株接種于L-J培養(yǎng)基，取少量培養(yǎng)物加生理鹽水中，80 ℃滅活30 min，12 000 r/min離心5 min，棄上清，菌體沉淀用400 μL TE重懸，加入50 μL 10 mg/mL溶菌酶，37 ℃孵育16～20 h。之后按DNA提取試劑盒說明操作，最后用200 μL TE溶解DNA沉淀，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3PCR擴(kuò)增 根據(jù)參考文獻(xiàn)分別用引物tb11， tb12[3]和rpoBF，rpoBR[4]擴(kuò)增hsp65和rpoB，均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。兩對(duì)引物分別是tb11(5′ACC AAC GAT GGT GTG TCC AT 3′)和tb12(5′CTT GTC GAA CCG CAT ACC CT 3′)擴(kuò)增長(zhǎng)度441bp的hsp65基因片段 ，rpoBF(5′TCA AGG AGA AGC GCT ACG A 3′)和rpoBR(5′GGA TGT TGA TCA GGG TCT GC 3′)擴(kuò)增長(zhǎng)度380 bp的rpoB基因片段。PCR反應(yīng)體系均為50 μL，包括2×Taq Master Mix 25 μL， DNA模板5 μL，引物各2 μL，滅菌蒸餾水(ddH2O)16 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃變性1 min，退火65 ℃ 45 s ，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。

1.2.4hsp65和rpoB基因PCR-RFLP 分別用BstP I和HaeIII酶對(duì)hsp65基因片段進(jìn)行酶切，rpoB基因片段分別用MspⅠ和HaeⅢ兩種內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。兩種內(nèi)切酶的反應(yīng)總體積均為20 μL：內(nèi)切酶 1 μL，PCR產(chǎn)物15 μL，緩沖液2 μL，ddH2O 2 μL，酶切最適溫度下(BstP I為60 ℃，MspⅠ和HaeⅢ為37 ℃)，孵育2 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)4% Metaphor瓊脂糖凝膠電泳。酶切圖譜分析采用BIO-RAD公司的凝膠成像儀配套的Image Lab軟件。

2 結(jié) 果

2.1分枝桿菌菌群鑒定結(jié)果 2009年1月-2012年12月我院共收集到6 362株分枝桿菌臨床分離株，經(jīng)菌群鑒定5 713株結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(占89.8%)，649株為NTM(10.2%)。福建地區(qū)NTM 的臨床分離率為10.2%。

2.2hsp65及rpoB基因 PCR-RFLP結(jié)果hsp65基因擴(kuò)增后分別進(jìn)行BstpI和HaeIII酶切；rpoB基因擴(kuò)增后分別進(jìn)行MspⅠ和HaeⅢ酶切，標(biāo)準(zhǔn)參考菌株及臨床菌株都獲得了清晰的RFLP酶切指紋圖譜，電泳結(jié)果見圖1，2。

圖1 hsp65基因擴(kuò)增產(chǎn)物酶切鑒定圖譜

2.3PRA-hsp65及PRA-rpoB菌種鑒定結(jié)果 通過以上hsp65 PCR-RFLP及rpoBPCR-RFLP指紋圖譜與參考文獻(xiàn)[4-5]的比較，649株NTM菌株共鑒定出24個(gè)菌種，菌種分離數(shù)量前5位的是胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、戈登分枝桿菌和馬賽分枝桿菌M.massiliense亞種。鑒定結(jié)果見表1。

圖2 hsp65基因擴(kuò)增產(chǎn)物酶切鑒定圖譜

表1 405株NTM菌種鑒定結(jié)果

3 討 論

人類分枝桿菌感染的主要病原菌是結(jié)核分枝桿菌,但是近年來(lái)隨著結(jié)核病疫情的控制，NTM病的患病率卻呈上升趨勢(shì)[6]，這可能與實(shí)驗(yàn)室菌種鑒定水平的提高、人口老齡化、免疫抑制人群增多以及環(huán)境暴露的増加均有一定的關(guān)聯(lián)。我國(guó)5次結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示，NTM在分枝桿菌中的分離率逐年上升。

NTM的感染發(fā)生率和菌種分布存在著地域差異，且與氣候環(huán)境相關(guān)，第3次結(jié)核病流行病學(xué)對(duì)各地NTM感染情況調(diào)查表明NTM的感染率呈現(xiàn)出南方高于北方，沿海高于內(nèi)地，氣候溫和地區(qū)高于寒冷地區(qū)的流行特點(diǎn)。福建省地處中國(guó)東南沿海，氣候溫暖潮濕，第4次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查顯示NTM感染率為37.7%，屬于NTM感染的高發(fā)區(qū)。本研究結(jié)果顯示：2009-2012年福建省NTM臨床分離率為10.2%，與國(guó)內(nèi)景輝等[21]報(bào)道相比，福建省的NTM分離率遠(yuǎn)高于同期山東省的1.37%；與同樣地處沿海地區(qū)廣州的2009年NTM分離率19.3%相比，則略低于廣州地區(qū)。福建省較高的NTM臨床分離率應(yīng)當(dāng)引起我們的重視，對(duì)于分枝桿菌菌株應(yīng)進(jìn)行快速準(zhǔn)確的MTBC與NTM的鑒別，以避免臨床對(duì)NTM感染患者給予常規(guī)抗結(jié)核治療，因?yàn)榇罅垦芯恳约芭R床治療經(jīng)驗(yàn)表明多數(shù)傳統(tǒng)抗結(jié)核藥物對(duì)NTM病很少或沒有活性。

本研究應(yīng)用PCR-RFLP對(duì)619株NTM進(jìn)行菌種鑒定，相較于傳統(tǒng)方法以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)方法具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異的特點(diǎn)，已在國(guó)內(nèi)外實(shí)驗(yàn)室開展研究，結(jié)果均證實(shí)分子生物學(xué)方法能將大多數(shù)分枝桿菌鑒定到種，優(yōu)于傳統(tǒng)方法，對(duì)提高分枝桿菌的正確診斷率、指導(dǎo)臨床合理用藥有重要意義[7]。

經(jīng)PCR-RFLP檢測(cè)分析，我們從649株NTM菌株中鑒定了24個(gè)菌種，菌種數(shù)量前5位的是胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、戈登分枝桿菌和馬賽分枝桿菌M.massiliense亞種。Ⅲ群的鳥分枝桿菌復(fù)合群(MAC)為福建省NTM的主要分離菌種，占總數(shù)的67.8%。其次為Ⅳ群快生長(zhǎng)菌(RGM)包括膿腫分枝桿菌(81株)、、馬賽分枝桿菌及其亞種(32株)、偶然分枝桿菌(18株)、膿毒分枝桿菌及其亞種(5株)、龜分枝桿菌(3株)、摩納哥分枝桿菌及其亞種(3株)、荷斯坦分枝桿菌(1株)，占總數(shù)的22.0%。本研究結(jié)果與Simons等[8]報(bào)道相一致，Simons等對(duì)有關(guān)東亞NTM病的流行病學(xué)以及臨床特征的30篇英文文獻(xiàn)進(jìn)行薈萃分析發(fā)現(xiàn)，在東亞地區(qū)MAC肺病最常見占67.2%，其次為RGM病為16.4%。中國(guó)有很多關(guān)于NTM流行情況的報(bào)道。2000-2008年在與福建氣候條件較為接近的臺(tái)灣，致病性的NTM中MAC占首位為30.0%，其次為RGM包括膿腫分枝桿菌(17.5%)和偶然分枝桿菌(13.0%)[9]，通過比較,我們發(fā)現(xiàn)雖然臺(tái)灣NTM的主要致病菌種也是MAC和RGM，但臺(tái)灣的RGM所占比例要高得多，特別是偶然分枝桿菌，其在福建僅占2.2%。WANG HX等[10]報(bào)道，上海在2005-2008年間，共分離出248株16個(gè)菌種NTM，分離率前3位菌種分別為龜分枝桿菌26.7 %，偶然分枝桿菌15.4%，堪薩斯分枝桿菌14.2%，而MAC分離率僅13.1%排第4。另有研究顯示山東地區(qū)NTM以MAC為主，占總數(shù)的80.6%，其他菌種相對(duì)比較少[11]。與上海、山東相比，福建NTM菌種分布具有本地區(qū)的特點(diǎn)：較上海較高的龜分枝桿菌分離率，福建則較少見，僅為0.46%；山東省除MAC外，其它菌種少見，而福建呈現(xiàn)菌種分布類別廣的特點(diǎn)。這些研究表明了NTM 的流行有顯著的區(qū)域性差異。

NTM菌種快速、準(zhǔn)確鑒定對(duì)于臨床疾病的診斷和治療是十分重要的，美國(guó)2007年“NTM病診斷，治療與預(yù)防的指南”[12]中明確指出臨床分離的NTM必須鑒定到種水平。另外，由于目前國(guó)內(nèi)還沒有制定NTM的藥敏試驗(yàn)的參考方法，藥敏試驗(yàn)尚處于科研階段，多數(shù)醫(yī)院沒有開展NTM的藥敏試驗(yàn)，對(duì)于NTM病的治療多采用經(jīng)驗(yàn)治療，因此NTM菌種鑒定就顯得十分重要。本研究表明，PCR-RFLP可以快速、準(zhǔn)確將NTM鑒定到種水平。

參考文獻(xiàn)：

[1]Technical Guidance Group of the Fifth National TB Epidemiological Survey. The fifth national TB epidemiological survey in 2010[J]. Chin J Anyituberculosis, 2012, 34(8): 485-508. (in Chinese)

全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組.2010年全國(guó)第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告[J]. 中國(guó)防癆雜志,2012,34(8):485-508.

[2]Basic professional committee of anti-TB association. Specification of bacterial detection in tuberculosis diagnosis[M]. Beijing: China Education and Culture Press, 2006: 53-55. (in Chinese)

中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì). 結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程[M]. 北京:中國(guó)教育文化出版社,2006:53-55.

[3]Brunello F, Ligozzi M, Cristelli E, et al. Identification of 54 mycobacterial species by PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of thehsp65 gene[J]. J Clin Microbiol, 2001, 39(8): 2799-2806. DOI:10.1128/JCM.39.8.2799-2806.2001

[4]Lee H, Park HJ, Cho SN, et al. Species identification of mycobacteria by PCR-restriction fragment length polymorphism of therpoBgene[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(8): 2966-2971.

[5]Chimara E, Ferrazoli L, Ueky SY, et al. Reliable identification of mycobacterial species by PCR-restriction enzyme analysis (PRA)-hsp65 in a reference laboratory and elaboration of a sequence-based extended algorithm of RFLP-hsp65 patterns[J]. BMC Microbiol, 2008, 8: 48. DOI: 10.1186/1471-2180-8-48

[6]Stephen K, Robert L. Lung disease due to the more common nontuberculous mycobacteria[J]. Chest, 2006, 129(6): 1653-1672. DOI: 10.1378/chest.129.6.1653

[7]Roth A, Reischl U, Streubel A, et al. Novel diagnostic algorithm for identification of mycobacteria using genus-specific amplification of the 16S-23S rRNA gene spacer and restriction endonucleases[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(3): 1094-1104.

[8]Simons S, Van IJ, Hsueh PR, et al. Nontuberculous mycobacteria in respiratory tract infections, eastern Asia[J]. Emerg Infect Dis, 2011, 17(3): 343-349. DOI: 10.3201/eid1703.100604

[9]Lai CC, Tan CK, Chou CH, et al. Increasing incidence of nontuberculous mycobacteria Taiwan,2000-2008[J]. Emerg Infect Dis, 2010, 16(2): 294-296. DOI: 10.3201/eid1606.100228

[10]Wang HX, Yue J, Han M, et al. Nontuberculous mycobacteria: susceptibility pattern and prevalence rate in Shanghai from 2005 to 2008[J]. Chin Med J (Engl), 2010, 123(2): 184-187.

[11]Jing H, Wang Y, Li XX, et al. Distribution of nontuberculous mycobacteria in Shangdong province[J]. Chin J Anyituberculosis, 2009, 31(5): 273-276. (in Chinese)

景輝,王燕,李欣欣,等.山東省非結(jié)核分枝桿菌感染的菌種分布研究[J].中國(guó)防癆雜志,2009 ,31(5):273-276.

[12]Griffith DE, Aksamit T, Brown-Elliott BA, et al. An official ATS/IDSA Statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2007, 175(4): 367-416. DOI: 10.1164/rccm.200604-571