吡喹酮壓力下日本血吸蟲耐藥性的誘導和蟲體差異表達蛋白的分析

董蘭蘭，許 靜，趙 波，梁 松，王言言，關(guān)志勛，曹 蘊，夏超明

血吸蟲病(schistosomiasis)是由血吸蟲引起的全球重點防治的熱帶病之一，King, C.H.(2011)指出每年全球血吸蟲病的疾病負擔將近(9-36)百萬DALY(傷殘調(diào)整壽命年)，僅次于HIV/AIDS[1]，針對其危害，目前尚無疫苗治療措施[2]，化學藥物治療是減輕其病情損害和控制其傳播的一項重要手段[3]，長期以來，吡喹酮(Praziquantel,PZQ)是治療血吸蟲病的首選藥物，是治療日本血吸蟲病的唯一抗蟲藥[4]。但過分依賴或長期反復使用PZQ單一藥物治療具有產(chǎn)生抗藥性的潛在危險。非洲一些地區(qū)，曼氏血吸蟲對廣泛用于抗蟲治療的海蒽酮和奧沙尼喹產(chǎn)生抗藥性早有報道[5-6]。另梁幼生等建立現(xiàn)場采集株和實驗室傳代株日本血吸蟲小鼠-釘螺實驗室生活史循環(huán)，經(jīng)過8輪篩選證實中國大陸日本血吸蟲在PZQ持續(xù)藥物壓力下可產(chǎn)生抗藥性,且不同蟲株間對PZQ敏感性存在差異,藥物壓力下產(chǎn)生抗性的潛能也存在差異[7-8]?？顾幮缘某霈F(xiàn)引起人們的高度關(guān)注，因此，尋找抗血吸蟲新藥，加強抗血吸蟲疫苗的開發(fā)和新藥物靶標的篩選顯得極其重要。

本實驗應(yīng)用PZQ半數(shù)有效量(ED50)對單性感染小鼠體內(nèi)日本血吸蟲進行藥物壓力下的耐藥蟲體篩選，體外培養(yǎng)觀察誘導蟲體對PZQ敏感性的變化；并利用熒光差異凝膠雙向電泳(2D-DIGE)技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)，比較分析PZQ ED50誘導蟲體和未誘導蟲體差異表達蛋白，為新藥的研發(fā)和進一步研究血吸蟲對PZQ產(chǎn)生抗性的機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物與寄生蟲 雌性ICR小鼠(20～25 g，6～8周齡，雌性，清潔級)， 由蘇州大學實驗動物中心提供。陽性釘螺和日本血吸蟲蟲株均購自江蘇省血吸蟲病防治研究所。

1.1.2主要試劑及配制 PZQ片劑(南京制藥廠有限公司，批號20110808)，配制工作濃度為50 mmol/L,4 ℃保存?zhèn)溆?。DMEM(Dulbecco—modified Minimum Eagle’Medium)培養(yǎng)液：以100 mLDMEM LOW GLUCOSE、20 mL胎牛血清、1.2 mL青霉素鏈霉素溶液的比例進行配制，所用容器高壓蒸汽滅菌30 min，無菌操作，配后溶液置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

硫脲(Thiourea)、考馬斯亮藍G-250(Coomassie G-250)購自美國Sigma公司。尿素 (Urea)、甘油(Glycerol)、硫代硫酸鈉 ( Na2S2O3)、丙烯酰胺 ( Acrylamide )、甲叉雙丙烯酰胺( N,N-methylenebis acrylamide )、四甲基乙二胺( N,N,N,N-Tetramethyle thylenediamine, TEMED)、過硫酸氨(Ammonium persulfate, AP)、甘氨酸 (Glycine)、低熔點瓊脂糖(Argrose)、溴酚蘭(Bromophenol blue)、Tris堿(Tris-base)、十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl sulfate，SDS)、、3-[3-(膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙璜酸(CHAPS)、二硫蘇糖醇 ( Dithiothreitol,DTT )、碘乙酰胺(Iodoacetamide)、玻璃板硅烷化劑(Bind-silane)、固相PH干膠條(IPG Strip)、IPG buffer、蛋白質(zhì)純化試劑盒(2D-Clean-Up Kit)、定量試劑盒(Quant Kit)、熒光標記試劑盒(CyDye DIGE Flour (minimal Dye)Labelling Kit)、標準分子量Marker均購自瑞典Amersham Bioscience公司。

1.2方法

1.2.1日本血吸蟲雄蟲ED50的測定 雌性ICR鼠60只，每只小鼠經(jīng)腹部皮膚感染單只陽性釘螺逸出的日本血吸蟲尾蚴(單性)70～80條，感染4周后的小鼠分為6組，10只/組，其中對照組不作任何處理，5組實驗組分別經(jīng)口服灌胃給予不同劑量的PZQ混懸液，依次為12.5、25、50、100、200 mg/kg，連續(xù)5 d，給藥結(jié)束后21 d，同時解剖6組小鼠，肝門靜脈灌注法收集蟲體并計算減蟲率，計算ED50值。具體參考楊巧林等[9]的方法進行。

1.2.2日本血吸蟲對PZQ( ED50)抗性的誘導方法 ICR鼠300只，分為誘導組和未誘導組，每組150只，每只小鼠經(jīng)腹部皮膚感染單只釘螺逸出的日本血吸蟲尾蚴(單性)70～80條。誘導組小鼠于感染后4周，連續(xù)30 d口服喂飼ED50PZQ(25.98 mg/kg)混懸液，停藥21 d后，再用治療劑量(200 mg/kg)連續(xù)給藥5 d，給藥結(jié)束后3周解剖小鼠，而未誘導組不作任何處理，與誘導組小鼠同時解剖，采用肝門靜脈灌注法收集蟲體。所獲蟲體部分用于驗證對PZQ的敏感性，其余均凍存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)蟲體總蛋白提取。

1.2.3誘導蟲體對PZQ敏感性變化 將上述誘導蟲體，置于加入DMEM培養(yǎng)液的6孔板中，5條/皿，加入不同濃度的PZQ，培養(yǎng)過夜(16 h)后用生理鹽水洗滌蟲體，加入新鮮培養(yǎng)液，于體視顯微鏡下連續(xù)觀察72 h，并對血吸蟲活力狀態(tài)進行評分，蟲體活力評分標準參考楊巧林等的方法[9]。

1.2.4日本血吸蟲蟲體總蛋白的制備提取 稱取誘導蟲體(約160 mg)和未誘導蟲體(約320 mg)分別放入玻璃勻漿研磨器中，每80 mg蟲體加入500 μL組織裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS，40 mmol/L Tris，30 mmol/L DTT，0.2 mmol/L PMSF)充分研磨勻漿，冰浴超聲破碎，4 ℃離心，12 000g離心30 min，吸上清，保存于-80 ℃。

1.2.5蛋白樣品的純化和定量 按2D-Clean-Up Kit和Quant Ki使用說明書分別進行蛋白純化與定量。

1.2.6蛋白樣品的分離(2D-DIGE)

1.2.6.1CyDye熒光標記 以每400 pmol熒光能標記50 μg蛋白的比例設(shè)計實驗方案標記各蛋白樣品，內(nèi)標(Cy2)為各組混合物，充分混勻，置于冰盒上，暗處標記，反應(yīng)30 min。加入和熒光等量的終止液賴氨酸，避光反應(yīng)10 min。然后將樣本進行Cy3、Cy5正反標。

1.2.6.2雙向凝膠電泳 將制備好的已用熒光染料標記的蛋白樣品(460 μL)進行水化上樣，按IPGphor 等電聚焦系統(tǒng)指南進行第一向固相pH梯度等電聚焦電泳(IEF)，上樣量為 500 μg總蛋白。IPG 干膠條水化和聚焦在 20 ℃自動進行，程序參數(shù)設(shè)置如下：30 V，12 h；500 V，1 h；1 000 V，1 h；10 000V，2 h(grad)；10 000 V，9 h(8 500 Vhr)；500 V，12 h。

第1向等電聚焦完成后，IPG膠條在膠條平衡緩沖液Ⅰ(6 mol/L尿素，50 mmol/L Tris(pH 8.8)，30%甘油，2%SDS，0.002%溴酚藍+0.1gDTT)中進行第1次平衡15 min，然后再在平衡緩沖液Ⅱ(6 mol/L尿素，50 mmol/L Tris(pH8.8)，30%甘油，2%SDS，0.002%溴酚藍+0.25g碘乙酰胺)中第2次平衡15 min。平衡后的膠條轉(zhuǎn)移至已預(yù)先制備好的12.5%分離膠進行第2向SDS-PAGE電泳，在其膠條左邊插入帶有標準分子量的Maker(高分子量)的濾紙片，右邊插入帶有低分子量Maker濾紙片。最后將低熔點瓊脂糖封膠液加熱融化，用溫熱的瓊脂糖封膠液將膠面上緣因放置IPG膠條而產(chǎn)生的空隙填滿。待其凝固，將放置好IPG膠條的SDS-PAGE凝膠板依次插入電泳槽，在Ettan DALT Six大型垂直電泳系統(tǒng)中進行蛋白分離，SDS-PAGE電泳程序設(shè)置：開始2 W/gel，50 min；然后17 W/gel直至溴酚藍指示劑遷移到膠的底部邊緣時結(jié)束電泳，進行考馬斯亮藍染色。2D-DIGE避光條件下進行。

1.2.7凝膠圖像的掃描和圖像分析 利用Typhoon 9400型多功能激光掃描儀對電泳后的膠板進行圖像掃描。通過 Decyder V6.0凝膠分析軟件自動完成對凝膠圖像斑點的識別，并進行膠內(nèi)差異(DIA)和生物學變化(BVA)的初步分析，排除圖譜內(nèi)由于凝膠制備或電泳過程中產(chǎn)生的干擾因素如顆粒污染等，同時能糾正可能出現(xiàn)的錯誤匹配的斑點。

在蛋白質(zhì)統(tǒng)計中進行T-test，選取平均表達量比率(AR)>1.5且P<0.01的蛋白質(zhì)點，作為進一步基質(zhì)輔助激光解吸附飛行時間質(zhì)譜(MOLDI-TOF/MS)分析的差異候選蛋白，對這些點進行標記，然后在同步匹配的考馬斯亮藍染色的制備膠圖譜上于全自動斑點處理工作站進行取點酶解。

1.2.8蛋白點膠內(nèi)酶解 將切出的差異蛋白的凝膠從96孔板中取出，放入已標記好的1.5 mLEP管，各管加入脫色液(25 mmol/L NH4HCO3、50%ACN)150 μL，37 ℃脫色20 min，吸干，重復脫色2～3次，至藍色褪去。加ANC(100%)100 μL脫水至膠粒變白，吸棄ACN，約5 min，重復兩次。用25 mmol/L NH4HCO3稀釋Trypsin至12.5 μg/mL，每管加10 μL，稍微離心(12 000 r/min，1 min)，讓酶與膠粒充分接觸，4 ℃放置30 min。待酶解液被膠粒完全吸收，吸棄多余的酶液，加入10 μL 25 mmol/L NH4HCO3于37 ℃過夜。將樣本取出于24孔振蕩器上震蕩15 min，于凍干機中凍干，6 min/次，共2次，凍干后剩余蛋白樣品去4 μL左右點靶并自然干燥，然后進行質(zhì)譜分析。

1.2.9差異蛋白點的質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)檢索 樣品用4700串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析，采用正離子模式和自動獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)；所得的肽質(zhì)量指紋圖譜用在線工具MASCOT(http://www.lnatrixseienee.eom)進行數(shù)據(jù)檢索；利用NCBI(http://www.nebi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫進行搜索；物種分類選擇Schistosomejaponicum進行比對，只有在MASCOT中閾值超過95%的置信水平，才被認為是有效的差異點，若匹配到多個蛋白注釋，則選擇得分最高的作為鑒定的蛋白。

1.2.10生物信息學分析 將質(zhì)譜鑒定和NCBI上BLAST的結(jié)果通過Uniprot(http://www.uniprot.org/)和DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)的在線軟件進行蛋白功能注釋和分類。

2 結(jié) 果

2.1PZQ半數(shù)有效量(ED50)的測定 日本血吸蟲感染小鼠經(jīng)不同劑量PZQ作用后減蟲率如表1所示，應(yīng)用PHARM verson4.2軟件計算出抗日本血吸蟲的PZQ ED50為25.98 mg/kg。

表1 日本血吸蟲感染小鼠經(jīng)不同濃度PZQ作用后減蟲率

2.2PZQ ED50誘導蟲體體外培養(yǎng)對PZQ敏感性的變化 本課題組前期研究結(jié)果表明PZQ(片劑)抗日本血吸蟲未誘導成蟲的臨界致死濃度為14 μmol/L[10]。表2顯示，經(jīng)PZQ ED50壓力誘導的蟲體體外分別暴露于14 μmol/L、28 μmol/L、56 μmol/L和112 μmol/L的PZQ作用后72 h，蟲體存活率分別為87.5%、82.0%、77.3%和75.6%，與對照組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。由表2可知，隨著PZQ臨界致死濃度的倍數(shù)增加，誘導后蟲體的存活率與活力分值雖然有所下降，但變化不明顯，特別是PZQ濃度增至112 μmol/L，即8倍的未誘導血吸蟲臨界致死濃度，仍有75.6%蟲體存活，可見誘導后蟲體對PZQ的敏感性顯著下降，顯示耐藥趨勢。

表2 誘導蟲體體外對PZQ敏感性變化

2.3PZQ ED50誘導的耐藥蟲體差異表達蛋白的篩選

2.3.1誘導蟲體和未誘導蟲體總蛋白含量 取出-80 ℃冰箱保存的誘導成蟲和未誘導蟲體，提取蟲體總蛋白，根據(jù)蛋白質(zhì)標準曲線圖(圖1)和A480值，測得誘導蟲體和未誘導蟲體總蛋白的濃度分別為9.7 μg/μL和13.27 μg/μL。

2.3.22D-DIGE圖譜分析 經(jīng)雙向凝膠電泳，用Typhoon 9400激光掃描儀于熒光模式下進行凝膠成像掃描，可得到分別由Cy2、Cy3、Cy5標記的誘導蟲體和未誘導蟲體蛋白樣品的圖像及合并的膠內(nèi)差異圖像，Decyder軟件分析總共分別檢測到2 741±22和2 763±20個蛋白斑點，篩選出AR>1.5的蛋白點為差異蛋白表達點，蛋白表達差異值經(jīng)統(tǒng)計學分析(T-test)，P<0.05。經(jīng)分析，找出誘導蟲體和未誘導蟲體差異蛋白點35個，如圖2所示。

圖1 蛋白濃度標準曲線

2.3.3差異蛋白點的MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析 對圖2的35個差異蛋白點與質(zhì)譜膠進行匹配，于全自動蛋白斑點處理工作站進行切膠、酶解消化后點樣，進行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析，質(zhì)譜結(jié)果通過MASCOT軟件搜索并通過NCBI數(shù)據(jù)庫去重復分析后共確認有30個差異表達蛋白，結(jié)果如表3所示。其中12個蛋白表達上調(diào)，18個蛋白表達下調(diào)。Uniprot軟件在線分析發(fā)現(xiàn)其中28個蛋白是功能蛋白，DAVID在線軟件進行GO功能分類發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要是細胞組分(Cellular Component)和生物過程(Biological Process)類蛋白。主要包括細胞骨架相關(guān)蛋白、細胞中參與糖代謝和能量代謝的酶類、氧化還原酶類以及應(yīng)激蛋白和參與解毒代謝的蛋白酶等，另有2個蛋白功能未知(點1579：SJCHGC02633 protein(假說蛋白)；點1701：SJCHGC05544(未知蛋白)。

圖2 日本血吸蟲誘導蟲體和未誘導蟲體差異蛋白質(zhì)2D-DIGE凝膠圖譜

表3 誘導蟲體與未誘導蟲體鑒定的差異蛋白點

續(xù)表1

續(xù)表2

3 討 論

近年來血吸蟲對PZQ產(chǎn)生抗性的問題是研究的熱點之一，Kohler[11]認為抗藥性遺傳物質(zhì)的傳播是通過親本直系傳遞，通過低于治療劑量的化療選擇性的移去寄生蟲種群對藥物敏感的個體，導致種群中攜帶的抗性基因能夠傳給下一代的個體比例增加；若反復用同一種藥物對某一種群進行化療，抗性基因會逐漸積累，導致相當數(shù)量的蟲體存活。在對曼氏血吸蟲的研究中，F(xiàn)allon和Doenhoff[12]通過實驗室亞治療劑量即半數(shù)有效量(ED50)PZQ對感染小鼠體內(nèi)的曼氏血吸蟲進行連續(xù)傳代與治療篩選，誘導出曼氏血吸蟲的PZQ抗性株，從而認為在藥物壓力作用下曼氏血吸蟲可以對PZQ產(chǎn)生抗性。

參照曼氏血吸蟲ED50的測定方法[13]，本研究應(yīng)用PZQ半數(shù)有效量(ED50=25.98 mg/kg)對感染小鼠體內(nèi)的日本血吸蟲進行抗性誘導。體外實驗結(jié)果表明誘導蟲體對PZQ的敏感性降低了8倍，其對PZQ的臨界致死劑量從未誘導蟲體的14 μmol/L增加至112 μmol/L，敏感性下降顯著，顯示出耐藥趨勢。該現(xiàn)象提示藥物壓力的持續(xù)作用下日本血吸蟲具有產(chǎn)生PZQ抗性的潛在可能性，該結(jié)果與楊巧林等[9]實驗結(jié)果報道一致。

利用2D-DIGE和質(zhì)譜技術(shù)對PZQ誘導蟲體與未誘導蟲體差異表達蛋白篩選與分析發(fā)現(xiàn)共有30個差異表達蛋白，其中12個蛋白表達上調(diào)，18個蛋白表達下調(diào)，涉及糖代謝和能量代謝的酶類、細胞骨架相關(guān)蛋白、氧化還原酶類和參與解毒代謝的蛋白酶以及應(yīng)激蛋白等。

首先是糖代謝途徑相關(guān)酶類。與大多數(shù)寄生蟲一樣，血吸蟲需要通過無氧酵解來進行能量代謝，從而維持正常的生長發(fā)育[14]。血吸蟲能夠從宿主吸取大量的糖來進行代謝，每5 h便可消耗與蟲體干重相當?shù)钠咸烟荹15]，因此血吸蟲通過糖代謝獲得能量得以生存。本實驗中發(fā)現(xiàn)，參與糖酵解途徑的重要酶如丙酮酸激酶(PKM)在誘導蟲體中下調(diào)表達，同時，磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)和乳酸脫氫酶(LDH)上調(diào)表達。PKM的下調(diào)能夠抑制磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，而TPI可以可逆的催化磷酸二羥丙酮轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油醛，LDH可催化丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸。表明PZQED50長期作用蟲體，使糖酵解進程減弱，由糖酵解產(chǎn)生能量代謝障礙，血吸蟲可能通過其他代謝途徑供能，代償糖酵解過程。糖酵解途徑的很多酶類均位于體被，除利于血吸蟲方便得到葡萄糖合成ATP，同時也是許多抗血吸蟲藥物靶標的相關(guān)分子[16]，成為重要的潛在藥物靶點。目前PKM、TPI和LDH均是公認的具有保護性作用的血吸蟲病疫苗候選分子[17-19]。藥物抑制實驗結(jié)果表明，血紅素、Fe3+、青蒿素對重組日本血吸蟲LDH的活性有極強的抑制作用[20]。本研究中PZQ誘導后，蟲體LDH上調(diào)表達，推測PZQ壓力下LDH代償性表達上調(diào)，維持蟲體正常能量代謝的穩(wěn)定，提示LDH可能是潛在的PZQ靶標之一。

其次是細胞骨架和運動相關(guān)蛋白。肌動蛋白在所有真核生物中是一類高度保守的蛋白，并且是肌肉組織的重要組成成分[21]，它也存在于血吸蟲的肌肉、被膜和表皮中[22]。以往的研究報道表明，PZQ作用成蟲后，皮層首先產(chǎn)生嚴重損傷[23]。Tanima等[24]通過實驗證明，PZQ可與曼氏血吸蟲成蟲肌動蛋白結(jié)合，而肌動蛋白又廣泛分布在血吸蟲的體被膜，因此他們推測，PZQ是通過這種方式進入血吸蟲的磷脂雙分子層而發(fā)揮作用的。本實驗中誘導蟲體肌動蛋白Actin 5C 上調(diào)表達，提示PZQ ED50長期作用后，蟲體皮層屏障被破壞，機體為了修復皮層損傷不斷改變體壁的肌肉組織從而合成大量細胞骨架蛋白，重塑細胞骨架。這與Matsumoto等[25]的報道一致。血吸蟲的體被也是成蟲攝取營養(yǎng)的重要部位，同時具有重要的生理功能和防御功能，是血吸蟲逃避宿主免疫識別的屏障。這些蛋白在血吸蟲體被蛋白組的研究中亦得到證實[26]。此外，本研究中還檢測到Troponin T(肌鈣蛋白T)，Troponin作為Ca2+信號傳導途徑中的參與者能夠調(diào)節(jié)細胞間的Ca2+水平和介導Ca2+穩(wěn)態(tài)效應(yīng)[27]。PZQ作用后除引起皮層損害外，還導致蟲體肌肉收縮，這均與Ca2+密切相關(guān)，雖然目前PZQ破壞鈣離子穩(wěn)態(tài)的確切作用機制不明確，但本研究發(fā)現(xiàn)Ca2+信號傳導途徑中的參與者Troponin T在PZQED50誘導蟲體中下調(diào)表達，提示PZQ誘導后蟲體通過下調(diào)表達這些蛋白抑制了Ca2+內(nèi)流，維持Ca2+穩(wěn)態(tài)。

再次為氧化還原酶類。硫氧還蛋白過氧化物酶(TPx)是廣泛存在于原核生物和真核生物體內(nèi)的抗氧化酶，與硫氧還蛋白(TRx)、還原型煙酰腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)共同組成硫氧還蛋白系統(tǒng)(TPx系統(tǒng))[28]。筑成抗氧化作用的第一道防線，抑制初始自由基鏈的反應(yīng)。谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)作為抗氧化作用的第二道防線，對初始自由基鏈反應(yīng)釋放的毒性分子進行解毒。目前也是一個主要的血吸蟲疫苗和抗血吸蟲藥物的作用靶點[29]。現(xiàn)已知日本血吸蟲谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(SjGST)融合蛋白是WHO首批提出的作為血吸蟲病重要疫苗候選分子之一[30]。GST的酶解產(chǎn)物不但參與蟲體發(fā)育過程，而且還調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答反應(yīng)，在日本血吸蟲的免疫方面，以GST重組蛋白質(zhì)免疫的鼠、豬、羊、水牛和黃牛的減卵率分別在38.0%～59.96%之間[31]。此外，研究表明PZQ可以和GST結(jié)合并抑制其活性。本實驗中誘導蟲體GST類蛋白表達上調(diào)，提示血吸蟲可能通過增強GST與PZQ的結(jié)合而降低PZQ對血吸蟲造成的損傷，從而使蟲體得以存活，但其具體的作用機制仍需探索。

最后是應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白。在所有生物體中，應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)蛋白在細胞的發(fā)育過程中起著重要的作用，在血吸蟲進入終宿主，適應(yīng)宿主免疫環(huán)境的過程[32]中以及血吸蟲在PZQ長期作用下能夠存活下來具有重要作用。在人體內(nèi)，當血吸蟲遇到明顯的逆境環(huán)境時，HSP家族蛋白會過量表達[33]。本實驗中HSP70蛋白在誘導蟲體中表達上調(diào)，其他應(yīng)激蛋白如SJCHGC06312 protein、HSP60等表達下調(diào)。HSP70蛋白在HSP蛋白家族中占主導地位，在寄生蟲的發(fā)育和致病作用中起著重要的調(diào)節(jié)作用[34-35]。HSP70作為一個重要的保守熱休克蛋白，除具有分子伴侶作用外，還有耐熱力作用、抑制細胞凋亡、細胞識別和免疫作用[36]。用對血吸蟲具有天然抗性的東方田鼠血清免疫篩選日本血吸蟲cDNA文庫，獲得的與東方田鼠血清發(fā)生抗體反應(yīng)的相關(guān)抗原就包括HSP70[37]。本實驗HSP70蛋白在誘導蟲體上調(diào)表達可能是對PZQ壓力作用的保護性反應(yīng)，幫助細胞維持代謝結(jié)構(gòu)的完整。

此外，其他一些蛋白如SJCHGC09284 protein，功能分析發(fā)現(xiàn)其是26S蛋白酶體，具有催化活性的多亞基大分子復合物。許多研究表明，蛋白酶體在血吸蟲的生長發(fā)育中具有重要作用[38]，在細胞內(nèi)降解多種短半衰期蛋白、錯誤折疊蛋白和核蛋白的細胞器，參與細胞周期、特異性基因轉(zhuǎn)錄、抗原處理、分泌、膜蛋白的定位和蛋白質(zhì)的質(zhì)量監(jiān)控等許多重要的過程[39-40]。本研究中PZQ作用后，26S蛋白酶體下調(diào)表達，不能進行正常的蛋白降解，勢必會影響到蟲體對PZQ的敏感性變化，因而進一步深入對這些差異表達蛋白的研究可為日本血吸蟲抗藥性方面的研究提供依據(jù)。

本研究結(jié)果中這些差異蛋白的表達上調(diào)或下調(diào)，提示在PZQ藥物壓力的作用下可能促進或抑制了特定蛋白分子的表達。這些差異表達蛋白分子的發(fā)現(xiàn)有助于我們更好的理解PZQ抗血吸蟲的藥物作用機制，也為抗血吸蟲疫苗和潛在藥物靶點的研究提供了新實驗依據(jù)，為新藥研發(fā)開拓新途徑和新思路。

參考文獻：

[1]Kasinathan RS, Greenberg M. Pharmacology and potential physiological significance of schistosome multidrug resistance transporters[J]. Exp Parasitol, 2012, 132(1): 2-6.

[2]Hagan P, Sharaf O. Schistosomiasis vaccines[J]. Exp Opin Bio Ther, 2003, 3(8): 1271-1278.

[3]Wang LD, Zhou XN, Chen HG, et al. A new strategy to control transmission ofSchistosomajaponicum[J]. Engineer Sci, 2009, 11(5): 37-43. (in Chinese)

王隴德,周曉農(nóng),陳紅根,等.血吸蟲病控制新策略的研究[J].中國工程科學,2009,11(5): 37-43.

[4]Garba A, Toure S, Dembele R, et al. Present and future schistosomiasis control activities with support from the Schistosomiasis Control Initiative in West Africa[J]. Parasitology, 2009, 136(13): 1731-1737. DOI: 10.1017/S0031182009990369

[5]Katz N, Dias EP, Araujo N. Estudo de ume cepa humana deSchistosomamansoniresistant a agents esquistossomicidas[J]. Rev Soc Bras Med Trop, 1973, (7): 281-287.

[6]Canpos R, Moreira AA, Sette H Jr, et al. Hycanthone resistance in a human strain ofSchistosomamansoni[J]. Trans R Soc Trop Med Hyg, 1976, (70): 261-262.

[7]Liang YS, Li HJ, Dai JR, et al. Studies on resistance of Schistosoma to praziquantel ⅩⅢ resistance ofSchistosomajaponicumto praziquantel is experimentally induced in laboratory[J]. Chin J Schisto Ctrl, 2011, 23(6): 605-610. (in Chinese)

梁幼生,李洪軍,戴建榮,等.血吸蟲對吡喹酮抗藥性的研究ⅩⅢ- 日本血吸蟲吡喹酮抗性株的實驗室誘導[J].中國血吸蟲病防治雜志,2011,23(6):605-610.

[8]Liang YS, Coles GC, Doenhoff MJ, et al.Invitroresponse of praziquantel -resistant and -susceptibleSchistosomamansonito praziquantel[J]. Int J Parasitol, 2001, 31: 1227-1235.

[9]Yang QL, Cai R, Li X, et al. Selected schistosomes of decreased praziquantel sensitivity and ultrastructural alterations of worms under drug pressure[J]. Chin J Schisto Ctrl, 2010, (3): 206-212. (in Chinese)

楊巧林,蔡茹,李欣,等.日本血吸蟲吡喹酮耐藥蟲體篩選及其超微結(jié)構(gòu)觀察[J].中國血吸蟲病防治雜志, 2010 (3): 206-212.

[10]Cai R, Yang QL, Zhang HQ, et al. Effect of Cytochalasin D and Calcium channel blockers on ultrastructure ofSchistosomajaponicumtreated with praziquantelinvitro[J]. Chin J Zoonoses, 2010, 26(4): 315-319. (in Chinese)

蔡茹,楊巧林,張惠琴,等.細胞松弛素 D 與鈣通道阻滯劑拮抗吡喹酮作用對血吸蟲超微結(jié)構(gòu)的影響[J].中國人獸共患病學報,2010,26(4):315-319.

[11]Kohler P. The biochemical basis of anthelmintic action and resistance[J]. Int J Parasitol, 2001, 31(4): 336-345.

[12]Fallon PG, Doenhoff MJ. Drug-resistant schistosomiasis: resistance to praziquantel and oxamniquine induced inSchistosomamansoniin mice is drug specific[J]. Am J Trop Med Hyg, 1994, 51(1): 83-88.

[13]Cioli D, Botros SS, Wheatcroft-Francklow K, et al. Determination of ED50values for praziquantel in praziquantel-resistant and-susceptibleSchistosomamansoniisolates[J]. Int J Parasitol, 2004, 34(8): 979-987.

[14]Bueding E, Fisher J. Metabolic requirements of schistosomes[J]. J Parasitol, 1982: 208-212.

[15]Camacho M, Agnew A. Glucose uptake rates bySchistosomamansoni,S.haematobium, andS.bovisadults using a flow in vitro culture system[J]. J Parasitol, 1995, 81(4): 637-640.

[16]Veerakumari L, Munuswamy N.Invitroeffect of some anthelmintics on lactate dehydrogenase activity of Cotylophoron cotylophorum (Digenea: Paramphistomidae)[J]. Vet Parasitol, 2000, 91(1): 129-140.

[17]Wu XS, Su DD, Cai WJ, et al. Research progress of gene engineering vaccine ofSchistosomajaponicum[J]. Hunan J Animal Sci Vet Med, 2007, (6): 1-3. (in Chinese)

伍小松,蘇丁丁,蔡文杰,等.血吸蟲基因工程疫苗研究進展[J].湖南畜牧獸醫(yī), 2007 (6):1-3.

[18]Harn DA, Mitsuyama M, Huguenel ED, et al. Identification by monoclonal antibody of a major (28 kDa) surface membrane antigen ofSchistosomamansoni[J]. Mol Biochem Parasitol, 1985, 16(3): 345-354.

[19]Harn DA, Gu W, Oligino LD, et al. A protective monoclonal antibody recognizes and alters the catalytic activity of schistosome triose-phosphate isomerase[J]. J Immunol, 1992, 148(2): 562-567.

[20]Wang YG, Dong H, Huang B. Progress in research on lactate dehydrogenase of parasites[J]. Chin J Anim Infect Dis, 2014, 22(1): 80-86. (in Chinese)

王艷歌,董輝,黃兵.寄生蟲乳酸脫氫酶研究進展[J].中國動物傳染病學報,2014, 22(1):80-86.

[21]Huxley HE. The mechanism of muscular contraction[J]. Science, 1969, 164(886): 1356-1365.

[22]MacGregor AN, Shore SJ. Immunocytochemistry of cytoskeletal proteins in adultSchistosomamansoni[J]. Int J Parasitol, 1990, 20(3): 279-284.

[23]Mehlhorn H, Becker B, Andrews P, et al.Invivoandinvitroexperiments on the effects of praziquantel onSchistosomamansoni. A light and electron microscopic study[J]. Arzneimittel-Forschung, 1981, 31(3a): 544-554.

[24]Tallima H, El Ridi R. Praziquantel bindsSchistosomamansoniadult worm actin[J]. Int J Antimicrob Agents, 2007, 29(5): 570-575.

[25]Matsumoto Y, Perry G, Levine RJC, et al. Paramyosin and actin in schistosomal teguments[J]. Nature, 1988, 333(6168): 76-78.

[26]Braschi S, Curwen RS, Ashton PD, et al. The tegument surface membranes of the human blood parasiteSchistosomamansoni: a proteomic analysis after differential extraction[J]. Proteomics, 2006, 6(5): 1471-1482.

[27]Day TA, Bennett JL, Pax RA. Praziquantel: the enigmatic antiparasitic[J]. Parasitol Today, 1992, 8(10): 342-344.

[28]Dong WF, Li YH, Yue WB. Progress in the study of thioredoxin[J]. Grass-Feeding Licestock, 2007, (4): 4-6. (in Chinese)

董文甫,李艷紅,岳文斌.硫氧還蛋白研究進展[J].草食家畜,2007 (4): 4-6.

[29]Xiao SH. Study progress on the mode of action of praziquantel against schistosomes[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2008, 25(6): 492-502. (in Chinese)

肖樹華.吡喹酮抗血吸蟲作用的研究進展[J].中國寄生蟲學與寄生蟲病雜志,2008, 25(6): 492-502.

[30]Tang XN, Zhou PP, Gao XY, et al. Studies on immunization effects of single vaccine delivery system of biodegradable microspheres of recombinant glutathione -S-transferase fromSchistosomajaponicum[J]. Chin J Schisto Ctrl, 2007, 19(2): 98-101. (in Chinese)

唐小牛,周萍萍,高錫銀,等.重組日本血吸蟲谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶可生物降解微球單劑免疫效果的研究[J].中國血吸蟲病防治雜志,2007,19(2): 98-101.

[31]Wu Z, Liu S, Zhang S, et al. Persistence of the protective immunity toSchistosomajaponicumin Chinese yellow cattle induced by recombinant 26 kDa glutathione-S-transferase (reSjc26GST)[J]. Vet Parasitol, 2004, 123(3): 167-177.

[32]Wang X, Gobert GN, Feng XG, et al. Analysis of early hepatic stage schistosomula gene expression by subtractive expressed sequence tags library[J]. Mol Biochem Parasitol, 2009, 166(1): 62-69.

[33]Maresca B, Carratu L. The biology of the heat shock response in parasites[J]. Parasitol Today, 1992, 8(8): 260-266.

[34]De Jong-Brink M. How schistosomes profit from the stress responses they elicit in their hosts[J]. Adv Parasitol, 1994, 35: 177-256.

[35]Kanamura HY, Hancock K, Rodrigues V, et al.Schistosomamansoniheat shock protein 70 elicits an early humoral immune response inS.mansoniinfected baboons[J]. Mem Inst Oswaldo Cruz, 2002, 97(5): 711-716.

[36]Yang J, Wu ZD. Research progress on heat shock protein 70s and schistosome -derived HSP70s[J]. Int J Med Parasit Dis, 2011, 39(6): 360-364. (in Chinese)

楊潔,吳忠道.熱激蛋白 70 (HSP70) 及血吸蟲 HSP70 研究進展[J].國際醫(yī)學寄生蟲病雜志, 2011, 39(6): 360-364.

[37]Yan YT, Liu SX, Song GC, et al. Screening and cloning of genes encodingSchistosomajaponicumantigens related to the serum antibodies inMirotusfortis[J]. Chin J Parasitol Parasit Dis, 2000, 19(3): 153-156.

[38]Hong Y, Peng J, Jiang W, et al. Proteomic analysis ofSchistosomajaponicumschistosomulum proteins that are differentially expressed among hosts differing in their susceptibility to the infection[J]. Mol Cell Proteomics, 2011, 10(8): M110. 006098. DOI: 10.1074/mcp.M110.006098

[39]Orlowski M, Wilk S. Ubiquitin-independent proteolytic functions of the proteasome[J]. ABB, 2003, 415(1): 1-5.

[40]Guerra-Sa R, Castro-Borges W, Evangelista EA, et al.Schistosomamansoni: Functional proteasomes are required for development in the vertebrate host[J]. Exp Parasitol, 2005, 109(4): 228-236.