不同豆類細菌型豆豉的功能性成分分析

楊勝遠韋錦

（1. 韓山師范學(xué)院生物學(xué)系，潮州 521041；2. 韓山師范學(xué)院圖書館，潮州 521041）

不同豆類細菌型豆豉的功能性成分分析

楊勝遠1韋錦2

（1. 韓山師范學(xué)院生物學(xué)系，潮州 521041；2. 韓山師范學(xué)院圖書館，潮州 521041）

對細菌型黃豆豆豉、黑豆豆豉、綠豆豆豉、豌豆豆豉、足豆豆豉、紅豆豆豉和赤小豆豆豉的功能性成分進行了分析。結(jié)果顯示，7種豆豉的水分含量均在45%-55%的范圍內(nèi)；黃豆豆豉、黑豆豆豉、豌豆豆豉和綠豆豆豉具有較強纖溶酶和酰胺酶活性，其中黃豆豆豉的纖溶酶和酰胺酶活力最高，分別為（149.07±6.63）IU/g和（120.07±0.39）U/g；7種豆豉都具有一定［DPPH·］清除能力，清除能力大小為黃豆豆豉 ＞ 黑豆豆豉 ＞ 綠豆豆豉 ＞ 豌豆豆豉 ＞ 足豆豆豉 ＞ 紅豆豆豉 ＞ 赤小豆豆豉，黃豆豆豉［DPPH·］清除率達到（98.14±1.01）%；不同豆豉的酸可溶性多肽含量差異較大，黃豆豆豉為（82.79±3.14）mg/g，豌豆豆豉為（42.63±1.17）mg/g，其它5種豆豉的多肽含量均在25-29 mg/g之間；黃豆豆豉、黑豆豆豉、綠豆豆豉和豌豆豆豉的總游離氨基酸含量較高，分別達到了（38.89±2.27）mg/g、（32.91±1.13）mg/g、（27.80±0.79）mg/g和（34.12±1.57）mg/g，而其它3種豆豉的總游離氨基酸含量相對較低，僅為黃豆豆豉的1/2左右。功能性成分分析表明，黃豆是制備細菌型豆豉的最適原料。

豆豉 功能性成分 分析

豆豉始創(chuàng)于中國，原名“幽菽”，古時稱大豆為“菽”，據(jù)《中國化學(xué)史》解釋“幽菽”是大豆煮熟后，經(jīng)過幽閉發(fā)酵而成的意思，后更名為豉。據(jù)漢劉熙《釋名·釋飲食》中說：“豉，嗜也，五味調(diào)和，須之而成，乃可甘嗜，故齊人謂豆豉，聲同豆豉也”。我國的豆豉可分為霉菌型豆豉和細菌型豆豉兩大類［1］。霉菌型豆豉有根霉型、米曲霉型及毛霉型豆豉；細菌型豆豉則是利用枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）發(fā)酵蒸熟大豆，借助其蛋白酶生產(chǎn)出風(fēng)味獨特的大豆制品［1］。細菌型豆豉不僅可以開胃增食、消食化滯和提高大豆?fàn)I養(yǎng)素（如礦物質(zhì)、維生素、大豆異黃酮、氨基酸、多肽等）的消化吸收，而且含有豆豉纖溶酶，具有溶血栓作用［2-6］。

不同豆類在成分上具有較大差異，甚至在蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)上也有差異，因此經(jīng)過枯草芽胞桿菌發(fā)酵后其營養(yǎng)與功能性成分，也會存在差異。本研究分別以黃豆、黑豆、綠豆、赤小豆、紅豆、足豆和豌豆為原料，利用枯草芽胞桿菌枯草亞種（Bacillus subtilissubsp.subtilis）DC8發(fā)酵制備不同豆類細菌型豆豉，并對其功能性成分進行分析，以期為科學(xué)膳食和新產(chǎn)品研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃豆、黑豆、綠豆、赤小豆、紅豆、足豆和豌豆均購自潮州市大福源超市。纖維蛋白原（人源，F(xiàn)3879-1G）、凝血酶（人源，T6884-100UN）、尿激酶（人源，T4010-10KU）和2，2-二苯基-1-苦肼基（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH，D9132-1G）和琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨酸-4-硝基苯胺（succinyl-alanyl-alanyl-prolyl- phenylalanine- 4-nitroanilide，Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA，S7388-100MG）均為美國Sigma公司產(chǎn)品；巴比妥鈉（分析純），天津市光復(fù)精細化工研究所生產(chǎn)；其它試劑均為分析純或生化試劑。枯草芽胞桿菌枯草亞種（Bacillus subtilissubsp.subtilis）DC8為韓山師范學(xué)院生物學(xué)系食品與發(fā)酵工程研究所從廣西樂業(yè)縣傳統(tǒng)細菌型豆豉中分離、鑒定和保藏。

儀器：UV-2550紫外-可見分光光度計，日本Shimadzu公司生產(chǎn)；ART MICCRA D-9智能型分散機，德國ART公司生產(chǎn)；AUW120電子分析天平，日本Shimadzu公司生產(chǎn)；Sigma 3-18K高速冷凍離心機，德國Sigma 公司生產(chǎn)；LRH-250恒溫培養(yǎng)箱，上海恒科學(xué)儀器有限公司；DGX-9243B-2電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司。

種子培養(yǎng)基：采用馬鈴薯液體培養(yǎng)基，制備方法參照文獻［7］略作改動。取去皮的馬鈴薯塊200 g，用1 L水煮沸30 min，紗布過濾、冷卻，加入葡萄糖20 g，補足水至1 L，調(diào)節(jié)pH值至7.0-7.2。分裝100 mL/250 mL三角瓶，121℃滅菌20 min備用。

1.2 方法

1.2.1 種子液培養(yǎng) 從B. subtilissubsp.subtilisDC8斜面挑取1環(huán)接入馬鈴薯液體培養(yǎng)基，于37℃搖床培養(yǎng)12 h。菌落總數(shù)大于108CFU/mL。

1.2.2 細菌型豆豉發(fā)酵 選用顆粒飽滿、無蟲眼和霉變的豆為原料，過篩去雜質(zhì)后，用約3倍豆體積的可食用水常溫浸泡8 h，瀝干后盛于250 mL燒杯（豆厚度6 cm），然后于121℃蒸汽蒸煮25 min。冷卻，按每千克豆接入40 mLB. subtilissubsp.subtilisDC8種子液，混勻，于37℃恒溫培養(yǎng)24 h，然后至于4℃后熟24 h。

1.2.3 豆豉水分含量測定 將豆豉用研缽研成糜狀，參照文獻［8］采用直接干燥法進行測定。稱?。?.000 ± 0.005）g豆豉糜于105℃烘干至恒重，并計算豆豉的水分含量（%）。

1.2.4 纖溶酶和酰胺酶活性的測定

1.2.4.1 粗酶液制備 將豆豉用研缽研成糜狀，稱取10 g豆豉糜，加入50 mL 生理鹽水，25 000 r/min均質(zhì)2 min，然后置4℃浸提1 h，在4℃于11 180×g高速冷凍離心10 min，取上清液用Φ 0.45μm濾膜過濾作為粗酶液。

1.2.4.2 酶活性測定 纖溶酶活性參照文獻［9］采用瓊脂糖-血纖維平板法進行測定，根據(jù)水分含量換算為單位干質(zhì)量所具有的纖溶酶活力表示。

酰胺酶活性參照文獻［10］略作改進后進行測定，根據(jù)水分含量換算為單位干質(zhì)量所具有的酰胺酶活力表示。取4 mL 0.1 mol/L pH7.8 硼酸緩沖液，加入0.5 mL樣品，37℃保溫 2min，加入已在37℃保溫2 min的0.5 mmol/L Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA溶液（以0.1 mol/L pH7.8硼酸緩沖液配制）0.5 mL，在37℃保溫2 min，于405 nm 測定吸收值，計算分解的p-硝基苯胺濃度。以蒸餾水作為參比，以加入酶液樣品后立即測定405 nm吸收值作為對照。標(biāo)準(zhǔn)曲線采用10、20、30、40和50 μmol/L的p-硝基苯胺標(biāo)準(zhǔn)溶液405 nm處的吸收值為縱坐標(biāo)，以p-硝基苯胺濃度為橫坐標(biāo)進行繪制。酶活力單位定義：1 min水解Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA生成1 μmol/Lp-硝基苯胺的酰胺酶酶量為一個酶活力單位（unit，U）。

1.2.5 抗氧化活性測定 將黑豆豆豉用研缽研成糜狀，稱取4 g黑豆豆豉糜，加入40 mL 50% 乙醇，25 000 r/min均質(zhì)2 min，在室溫下振蕩提取1 h，在4℃于11 180×g高速冷凍離心20 min，取上清液參照文獻［11］測定DPPH自由基清除能力，根據(jù)水分含量換算為單位干質(zhì)量所具有的DPPH自由基清除率（%）表示抗氧化的能力大小。

1.2.6 總游離氨基酸含量測定 將黑豆豆豉用研缽研成糜狀，于80℃烘干，粉碎過40目篩，稱取1 g豆豉粉末，加入20 mL蒸餾水，25 000 r/min均質(zhì)2 min，于40℃浸提15 min，在4℃于11 180×g高速冷凍離心20 min，取上清液參照文獻［12］測定總游離氨基酸含量。以單位干質(zhì)量中總游離氨基酸含量表示。

1.2.7 多肽含量測定 將黑豆豆豉用研缽研成糜狀，于80℃烘干，粉碎過40目篩，稱取1 g豆豉粉末，加入20 mL蒸餾水，25 000 r/min均質(zhì)2 min，于40℃浸提15 min，在4℃于11 180×g高速冷凍離心20 min，取上清液與等體積的三氯乙酸（0.4 mol/L）混合，靜置1 h后于11 180×g高速冷凍離心20 min，取上清液參照文獻［13］采用雙縮脲法測定酸可溶性多肽的含量。以單位干質(zhì)量中酸可溶性多肽含量表示。

2 結(jié)果

2.1 不同豆類細菌型豆豉的水分含量

表1顯示不同豆類經(jīng)B. subtilissubsp.subtilisDC8發(fā)酵獲得的豆豉的含水量存在一定差異，但水分含量在45%-55%的范圍內(nèi)。

2.2 不同豆類細菌型豆豉的纖溶酶活性

表2對不同豆類的菌性豆豉的纖溶酶活性進行了測定，結(jié)果表明黃豆豆豉、黑豆豆豉、豌豆豆豉和綠豆豆豉均具有纖溶酶活性，其中以黃豆豆豉的纖溶酶活性最高，以干豆豉計，每克黃豆豆豉的纖溶酶活力達到了（149.07±6.63）IU；而足豆豆豉、紅豆豆豉和赤小豆豆豉未檢測到纖溶酶活性。

2.3 不同豆類細菌型豆豉的酰胺酶活性

表3表明不同種類的豆豉都具有一定酰胺酶活性，其中以黃豆豆豉的酰胺酶活性最高，達到了（120.07±0.39）U/g。

比較表2和表3，不同豆類細菌型豆豉的酰胺酶活性與其豆豉纖溶酶活性大小順序基本一致，說明豆豉的酰胺酶活性與纖溶酶活性存在一定相關(guān)性，可以通過測定酰胺酶活性反映豆豉的纖溶酶活性。

2.4 不同豆類細菌型豆豉的抗氧化活性

表4顯示不同豆類細菌型豆豉都具有一定的DPPH自由基清除能力，說明不同豆類細菌型豆豉都具有一定的抗氧化活性。黃豆細菌型豆豉的DPPH自由基清除能力最強，自由基清除率達到了（98.14±1.01）%，其它細菌型豆豉的DPPH自由基清除能力大小順序為：黃豆豆豉 ＞ 黑豆豆豉 ＞ 綠豆豆豉 ＞ 豌豆豆豉 ＞ 足豆豆豉 ＞ 紅豆豆豉 ＞ 赤小豆豆豉。

2.5 不同豆類細菌型豆豉的酸可溶性多肽含量

對不同豆類細菌型豆豉的酸可溶性多肽含量進行了測定，結(jié)果（表5）表明不同豆豉的酸可溶性多肽含量差異較大。黃豆豆豉的多肽含量最高，達到（82.79±3.14）mg/g；豌豆豆豉次之，多肽含量為（42.63±1.17）mg/g；其它豆豉的多肽含量差異不大，主要集中在（25-29）mg/g范圍內(nèi)。

不同豆類細菌型豆豉的多肽含量差異影響因素較多，如不同豆類的蛋白質(zhì)組成和含量不同、蛋白質(zhì)與蛋白酶接觸情況不一致、不同豆類是否有利于菌種在發(fā)酵過程中產(chǎn)蛋白酶等都會影響到豆豉的多肽含量。

2.6 不同豆類細菌型豆豉的總游離氨基酸含量

大豆蛋白在發(fā)酵過程中受枯草芽胞桿菌蛋白酶和肽酶作用，一些氨基酸獲得釋放，既有利于人體對蛋白質(zhì)的消化吸收，也有利于豆豉風(fēng)味的形成。

經(jīng)對不同豆類豆豉的氨基酸進行分析，結(jié)果（表6）表明黃豆豆豉、黑豆豆豉、綠豆豆豉和豌豆豆豉的總游離氨基酸含量較高，分別達到了（38.89±2.27）mg/g、（32.91±1.13）mg/g、（27.80±0.79）mg/g和（34.12±1.57）mg/g，而足豆豆豉、紅豆豆豉和赤小豆豆豉的總游離氨基酸含量相對較低，含量只約為黃豆豆豉的1/2。

3 討論

不同豆類的蛋白質(zhì)含量和組成不同，發(fā)酵制備的豆豉功能性因子和營養(yǎng)成分差異較大，其中黃豆豆豉纖溶酶活性、酰胺酶活性、自由基清除能力、酸可溶性多肽和總游離氨基酸含量均最高，因此黃豆是制備細菌型豆豉的最佳原料。一些文獻表明黑豆含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、胡蘿卜素、微量元素、粗纖維、異黃酮、黑色素、紅色花青素等，黑豆蛋白質(zhì)中的必需氨基酸組成和含量優(yōu)于黃豆，居豆類之首［14，15］。理論上黑豆也是細菌型豆豉的良好原料，然而本研究結(jié)果表明黑豆豆豉無論是營養(yǎng)成分含量，還是功能性物質(zhì)活性都沒有黃豆豆豉高，這可能是由于黑豆的種皮厚、顆粒大，造成蒸煮和發(fā)酵程度不夠的原因所引起的，有望通過對黑豆豆豉發(fā)酵工藝優(yōu)化而獲得改善。無論從豆豉的風(fēng)味還是功能性成分角度而言，綠豆、豌豆、足豆、紅豆和赤小豆都不適合用于制備細菌型豆豉。

4 結(jié)論

不同豆類細菌型豆豉的水分含量均較高，在45%-55%的范圍內(nèi)。

黃豆豆豉、黑豆豆豉、豌豆豆豉和綠豆豆豉具有較強纖溶酶和酰胺酶活性，其中黃豆豆豉的纖溶酶和酰胺酶活力最高，分別為（149.07±6.63）IU/g和（120.07±0.39）U/g。

不同豆類細菌型豆豉都具有一定［DPPH·］清除能力，其中黃豆豆豉［DPPH·］清除能力最強，自由基清除率達到（98.14±1.01）%。

不同豆類細菌型豆豉的酸可溶性多肽含量差異較大，以黃豆豆豉的酸可溶性多肽含量最高，達到了（82.79±3.14）mg/g。

不同豆類細菌型豆豉的總游離氨基酸含量差異較大，以黃豆豆豉的總游離氨基酸含量最高，達到了（38.89±2.27）mg/g。

功能性成分分析結(jié)果顯示，黃豆是制備細菌型豆豉的最適原料。

［1］ 宋永生, 張炳文. 日本納豆與中國豆豉營養(yǎng)功能成分的研究進展［J］. 中國調(diào)味品, 2004（12）：6-9, 26.

［2］ 趙德安. 豆豉的醫(yī)療生理作用［J］. 中國調(diào)味品, 1998（7）：9-11.

［3］ 張炳文, 宋永生. 發(fā)酵處理對大豆制品中異黃酮含量與組分影響的研究［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2002, 28（7）：6-9.

［4］ 宋永生, 張炳文. 對豆豉營養(yǎng)與活性成分變化的研究［J］. 食品工業(yè)科技, 2003（5）：23-25.

［5］ Wang CT, Ji BP, Nout R, et al. Purification and characterization of a fibrinolytic enzyme of Bacillus subtilis DC33, isolated from Chinese traditional Dou-Chi［J］. J Ind Microb Biotech, 2006, 33：750-758.

［6］ 高秀麗, 鮑鵬, 張敏, 等. 一種貴州豆豉酶提取物的溶栓活性及溶栓機理研究［J］. 貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2007, 32（4）：362-364.

［7］ 沈萍, 陳向東. 微生物學(xué)實驗［M］. 第4版. 北京：高等教育出版社, 2007：242.

［8］ 中華人民共和國衛(wèi)生部. GB 5009.3-2010 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定［S］. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2010：1-6.

［9］ 呂鳳霞, 陸兆新, 別小妹, 等. Bacillus subtilis γ-DES36 纖溶酶發(fā)酵條件的優(yōu)化研究［J］. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報, 2005, 21（2）：175-178.

［10］ Ikeda S, Ohsugi T, Sumi H. Activation of fibrinolysis（Nattokinase）induced by dipicolinic acid and related compounds［J］. Food Sci Technol Res, 2006, 12（2）：152-155.

［11］ 鄒磊, 汪立君, 程永強, 等. 加工工藝對豆豉抗氧化能力的影響［J］. 食品科學(xué), 2006, 27（8）：174-177.

［12］ 楊勝遠, 洪納禧. 茶游離氨基酸總量測定方法的改進［J］. 食品科技, 2012（9）：296-300, 305.

［13］ Cotton F, Delobbe E, Gulbis B. Assessment of a biuret method without concentration step for total protein determination in cerebrospinal fluid［J］.Clin Biochem, 1997, 30（4）：313-314.

［14］ 王敏, 李丹, 李榮和, 等. 黑豆?fàn)I養(yǎng)價值及功能特性應(yīng)用的研究與進展［J］. 長春大學(xué)學(xué)報, 2008, 18（1）：104-107.

［15］ 叢建民. 黑豆的營養(yǎng)成分分析研究［J］. 食品工業(yè)科技, 2008（4）：262-264, 268.

（責(zé)任編輯 李楠）

Functional Ingredients Analysis of Bacterial Lobster Sauce Fermented from Different Beans

Yang Shengyuan1Wei Jin2
（1. Department of Biology，Hanshan Normal University，Chaozhou521041；2. Library of Hanshan Normal University，Chaozhou521041）

The functional ingredients of bacterial soybean lobster sauce（SLS）, black bean lobster sauce（BBLS）, mung bean lobster sauce（MBLS）, pea lobster sauce（PLS）, foot bean lobster sauce（FBLS）, red bean lobster sauce（RBLS）and red phaseolus bean lobster sauce（RPBLS）were investigated. The results indicated the moisture content of the seven kinds of lobster sauce was range 45% to 55%. SLS, BBLS, PLS and MBLS showed strong fibrinolysin activity and amylase activity. The fibrinolysin activity and amylase activity of SLS was（149.07±6.63）IU/g and（120.07±0.39）U/g respectively, which was the highest of the seven kinds of lobster sauce. All of the seven kinds of lobster sauce have DPPH free radical scavenging activity with the order of SLS＞ BBLS＞ MBLS＞ PLS＞ FBLS＞ RBLS＞ RPBLS. The DPPH free radical scavenging activity of SLS was 98.14±1.01%. There was great difference on the content of acid soluble polypeptides between the different kinds of lobster sauce. The content of acid soluble polypeptides of SLS and PLS was（82.79±3.14）mg/g and（42.63±1.17）mg/ g respectively, and the content of acid soluble polypeptides in the other five kinds of lobster sauce was rang 25 mg/g to 29 mg/g. The content of free amino acids of SLS, BBLS, MBLS and PLS was（38.89±2.27）mg/g, （32.91±1.13）mg/g, （27.80±0.79）mg/g and（34.12±1.57）mg/ g respectively, however, the content of free amino acids of the other three kinds of lobster sauce was only about half of that of SLS. The functional ingredients analysis showed that soybean was the most suitable raw materials for lobster sauce.

Lobster sauce Functional ingredients Analysis

2013-10-15

國家級星火計劃項目（2011GA780022），韓山師范學(xué)院教授科研啟動金項目（QD20110304）

楊勝遠，男，教授，博士，研究方向：食品微生物及生物技術(shù)；E-mail：yshengyuan2004@aliyun.com