基于流感病毒PAN蛋白的高通量藥物篩選

張國(guó)防李真真姚偉利王麗君朱顯明

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300222；2. 天津市國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津 300457；3. 南開(kāi)大學(xué)藥學(xué)院，天津 300071；4. 南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071；5. 天津市國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院有限公司，天津 300457）

基于流感病毒PAN蛋白的高通量藥物篩選

張國(guó)防1李真真1姚偉利2，3王麗君2，4朱顯明5

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300222；2. 天津市國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，天津 300457；3. 南開(kāi)大學(xué)藥學(xué)院，天津 300071；4. 南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300071；5. 天津市國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院有限公司，天津 300457）

流感病毒的PAN蛋白高度保守，并且具有核酸內(nèi)切酶活性，是抗流感藥物研發(fā)的潛在靶點(diǎn)。通過(guò)高通量藥物篩選體系，從372種化合物中篩選出3種對(duì)流感病毒H5N1的PAN蛋白抑制作用較好的化合物。將這3種化合物分別與PAN蛋白進(jìn)行分子對(duì)接模擬，結(jié)果顯示它們均可以與PAN蛋白活性位點(diǎn)的二價(jià)金屬離子和氨基酸殘基相互作用，從而為抗流感病毒藥物的發(fā)現(xiàn)提供了先導(dǎo)化合物。

流感病毒 PAN蛋白 高通量藥物篩選 分子對(duì)接 化合物

流感是由流感病毒引起的傳染性極強(qiáng)的急性呼吸道感染。20世紀(jì)以來(lái)，全球發(fā)生過(guò)多次大規(guī)模的流感疫情。由于流感病毒容易發(fā)生基因重組而導(dǎo)致抗原變異，人體的免疫系統(tǒng)不能有效抵御病毒的攻擊，因此每一次周期性的流感爆發(fā)都會(huì)給人類健康和養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重危害。流感病毒可以借助空氣或者接觸傳播，傳播迅速并且波及范圍廣泛，曾經(jīng)爆發(fā)的H5N1高致病性禽流感病毒突破種屬天然屏障，已經(jīng)被證實(shí)了具有有效的人-人傳染的能力，感染人時(shí)致死率高達(dá)63%［1-3］。2013年3月底，我國(guó)上海和安徽兩地率先發(fā)現(xiàn)3例人感染H7N9禽流感病例。據(jù)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，截至2013年8月31日，我國(guó)內(nèi)地共報(bào)告134例人感染H7N9禽流感確診病例，其中死亡45人，康復(fù)86例，分布于12個(gè)省市的42個(gè)地市。目前，能夠有效治療流感的藥物非常有限，尋找新的藥物靶標(biāo)，研究新的抗流感藥物是藥物研發(fā)領(lǐng)域亟待解決的重要問(wèn)題之一。

流感病毒屬于正黏病毒科（Orthomyxoviridae）流感病毒屬的一類RNA病毒［4］，其RNA聚合酶（RNA polymerase）存在于被感染者宿主細(xì)胞的細(xì)胞核中，由PB1、PB2和PA三個(gè)蛋白質(zhì)亞基組成。PA亞基是一種酸性蛋白，在流感病毒RNA聚合酶中分子量最小。研究發(fā)現(xiàn)PA亞基具有絲氨酸蛋白酶活性和核酸內(nèi)切酶活性，參與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及組裝等多個(gè)生命過(guò)程。PA亞基可以被胰蛋白酶切割成30 kD的PAN（1-256）和55 kD的PAC（257-756），其中PAN蛋白的二級(jí)序列由7個(gè)α螺旋、5個(gè)β折疊及一些無(wú)規(guī)卷曲組成，具有與5'帽子結(jié)構(gòu)和cRNA啟動(dòng)子結(jié)合，穩(wěn)定聚合酶等多種功能。更重要的是PAN蛋白具有核酸內(nèi)切酶常見(jiàn)的（P）DXN（D/E）XK序列，其核酸內(nèi)切酶活性口袋部位存在His41、Glu80、Lys134、Asp108、Glu119五個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基，這5個(gè)氨基酸殘基在各種禽流感病毒中高度保守［5，6］，因此PAN被認(rèn)為是新型抗流感藥物研發(fā)的潛在靶點(diǎn)［5-7］。本研究通過(guò)高通量藥物篩選的方法，從372種化合物中篩選出來(lái)3種對(duì)流感病毒H5N1的PAN蛋白具有抑制作用的化合物，旨在為抗流感病毒藥物的研發(fā)提供先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEX-6P-1由天津市國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院高通量分子藥物篩選中心提供，作為表達(dá)載體用。菌株：感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α、E.coliBL21（DE3）pLysS購(gòu)自于北京全式金生物技術(shù)有限公司?；颍篜AN基因來(lái)自于流感病毒A / goose / Guangdong / 1 / 96（H5N1），含有該目的基因的質(zhì)粒由高通量分子藥物篩選中心構(gòu)建并保存。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建及蛋白純化 以含有流感病毒H5N1的PAN基因的質(zhì)粒作為模板，使用Primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，5'端引物為CGCGGATCCATGGAAGACTTTGTGC，3'端引物為CCGCTCGAGTTATCTGGCGTTTACTT。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物和pGEX-6P-1載體使用BamH I和XhoI雙酶切后進(jìn)行連接。重組質(zhì)粒經(jīng)基因測(cè)序后轉(zhuǎn)化E.coliBL21（DE3）pLysS感受態(tài)細(xì)胞。挑取單克隆至5 mL含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，于37℃，220 r/min搖床培養(yǎng)8 h后按0.6%接種量接種到800 mL LB培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)至OD600為0.6-0.8，將搖床降溫至16℃，加入400 μL 1 mol/L的IPTG溶液誘導(dǎo)后繼續(xù)培養(yǎng)16 h，離心收集菌體（4℃，5 500 r/min）。使用30 mL 4℃預(yù)冷的1×PBS（pH8.0）重懸菌體，超聲破菌40 min（320 W，4℃），4℃，1 5000 r/min離心，收集含有目的蛋白的上清液。

按照Glutathione Sepharose 4 Fast Flow（GE Healthcare）親和層析介質(zhì)使用說(shuō)明方法進(jìn)行重組PAN蛋白的初步純化。將含有目的蛋白的上清液通過(guò)層析柱，然后用1×PBS（pH8.0）沖洗雜蛋白后，向?qū)游鲋屑尤?00 μL 104U/mg PreScission蛋白酶，于4℃，100 r/min搖床酶切12 h，將目的蛋白從GST標(biāo)簽上切下。用20 mL PAN蛋白緩沖液（20 mmol/L Tris pH8.0，150 mmol/L NaCl）洗脫P(yáng)AN目的蛋白。使用Superdex 200 10/300 GL凝膠過(guò)濾層析柱（GE Healthcare）進(jìn)一步純化目的蛋白，收集蛋白樣，進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)。

1.2.2 高通量藥物篩選 流感病毒PAN蛋白是廣譜的金屬依賴型核酸內(nèi)切酶，既可以切割單鏈DNA、RNA，也可以切割雙鏈的DNA、RNA。這種非特異性的識(shí)別和切割活性需要二價(jià)金屬離子的參與，研究表明Mn2+的結(jié)合要優(yōu)于Mg2+［8，9］。EDTA是金屬離子螯合劑，可以螯合Mn2+，從而導(dǎo)致PAN蛋白不能發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性?；谶@一原理，采用體外熒光檢測(cè)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)兩種藥物篩選方法對(duì)化合物庫(kù)進(jìn)行PAN蛋白的藥物篩選。

1.2.2.1 體外熒光檢測(cè)方法進(jìn)行藥物篩選 基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移方法［10，11］，設(shè)計(jì)了AA核酸片段，在該片段5'端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，在3'端標(biāo)記BHQ1熒光淬滅基團(tuán)，即以FAM 5'-AA-3'BHQ1作為PAN的酶切底物，通過(guò)抑制率檢測(cè)藥物對(duì)酶的抑制作用，通過(guò)熒光淬滅率排除假陽(yáng)性結(jié)果，通過(guò)IC50值檢測(cè)PAN蛋白活性被抑制一半時(shí)抑制劑的濃度。以陰性對(duì)照的酶活曲線最大斜率值為酶促反應(yīng)速率V0，加入藥物后酶活曲線最大斜率值為酶促反應(yīng)速率Vi，抑制率（Ir）的表示方式如下：

抑制率（Ir）的檢測(cè)：在96孔板中加入15 μL 0.5 mg/mL的PAN蛋白溶液、15 μL 10 mmol/L MgCl2和MnCl2溶液、9 μL 20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0溶液、1 μL 50 mg/mL待測(cè)化合物和10 μL 30 μmol/L FAM 5'-AA-3'BHQ1底物；陰性對(duì)照中，將1 μL待測(cè)樣品換成1 μL 95% DMSO；陽(yáng)性對(duì)照中，將1 μL待測(cè)樣品換成1 μL 0.5 mmol/L EDTA溶液；震蕩混勻，酶標(biāo)儀在激發(fā)光為492 nm時(shí)，間隔30 s在發(fā)射光波長(zhǎng)527 nm處測(cè)20次熒光值。

熒光淬滅率（Qr）的檢測(cè)：在96孔板中依次加入15 μL 10 mmol/L氯化鎂和氯化錳溶液、24 μL 200 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0、10 μL 30 μmol/L底物（5’FAM-AA），震蕩混勻，在激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)分別為492 nm和527 nm處，間隔30 s測(cè)20次熒光值，所測(cè)熒光值記為Q1；在待測(cè)孔中加入1 μL 50 mg/mL藥物，在對(duì)照孔中加入1 μL 95% DMSO。震蕩混勻，酶標(biāo)儀在激發(fā)光為492 nm時(shí)，間隔30 s在發(fā)射光波長(zhǎng)527 nm處測(cè)20次熒光值，所測(cè)熒光值記為Q2；熒光淬滅率的計(jì)算式為：

IC50值的檢測(cè)：將篩選出來(lái)的抑制作用較大的藥物依次稀釋成16個(gè)不同的濃度梯度，在這些濃度下檢測(cè)該抑制劑對(duì)PAN蛋白活性抑制一半時(shí)的濃度，最后以抑制劑濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，剩余活性（Ra）為縱坐標(biāo)，利用GraphPad Prism 5軟件將這些點(diǎn)進(jìn)行擬合，計(jì)算出該抑制劑的IC50值。

1.2.2.2 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行藥物篩選 瓊脂糖凝膠電泳藥物篩選以pGEX-6P-1質(zhì)粒為底物，當(dāng)加入PAN蛋白，其發(fā)揮核酸內(nèi)切酶活性，質(zhì)粒將被切散，瓊脂糖凝膠電泳顯示彌散條帶。當(dāng)體系中同時(shí)加入藥物和PAN蛋白后，若藥物對(duì)PAN蛋白的核酸內(nèi)切酶活性有抑制作用，則瓊脂糖凝膠電泳顯示質(zhì)粒未被切割的狀態(tài)，若無(wú)抑制作用，則瓊脂糖凝膠電泳顯示彌散條帶。

在1.5 mL EP管中分別加入2 μL 0.5 mg/mL PAN蛋 白、2 μL 10 mmol/L MgCl2和MnCl2溶 液、1 μL 200 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0、1 μL 50 mg/mL的 待測(cè)樣品；陰性對(duì)照中，將1 μL待測(cè)樣品換成1 μL 95%DMSO；陽(yáng)性對(duì)照中，將1 μL待測(cè)樣品換成1 μL 0.5 mol/L EDTA；各組分混勻后于37℃孵育10 min。每個(gè)EP管中加入4 μL 200 ng/μL的pGEX-6P-1質(zhì)粒，混勻后于37℃孵育30 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)粒存在狀態(tài)。

1.2.3 抑制劑與蛋白質(zhì)分子對(duì)接的驗(yàn)證 分子對(duì)接（Mocular docking）是計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)（Computer aided drug design，CADD）常用的方法之一。利用計(jì)算化學(xué)原理模擬化合物分子與受體生物大分子的相互作用，分析已知化合物和藥物靶標(biāo)之間的構(gòu)效關(guān)系（Structure activity relationship，SAR），從而設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)新穎的先導(dǎo)化合物［12，13］。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建和蛋白表達(dá)的鑒定

771 bp的PAN目的基因和4.9 kb的表達(dá)載體連接后轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中，陽(yáng)性單克隆提取質(zhì)粒后用BamH I和XhoI雙酶切鑒定（圖1）顯示，4.9 kb的載體條帶和771 bp的目的基因條帶，確定重組成功。利用GST親和層析柱進(jìn)行PAN蛋白的初步純化，經(jīng)過(guò)Superdex 200 10/300 GL預(yù)裝柱進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析進(jìn)一步純化，得到大小為30 kD的PAN蛋白（圖2）。

2.2 高通量藥物篩選結(jié)果

2.2.1 熒光檢測(cè)法篩選結(jié)果 對(duì)化合物庫(kù)中的372種化合物進(jìn)行體外熒光檢測(cè)，結(jié)果如表1所示。抑制率越高，熒光淬滅率越低的化合物對(duì)PAN蛋白抑制作用越強(qiáng)。其中Ir≥80%，Qr≤30%的化合物共有8種，分別為MDCCCL001302，MDCCCL001311，JYCCL002021，MDCCCL002107，MDCCCL001315，MDCCCL001316，MDCCCL001319，MDCCCL001320。

2.2.2 IC50檢測(cè)結(jié)果 將熒光檢測(cè)中Ir≥80%，Qr≤30%的8種化合物進(jìn)行IC50的測(cè)定，如圖3所示，化合物MDCCCL001302，MDCCCL001311，JYCCL-002021，MDCCCL002107，MDCCCL001315，MDCCCL001316，MDCCCL001319，MDCCCL001320的IC50值分別為56、143、135.2、149.3、35.5、83.3、125.5、125.5 μmol/L。

2.2.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)熒光法中Ir≥80%，Qr≤30%的8種化合物對(duì)PAN蛋白的抑制活性，結(jié)果如圖4所示。由于質(zhì)?；拘螒B(tài)可分為3類：超螺旋，線形和開(kāi)環(huán)，所以抽提的質(zhì)粒電泳檢測(cè)時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)一條或多條條帶。從圖4中可以看到加入化合物MDCCCL001302（泳道3）、MDCCCL001315（泳道7）、MDCCCL001316（泳道8）后，質(zhì)粒在凝膠中的狀態(tài)同原始質(zhì)粒（泳道0）和陽(yáng)性對(duì)照（泳道2）相同，為兩條條帶，表明這些化合物的加入抑制了PAN蛋白的核酸內(nèi)切酶活性。其他5種化合物加入后，質(zhì)粒在凝膠中的狀態(tài)同陰性對(duì)照（泳道1）相同，呈彌散條帶，表明這些化合物的加入對(duì)PAN蛋白的核酸內(nèi)切酶活性無(wú)明顯抑制作用。

2.2.4 綜合篩選結(jié)果 綜合體外熒光檢測(cè)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)兩種方法篩選結(jié)果和IC50值，篩選出來(lái)3種對(duì)PAN蛋白有較強(qiáng)抑制作用的化合物， 分 別 為MDCCCL001302、MDCCCL 001315、MDCCCL001316，綜合篩選結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.5 抑制劑與蛋白質(zhì)的分子對(duì)接結(jié)果 2012年文獻(xiàn)報(bào)道了PAN蛋白與EGCG共晶結(jié)果（PDB ID：4AWM）［14］，如圖5-A所示，證實(shí)了EGCG具有較強(qiáng)的PAN核酸內(nèi)切酶抑制作用，其沒(méi)食子酰基是必需基團(tuán)，可以與活性口袋很好地契合，而且沒(méi)食子?；牧u基氧可以與活性口袋處的親水性氨基酸形成穩(wěn)定的氫鍵，從而抑制了PAN蛋白的核酸內(nèi)切酶活性。

將篩選出來(lái)的3種化合物分別與PAN蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，如圖5-B、圖5-C和圖5-D所示。與EGCG對(duì)比發(fā)現(xiàn)：化合物MDCCCL001315和MDCCCL001316的共同結(jié)構(gòu)特征是含有3，4-二羥基苯丙烯基，其苯環(huán)上鄰位的兩個(gè)羥基氧與活性中心的錳離子之間形成配位鍵，同時(shí)也可以作為氫鍵受體或供體與其他基團(tuán)（如羰基氧）協(xié)同作用，同活性口袋內(nèi)的關(guān)鍵氨基酸殘基（His41、Glu80、Lys134、Asp108、Glu119）之間形成氫鍵，從而抑制PAN蛋白核酸內(nèi)切酶活性。如MDCCCL001316苯環(huán)上鄰位的兩個(gè)羥基氧與兩個(gè)錳離子形成配位鍵，其中一個(gè)羥基氧與Glu119形成氫鍵，錳離子通過(guò)吸電子使底物局部顯正電，配位鍵的產(chǎn)生則減弱了吸電子作用，導(dǎo)致底物不能被降解，從而抑制PAN蛋白核酸內(nèi)切酶活性。而MDCCCL001302也含有3，4-二羥基苯丙烯基，但是與兩個(gè)錳離子形成配位鍵的是羧酸上的羰基氧和羥基氧，同時(shí)其苯環(huán)上的一個(gè)羥基氧與Val121形成氫鍵，錳離子通過(guò)吸電子使底物局部顯正電，配位鍵的產(chǎn)生則減弱了吸電子作用，導(dǎo)致底物不能被降解，從而抑制PAN蛋白核酸內(nèi)切酶活性。

3 討論

本試驗(yàn)使用的高通量藥物篩選技術(shù)是將化學(xué)、基因組研究、生物信息，以及自動(dòng)化儀器等先進(jìn)技術(shù)有機(jī)組合在一起，形成的一個(gè)高程序、高自動(dòng)化的新模式，是新藥發(fā)現(xiàn)的新程序。高通量篩選技術(shù)以微孔板為試驗(yàn)工具，利用計(jì)算機(jī)自動(dòng)化操作系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、收集試驗(yàn)數(shù)據(jù)并對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，具有微量、靈敏、快速、高效等特點(diǎn)。除了本試驗(yàn)使用的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）檢測(cè)和熒光淬滅（FQ）檢測(cè)外，還有時(shí)間分辨熒光（TRET）、熒光偏振（FP）及熒光相關(guān)譜（FCS）等檢測(cè)手段。本試驗(yàn)使用FRET和FQ快速?gòu)?72種化合物中篩選出對(duì)PAN有抑制作用的化合物。

默克公司利用藥效團(tuán)和計(jì)算機(jī)模擬發(fā)現(xiàn)了一類2，4-二氧戊烷丁酮酸系列化合物，例如，DPBA對(duì)核酸內(nèi)切酶的IC50在0.2-29 μmol/L之間；L-742，001是其結(jié)構(gòu)衍生物，不但能夠抑制病毒mRNA的合成，同時(shí)還可以有效阻止藥物被移除后流感病毒的再生，細(xì)胞試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)它是劑量依賴型的抑制劑，是一個(gè)較有潛力的候選藥物。對(duì)比該系列化合物，本試驗(yàn)通過(guò)高通量藥物篩選得出的3種化合物在分子對(duì)接的驗(yàn)證上，發(fā)現(xiàn)了一類3，4-二羥基苯丙烯基的化合物，分別為MDCCCL001302、MDCCCL001315、MDCCCL001316，它們的IC50分別是56 μmol/L，35.5 μmol/L，83.3 μmol/L。這些化合物對(duì)PAN蛋白具有明顯的抑制作用，是發(fā)現(xiàn)抗流感病毒藥物的先導(dǎo)化合物，需要進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化。

4 結(jié)論

表達(dá)純化獲得了流感病毒H5N1的PAN蛋白，通過(guò)高通量藥物篩選體系，從372種化合物中篩選出3種對(duì)PAN蛋白有抑制作用的化合物，其IC50值分別是56 μmol/L，35.5 μmol/L和83.3 μmol/L。其中3，4-二羥基苯丙烯基在抗流感病毒核酸內(nèi)切酶活性中具有十分重要的作用。

［1］ Webby RJ, Swenson SL, Krauss SL, et al. Evolution of swine H3N2 influenza viruses in the United States［J］. Journal of Virology, 2000, 74（18）：8243-8251.

［2］ Karasin AI, Schutten MM, Cooper LA, et al. Genetic characterization of H3N2 influenza viruses isolated from pigs in North America, 1977-1999：evidence for wholly human and reassortant virus genotypes［J］. Virus Research, 2000, 68（1）：71-85.

［3］ Li KS, Guan Y, Wang J, et al. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia［J］. Nature, 2004, 430（6996）, 209-213.

［4］ Couceiro JN, Paulson JC, Baum LG. Influenza virus strains selectively recognize sialyloligosaccharides on human respiratory epithelium；the role of the host cell in selection of hemagglutinin receptor specificity［J］. Virus Research, 1993, 29（2）：155-165.

［5］ Yuan P, Bartlam M, Lou Z, et al. Crystal structure of an avian influenza polymerase PANreveals an endonuclease active site［J］. Nature, 2009, 458（7240）：909-913.

［6］ Liu Y, Lou Z, Bartlam M, et al. Structure-function studies of the influenza virus RNA polymerase PA subunit［J］. Science in China Series C：Life Sciences, 2009, 52（5）：450-458.

［7］ Nistal-Villán E, et al. New prospects for the rational design of antivirals［J］. Nature Medicine, 2009, 15（11）：1253-1254.

［8］ Crépin T, Dias A, et al. Mutational and metal binding analysis of the endonuclease domain of the influenza virus polymerase PA subunit［J］. Journal of Virology, 2010, 84（18）：9096-9104.

［9］ Dias A, Bouvier D, Crépin T, et al. The cap-snatching endonuclease of influenza virus polymerase resides in the PA subunit［J］. Nature, 2009, 458（7240）：914-918.

［10］ Sinev M, Landsmann P, Sineva E, et al. Design consideration and probes for fluorescence resonance energy transfer studies［J］. Bioconjugate Chemistry, 2000, 11, （3）：352-362.

［11］ Gauglitz G, Proll G. Strategies for label-free optical detection［J］. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, 2008, 109：395-432.

［12］ 徐筱杰, 侯廷軍, 喬學(xué), 等. 計(jì)算機(jī)輔助藥物分子設(shè)計(jì)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社, 2004.

［13］ 李洪林, 沈建華, 羅小民, 等. 虛擬篩選與新藥發(fā)現(xiàn)［J］. 生命科學(xué), 2005, 17（2）：125-131.

［14］ Kowalinski E, Zubieta C, Wolkerstorfer A, et al. Structural analysis of specific metal chelating inhibitor binding to the endonuclease domain of influenza pH1N1（2009）Polymerase［J］. PLOS Pathogens, 2012, 8（8）. e1002831.

（責(zé)任編輯 李楠）

High Throughput Drug Screening on Protein PANof Influenza Virus

Zhang Guofang1Li Zhenzhen1Yao Weili2，3Wang Lijun2，4Zhu Xianming5
（1. College of Biology Enginzeering，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300222；2. Tianjin International Joint Academy of Biotechnology & Medicine，Tianjin 300457；3. College of Pharmacy，Nankai University，Tianjin 300071；4. College of Life Science，Nankai University，Tianjin 300071；5. Tianjin International Joint Academy of Biotechnology & Medicine Company Limited，Tianjin 300457）

PANprotein, which is an endonuclease and highly conserved in influenza virus, is a potential target for the discovery and development of anti-influenza drugs. Three inhibitors of PANprotein were obtained from a compounds library. The molecular docking analysis showed that these compounds can interact with the divalent metal ions and those amino acid residues in the active sites, implying that these components might be the lead compounds for the novel anti-influenza drugs.

Influenza virus Protein PANHigh throughput screening Molecular docking Compounds

2013-07-30

天津市科技支撐計(jì)劃國(guó)家生物醫(yī)藥國(guó)際創(chuàng)新園專項(xiàng)（12ZCZDSY13500）

張國(guó)防，男，碩士研究生，研究方向：生物工程；E-mail：guofang.zhang@htmdc.org

朱顯明，男，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，研究方向：生物醫(yī)藥；E-mail：xianming.zhu@htmdc.org