利用不同啟動(dòng)子控制木糖代謝關(guān)鍵酶基因構(gòu)建可共代謝葡萄糖木糖重組釀酒酵母

金怡 王震 莫春玲 楊秀山 田沈

（首都師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048）

利用不同啟動(dòng)子控制木糖代謝關(guān)鍵酶基因構(gòu)建可共代謝葡萄糖木糖重組釀酒酵母

金怡 王震 莫春玲 楊秀山 田沈

（首都師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048）

利用不同強(qiáng)度的啟動(dòng)子調(diào)控木糖代謝關(guān)鍵酶活性，構(gòu)建穩(wěn)定代謝葡萄糖和木糖產(chǎn)乙醇的重組釀酒酵母。以本實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)利菌株Saccharomyces cerevisiaeY5為宿主菌，將樹(shù)干畢赤酵母Pichia stipitisCBS6054的木糖還原酶基因XYL1和木糖醇脫氫酶基因XYL2置于磷酸甘油酸激酶基因啟動(dòng)子（PGKp）控制下，釀酒酵母Y5內(nèi)源的木酮糖激酶基因XKS1分別由己糖激酶基因啟動(dòng)子（HXK2p）及其內(nèi)源啟動(dòng)子（XKS1p）控制。這3個(gè)基因連同各自表達(dá)元件導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，打通其木糖上游代謝途徑。酶活測(cè)定結(jié)果顯示，HXK2p對(duì)木酮糖激酶表現(xiàn)出更強(qiáng)的啟動(dòng)效率。重組菌Y5-X3-1中木糖還原酶/木糖醇脫氫酶/木酮糖激酶（XR/XDH/ XK）的酶活比值為1∶5∶4，其木糖消耗量是宿主菌的5倍，最高乙醇產(chǎn)量為24.35 g/L，達(dá)到理論值的73%。結(jié)果表明，通過(guò)調(diào)節(jié)XYL1、XYL2及XKS1啟動(dòng)子的強(qiáng)度，調(diào)控其表達(dá)水平，進(jìn)而改變3種酶的活性水平，對(duì)于提高重組釀酒酵母利用木糖發(fā)酵產(chǎn)乙醇有明顯效果。

重組釀酒酵母 木糖 乙醇 共發(fā)酵 啟動(dòng)子

以各類(lèi)農(nóng)林廢棄物為代表的木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)燃料乙醇，具有廣闊的應(yīng)用前景。木質(zhì)纖維素類(lèi)原料中半纖維素組分的有效利用可以使乙醇燃料的生產(chǎn)成本降低25%，這主要?dú)w功于其中的木糖。木糖是自然界中含量?jī)H次于葡萄糖的糖分，木糖的有效利用提高了植物原料生產(chǎn)乙醇的經(jīng)濟(jì)效益，因而對(duì)木糖生物轉(zhuǎn)化的研究是充分開(kāi)發(fā)利用半纖維素的基礎(chǔ)［1］。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是工業(yè)上生產(chǎn)乙醇的優(yōu)良菌株，具有許多優(yōu)秀的生產(chǎn)性能［2］。但釀酒酵母不能有效地利用木質(zhì)纖維素中含量次豐富的木糖［3］。國(guó)內(nèi)外廣泛采用能天然代謝木糖產(chǎn)乙醇的樹(shù)干畢赤酵母（Pichia stipitis）作為木糖還原酶（XR）和木糖醇脫氫酶（XDH）的基因來(lái)源，構(gòu)建出可以代謝木糖的重組釀酒酵母，但是這些重組菌株發(fā)酵木糖能力較弱［4-6］。木酮糖激酶（Xylulokinase，XK）在釀酒酵母體內(nèi)負(fù)責(zé)催化木酮糖轉(zhuǎn)化為5-磷酸木酮糖，處于木糖代謝物進(jìn)入PPP途徑的關(guān)鍵點(diǎn)，是促進(jìn)木糖代謝向下游進(jìn)行的關(guān)鍵酶。釀酒酵母本身具有該酶，但表達(dá)量小。研究表明，表達(dá)P.stipitis的XYL1、XYL2并同時(shí)超表達(dá)自身木酮糖激酶基因（XKS1），可以促進(jìn)菌株發(fā)酵木糖［7，8］。雖然表達(dá)XYL1、XYL2和XKS1的重組釀酒酵母可利用木糖發(fā)酵，但大多數(shù)的木糖都被用來(lái)產(chǎn)生木糖醇，乙醇發(fā)酵效果并不十分理想［9，10］，無(wú)法滿(mǎn)足工業(yè)化應(yīng)用。

目前，國(guó)內(nèi)外構(gòu)建的重組釀酒酵母無(wú)法滿(mǎn)足工業(yè)化應(yīng)用的主要原因之一是XR和XDH的輔酶特異性不同，容易在代謝過(guò)程中由于輔酶因子不能及時(shí)轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致氧化還原不平衡造成副產(chǎn)物的積累，從而影響乙醇的轉(zhuǎn)化效率。Eliasson［11］建立在動(dòng)力學(xué)模型基礎(chǔ)上的數(shù)據(jù)模擬顯示，當(dāng)XR/XDH/XK值為1∶（≧10）∶（≧4）時(shí)，木糖醇的積累最少，乙醇產(chǎn)量最多。因此通過(guò)改變啟動(dòng)子的強(qiáng)度，調(diào)節(jié)木糖代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)水平，可達(dá)到增加乙醇產(chǎn)率，減少木糖醇積累的目的。Matsushika［12］建立了一系列含有由PGKp和ADHp啟動(dòng)子控制XYL1、XYL2和XKS1的整合質(zhì)粒的重組工業(yè)釀酒酵母。將這3個(gè)基因均置于PGKp啟動(dòng)子下的MR-4重組菌的XR/XDH/ XK值最接近理想比值，為1∶9∶6，其最高乙醇濃度達(dá)到15.6 g/L，乙醇得率則達(dá)到0.34 g/g，木糖醇產(chǎn)率下降到0.04 g/g。這表明通過(guò)調(diào)整啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度調(diào)控這3個(gè)基因的表達(dá)水平具有重要的實(shí)踐意義。

本實(shí)驗(yàn)室前期已在工業(yè)菌株S. cerevisiaeY5中成功表達(dá)了來(lái)自休哈塔假絲酵母的木糖還原酶（XR）基因，來(lái)自熱帶假絲酵母的木糖醇脫氫酶（XDH）基因和來(lái)自Y5的木酮糖激酶（XK）基因，并建立了一套適用于Y5的轉(zhuǎn)化體系。重組釀酒酵母在以3%葡萄糖和2%木糖為底物進(jìn)行厭氧發(fā)酵時(shí)可在12 h內(nèi)將葡萄糖消耗殆盡，但木糖利用率較低，最大乙醇產(chǎn)量11.01 g/L、木糖醇產(chǎn)量2.45 g/L［13］。

本研究將來(lái)自樹(shù)干畢赤酵母（Pichia stipitis）的木糖還原酶基因XYL1和木糖醇脫氫酶基因XYL2，置于PGKp強(qiáng)啟動(dòng)子下，將來(lái)自釀酒酵母S. cerevisiaeY5的木酮糖激酶基因XKS1分別置于己糖激酶啟動(dòng)子（HXK2p）和其內(nèi)源的木酮糖激酶啟動(dòng)子（XKS1p）下。擬將不同啟動(dòng)子控制下的基因XYL1、XYL2和XKS1導(dǎo)入到發(fā)酵性能良好的S.cerevisiaeY5中，以期能夠更加高效穩(wěn)定發(fā)酵葡萄糖和木糖產(chǎn)乙醇的重組酵母菌株的目標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌（Escherichia coli）Top-10、畢赤酵母（Pichia stipitisCBS 6054）、釀酒酵母S.cerevisiaeY5（實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)利菌種，專(zhuān)利號(hào)：ZL2008-10222897.7）均為本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒pDR195、PUC18以及YIp5-kanR也均由本實(shí)驗(yàn)室保存?？寺≥d體pEASY-T1 Simple購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 大腸桿菌及轉(zhuǎn)化子用 LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，使用時(shí)可補(bǔ)加100 μg/mL氨卞青霉素作為選擇培養(yǎng)基用于篩選轉(zhuǎn)化子，37℃靜止或搖瓶振蕩培養(yǎng)。酵母菌用YPD培養(yǎng)基，30℃靜止或搖瓶振蕩培養(yǎng)。

1.1.3 酶、抗生素及試劑 試驗(yàn)所用限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。分子生物學(xué)操作所用試劑盒、Taq DNA聚合酶為天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)。氨芐抗生素與生化試劑購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司，所用化學(xué)試劑為分析純。引物及基因序列的測(cè)定均由上海英駿（Invietrogen）生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 整合載體YIp5-XRXDH的構(gòu)建 分別以表達(dá)載體pDR195-PGK-xyl1和pDR195-PGK-xyl2為模板，PCR擴(kuò)增XYL1和XYL2連同PGKp啟動(dòng)子和ADH終止子的表達(dá)原件X1、X2。再將X1、X2依次連入酵母整合載體YIp5-kanR，構(gòu)建出重組酵母染色體整合質(zhì)粒YIp5-XRXDH。

1.2.2 酵母表達(dá)載體pXKS1-H和pXKS1-X的構(gòu)建 以S. cerevisiaeY5基因組為模板，PCR擴(kuò)增HXK2p啟動(dòng)子、XKS1p啟動(dòng)子和木酮糖激酶基因XKS1。YIp5-KanR為模板擴(kuò)增篩選標(biāo)記KanR。將HXK2p啟動(dòng)子連同XKS1基因和ADH終止子的表達(dá)原件命名為X3-H；將XKS1p啟動(dòng)子連同XKS1基因和ADH終止子的表達(dá)原件命名為X3-X。將KanR、X3-H及X3-X連入PUC18載體中，分別獲得pXKS1-H和pXKS1-X表達(dá)載體。所需引物序列及酶切位點(diǎn)見(jiàn)表1。

1.2.3 重組菌株S. cerevisiaeY5-X3-1與S. cerevisiaeY5-X3-2的構(gòu)建 將整合質(zhì)粒YIp5-XRXDH線(xiàn)性化后分別與表達(dá)載體pXKS1-H和pXKS1-X通過(guò) LiAc完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化法共轉(zhuǎn)化到S. cerevisiaeY5中，涂布于含G418的YPD培養(yǎng)基上，初步篩選轉(zhuǎn)化子。采取兩步篩選驗(yàn)證方法，首先隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子，提取染色體基因組DNA，進(jìn)行X1及X2片段的PCR擴(kuò)增，篩選出YIp5-XRXDH整合成功的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)入第二步篩選；隨后提取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子中質(zhì)粒，進(jìn)行X3片段的PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步篩選出pXKS1-H或pXKS1-X轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)化子，分別命名為S. cerevisiaeY5-X3-1和S. cerevisiaeY5-X3-2。

1.2.4 木糖還原酶（XR）、木糖醇脫氫酶（XDH）和木酮糖激酶（XK）酶活的測(cè)定 粗酶液的制備以及木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶的酶活測(cè)定完全參照文獻(xiàn)［14］進(jìn)行。用Coomassie Blue法［15］測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.2.5 重組菌S. cerevisiaeY5-X3-1與S. cerevisiaeY5-X3-2代謝混合糖產(chǎn)乙醇發(fā)酵試驗(yàn) 將待發(fā)酵的宿主菌S. cerevisiaeY5和重組菌S. cerevisiaeY5-X3-1、S. cerevisiaeY5-X3-2分別接種于100 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃，150 r/min活化24 h。然后換成新鮮的YEPD液體培養(yǎng)基，于同樣條件下增殖培養(yǎng)24 h，測(cè)定其細(xì)胞含量（OD600值）。將培養(yǎng)得到的菌液離心，收集沉淀，用0.9% NaCL溶液洗滌沉淀兩次，作為發(fā)酵種子液。

將S. cerevisiaeY5、S. cerevisiaeY5-X3-1，S. cerevisiaeY5-X3-2的種子液分別接種到50 mL 1.5%葡萄糖、5%木糖的混合糖培養(yǎng)基中，發(fā)酵條件為30℃，150 r/min。發(fā)酵起初每隔4 h取樣一次，12 h后每隔12 h取樣一次，取樣量為1 mL，連續(xù)取樣120 h。發(fā)酵樣品分析葡萄糖、木糖、木糖醇、乙醇濃度。

1.2.6 發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果分析方法 糖濃度測(cè)定：采用Agilent 1260高效液相色譜儀，色譜柱Hi-plex H柱，柱溫40℃，檢測(cè)器為安捷倫示差檢測(cè)器，流動(dòng)相0.005 mol/L硫酸，流速 0.6 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL。乙醇濃度測(cè)定：Agilent7890A氣相色譜儀，色譜柱HJ-PEG-200M為 60 m×0.32 mm×0.5 μm，柱溫為120℃，進(jìn)樣量為1 μL。

2 結(jié)果

2.1 重組酵母整合質(zhì)粒YIp5-XRXDH構(gòu)建

構(gòu)建流程如（圖1）所示，分別以pDR195-PGK-xyl1和pDR195-PGK-xyl2為模板，利用設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在2 230 bp、2 250 bp處分別有明顯條帶（圖2）。亞克隆產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，X1和X2與各自PCR模板的基因序列同源性、蛋白質(zhì)同源性均達(dá)100%，克隆得到的基因X1和X2序列正確。

分別用SphI、NheI雙酶切或EagI、SphI雙酶切亞克隆產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化獲得X1、X2基因。將X1連接在YIp5-kanR的SphI與NheI位點(diǎn)，將X2連接在YIp5-kanR的EagI與SphI位點(diǎn)，構(gòu)建出重組酵母染色體整合質(zhì)粒YIp5-XRXDH。質(zhì)粒單、雙酶切驗(yàn)證結(jié)果正確（圖3）。

2.2 酵母表達(dá)載體pXKS1-H和pXKS1-X的構(gòu)建

構(gòu)建流程如圖1所示，以釀酒酵母Y5為模板擴(kuò)增HXK2p、XKS1p和XKS1基因。以YIp5-kanR為模板擴(kuò)增kanR篩選標(biāo)記。分別用EcoR I、BamH I和SalI、NdeI雙酶切pXKS1-H和pXKS1-X，分別切下2 540 bp/4 501 bp、1 702 bp/5 339 bp和2 706 bp/4513、1 702 bp/5 517 bp，質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖4）。

2.3 工業(yè)釀酒酵母S. cerevisiae Y5轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子篩選

PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子染色體基因組DNA及其質(zhì)粒，結(jié)果顯示，S. cerevisiaeY5-X3-1在2230 bp、2250 bp和2920 bp處分別有一個(gè)明顯條帶（圖5-A）；同時(shí)提取S. cerevisiaeY5-X3-2的染色體基因組DNA及質(zhì)粒pXKS1-X，PCR驗(yàn)證（圖5-B）顯示，S. cerevisiaeY5-X3-2在2230 bp、2250 bp和3086 bp處分別有一個(gè)明顯條帶。兩株重組菌株均擴(kuò)增得到大片段X1、X2、X3。亞克隆產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果表明，X1、X2和X3與各自PCR模板的基因序列同源性、蛋白質(zhì)同源性均達(dá)100%，克隆得到的基因X1、X2和X3序列正確。表明外源目的基因成功導(dǎo)入到酵母中。

2.4 重組釀酒酵母木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶酶活測(cè)定

分別測(cè)定宿主菌S. cerevisiaeY5及轉(zhuǎn)化子S. cerevisieY5-X3-1與S. cerevisiaeY5-X3-2粗酶液中木糖還原酶（XR）、木糖醇脫氫酶（XDH）和木酮糖激酶（XK）的比活力水平，結(jié)果（表2）顯示宿主菌株S. cerevi-siaeY5中基本沒(méi)有木糖還原酶和木糖醇脫氫酶酶活，木酮糖激酶的酶活水平極低。轉(zhuǎn)化子S. cerevisiaeY5-X3-1和S. cerevisiaeY5-X3-2的木糖還原酶和木糖醇脫氫酶的比活力分別為宿主菌株的160倍和78倍。說(shuō)明來(lái)源于P. stipitisCBS6054的木糖還原酶基因XYL1和木糖醇脫氫酶基因XYL2在宿主菌株S. cerevisiaeY5中得到了活性表達(dá)。此外，在Y5-X3-1菌株中，HXK2啟動(dòng)子控制下的XK顯示出相應(yīng)較高的酶活水平。

2.5 發(fā)酵生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

宿主菌和重組菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)（圖6）顯示在混合糖培養(yǎng)基中宿主菌S. cerevisiaeY5及重組菌的生長(zhǎng)情況。宿主菌生長(zhǎng)緩慢，在120 h測(cè)得其最大生長(zhǎng)量。兩株重組菌生長(zhǎng)狀況相似，且均明顯優(yōu)于宿主菌，說(shuō)明異源基因XYL1和XYL2的插入未影響重組菌的生長(zhǎng)。另外，S. cerevisiaeY5-X3-1的生長(zhǎng)狀況略?xún)?yōu)于S. cerevisiaeY5-X3-2。

2.6 代謝葡萄糖和木糖限氧共發(fā)酵試驗(yàn)

重組酵母菌S. cerevisiaeY5-X3-1、S. cerevisiaeY5-X3-2 陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子及宿主菌S. cerevisiaeY5在限氧條件下進(jìn)行葡萄糖木糖共發(fā)酵搖瓶試驗(yàn)。HPLC檢測(cè)分析發(fā)酵底物的消耗和產(chǎn)物的生成（圖7）。

重組菌在4 h內(nèi)將葡萄糖消耗殆盡后開(kāi)始利用木糖，且均在120 h內(nèi)基本將木糖代謝完畢。將木酮糖激酶基因XKS1置于已糖激酶啟動(dòng)子（HXK2p）的重組菌Y5-X3-1在96 h處測(cè)得最大乙醇產(chǎn)量24.37 g/L（圖7-B），而將此基因置于其內(nèi)源啟動(dòng)子（XKS1p）的重組菌Y5-X3-2在96 h處測(cè)得最大乙醇產(chǎn)量為21.47 g/L（圖7-C）。兩株重組菌的乙醇產(chǎn)率分別達(dá)到理論值的76%和67%。宿主菌Y5在混合糖發(fā)酵初級(jí)階段8 h處測(cè)得最大乙醇產(chǎn)量7.40g/L，同一時(shí)間點(diǎn)測(cè)其葡萄糖消耗完畢，故推斷宿主菌Y5所產(chǎn)乙醇應(yīng)全為葡萄糖發(fā)酵生成。由圖（7-A）可以看出，宿主菌也能利用少量的木糖，并且產(chǎn)生約9.02 g/L木糖醇，一般認(rèn)為在非特異性還原酶的作用下，釀酒酵母可以消耗少量的木糖。Y5-X3-1和Y5-X3-2的木糖消耗均為宿主菌的5倍，乙醇產(chǎn)量分別是宿主菌的3.3倍和2.9倍。由此說(shuō)明，木糖代謝關(guān)鍵酶基因成功導(dǎo)入釀酒酵母Y5中，并得以成功表達(dá)，其木糖代謝上游途徑已打通。

兩株重組菌經(jīng)120 h發(fā)酵，Y5-X3-1在乙醇得率方面較Y5-X3-2增加了16.1%，前者木糖醇最高濃度為10.47 g/L，后者為11.87 g/L，相比下降了13.3%（表3）。

3 討論

國(guó)內(nèi)外構(gòu)建能利用木糖產(chǎn)乙醇的釀酒酵母普遍采用將天然利用木糖真菌中的XYL1與XYL2基因轉(zhuǎn)入S. cerevisiae，重組菌株雖能利用木糖，但中間產(chǎn)物木糖醇大量積累，乙醇產(chǎn)量不高。分析原因主要是重組釀酒酵母中表達(dá)的XR和XDH所需的輔因子不平衡［16，17］。利用不同啟動(dòng)子對(duì)基因表達(dá)可以進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，使目的基因適度表達(dá)，減少由于過(guò)量表達(dá)引起的細(xì)胞內(nèi)部負(fù)擔(dān)。

用于大規(guī)模乙醇生產(chǎn)的菌株多為耐受乙醇和木質(zhì)纖維素水解液中抑制物能力較強(qiáng)，染色體組為多倍體的工業(yè)釀酒酵母菌株［18-21］。二倍體絮凝菌株S. cerevisiaeY5能夠耐受發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的較高濃度的抑制劑，具有良好的乙醇發(fā)酵性能［22，23］。本研究以S. cerevisiaeY5為宿主菌，在引入木糖代謝關(guān)鍵酶的同時(shí)過(guò)表達(dá)木酮糖激酶基因，并通過(guò)啟動(dòng)子的不同調(diào)節(jié)3個(gè)酶的酶活比例。

由于己糖激酶基因啟動(dòng)子（HXK2p）轉(zhuǎn)錄水平較XKS1基因自身啟動(dòng)子（XKS1p）較強(qiáng)［18］，因此兩株重組菌酶活顯示Y5-X3-1的木酮糖激酶酶活水平高于Y5-X3-2。對(duì)比兩株重組菌，木酮糖激酶酶活較高的Y5-X3-1在混合糖培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力不及Y5-X3-2。Jin 等［19］認(rèn)為表達(dá)過(guò)高水平的木酮糖激酶可能會(huì)降低細(xì)胞內(nèi)的ATP 水平從而影響菌體的生長(zhǎng)。

重組菌Y5-X3-1和Y5-X3-2的XR/XDH/XK比值分別約為1∶5∶4和1∶5∶2。其他相關(guān)研究結(jié)果表明，當(dāng)重組菌的XR/XDH/XK比值為1∶（≧10）∶（≧4）時(shí)，木糖醇積累最少，乙醇產(chǎn)量最多［11］。Y5-X3-1的XR/XDH/XK比值與理論值最相近，乙醇產(chǎn)量最高。

4 結(jié)論

本文將來(lái)自樹(shù)干畢赤酵母（P.stipitis）的木糖還原酶基因XYL1和木糖醇脫氫酶基因XYL2置于PGKp強(qiáng)啟動(dòng)子下,同時(shí)將來(lái)自釀酒酵母S. cerevisiaeY5的木酮糖激酶基因XKS1分別置于己糖激酶啟動(dòng)子（HXK2p）和其內(nèi)源的木酮糖激酶啟動(dòng)子（XKS1p）下。通過(guò)啟動(dòng)子的調(diào)控，實(shí)現(xiàn)XR/XDH/XK三者比值達(dá)到1∶5∶4，接近1∶（≧10）∶（≧4）的最優(yōu)比例，從而降低了副產(chǎn)物木糖醇的積累，提高了乙醇的產(chǎn)率，初步實(shí)現(xiàn)了構(gòu)建更為高效穩(wěn)定共代謝葡萄糖和木糖產(chǎn)乙醇重組釀酒菌株的目標(biāo)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Construction of Recombinant Saccharomyces cerevisiae Strains Through Expressing the Key Genes in the Xylose Metabolism Under the Control of Different Promoters for Co-fermentation Glucose and Xylose

Jin Yi Wang Zhen Mo Chunling Yang XiuShan Tian Shen
（College of Life Science，Capital Normal University，Beijing 100048）

In order to obtain a recombinant yeast strain which can co-ferment both xylose and glucose, the key genes of enzymes in the xylose metabolism were cloned and transformed intoSaccharomyces. cerevisiaeY5. TheXYL1andXYL2genes fromPichia stipitisCBS6054 were placed under thePGKp, which is a constitutive strong promoter；endogenesisXKS1gene fromS.cerevisiaeY5 was controlled byHXK2pand the native promoterXKS1p, respectively. We measured the activity of XR、XDH and XK and evaluated the xylose-fermenting abilities of the engineered strains. The highest xylulokinase activity was observed in the strain Y5-X3-1 whoseXKS1was controlled byHXK2p. The activity of enzyme ratio was 1∶5∶4 between XR, XDH and XK. Furthermore, the xylose consumption ofS.cerevisiaeY5-X3-1 was 5 times as the host strain during co-fermentation, and the highest ethanol concentration was 24.35 g/L, which correspond to 73% of the theoretical value.

Saccharomyces cerevisiaeXylose Ethanol Co-fermentation Promoter

2013-08-28

北京市教育委員會(huì)科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（KZ201310028034），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31100578）

金怡，女，碩士研究生，研究方向：微生物酶和發(fā)酵工程；E-mail：jinyikele@163.com

田沈，博士，教授，研究方向：微生物與生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化；E-mail：cnu_tianshen@sina.com