質(zhì)譜方法在過(guò)敏原研究中的應(yīng)用

趙璟源，賀艷，張?jiān)＞?，鄭文杰，宋喆，許泓

（天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300461）

過(guò)去10年，食品過(guò)敏的情況在世界范圍日益普遍。發(fā)達(dá)國(guó)家有超過(guò)20%的人受過(guò)敏性疾病的困擾[1]，美國(guó)每年約有2%～5%的人發(fā)生食品過(guò)敏，其中兒童及嬰兒的發(fā)病率較高，約為5%～8%。我國(guó)食品過(guò)敏發(fā)病率高于發(fā)達(dá)國(guó)家。中國(guó)疾控中心與食品安全所的調(diào)查表明，在15 歲～24 歲年齡段健康人群中，約有6%的人曾患有食品過(guò)敏。盡管食品過(guò)敏在兒童和成人間日益流行，但沒(méi)有應(yīng)對(duì)措施，因而在食品標(biāo)簽上標(biāo)明過(guò)敏原的存在是避免過(guò)敏患者食入潛在過(guò)敏原的最有效的途徑。已經(jīng)有行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)采用酶聯(lián)免疫方法和實(shí)時(shí)熒光PCR 方法檢測(cè)食品中過(guò)敏原成分，但存在一些不足，質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，為過(guò)敏原的研究提供了新的手段。

1 食品過(guò)敏原

1.1 食品過(guò)敏原種類

食品過(guò)敏原指那些能對(duì)特定人群產(chǎn)生免疫反應(yīng)或過(guò)敏反應(yīng)的食品中的蛋白質(zhì)。已知結(jié)構(gòu)的過(guò)敏原都是蛋白質(zhì)或糖蛋白，大部分過(guò)敏原分子量介于10 000 u～70 000 u 之間，占食品總蛋白的極小一部分，但是微量的食品過(guò)敏原蛋白即可引起嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)。蛋類、花生、牛奶、大豆、小麥、樹(shù)木堅(jiān)果、魚類和甲殼類食品是常見(jiàn)的過(guò)敏原食品。90%以上的過(guò)敏反應(yīng)由這些致敏食物引起。

1.2 過(guò)敏原發(fā)病機(jī)制

過(guò)敏原進(jìn)入機(jī)體后，會(huì)引起機(jī)體發(fā)生正常的或過(guò)度的免疫應(yīng)答，通常稱過(guò)度的免疫應(yīng)答為過(guò)敏反應(yīng)。過(guò)敏反應(yīng)分為I～I(xiàn)V 型，食品過(guò)敏為I 型過(guò)敏反應(yīng)，90 %以上是由IgE 抗體介導(dǎo)的，少數(shù)為非IgE 介導(dǎo)。在IgE介導(dǎo)的食品過(guò)敏中，當(dāng)易感人群初次攝入食品過(guò)敏原后，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)量的IgE 抗體，這種IgE 抗體具有親細(xì)胞的特征，能與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞結(jié)合，當(dāng)相同過(guò)敏原再次入侵時(shí)，與上述細(xì)胞表面的IgE 抗體特異的結(jié)合，所形成的過(guò)敏原-IgE 復(fù)合物能夠激活肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞并使之脫顆粒，然后從排除的顆粒中及細(xì)胞內(nèi)釋放一系列生物活性介質(zhì)，而引起毛細(xì)血管擴(kuò)張、血管壁通透性增加、平滑肌收縮和腺體分泌增多。在臨床上可表現(xiàn)為蕁麻疹、休克、哮喘、腹痛和腹瀉等多種癥狀[2]。

2 質(zhì)譜方法在過(guò)敏原研究

離子源和質(zhì)量分析器是MS 技術(shù)研究蛋白質(zhì)的核心?；|(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）和電噴霧電離（ESI）是最廣泛使用的軟電離手段。MALDI 和ESI 可以與各種質(zhì)量分析器聯(lián)用。目前，有4種常用的質(zhì)量分析器：四級(jí)桿（Q）、離子阱（QIT 三維離子阱/LIT 線性離子阱）、飛行時(shí)間（TOF）、傅里葉變換離子回旋共振（FTICR）質(zhì)量分析器[3]。隨著生物質(zhì)譜（MS）技術(shù)的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)和多肽分析的分辨率、靈敏度、準(zhǔn)確性、鑒定能力大為提高。質(zhì)譜的發(fā)展使得該技術(shù)可以應(yīng)用于過(guò)敏原蛋白的研究及檢測(cè)方法建立。

2.1 質(zhì)譜方法作為過(guò)敏原研究的技術(shù)

目前基于質(zhì)譜技術(shù)分析組蛋白及其翻譯后修飾主要有兩種策略：bottom-up 和top-down.Bottom-up策略通常是將提純后的組蛋白酶解成多肽，然后用液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（LC/MS/MS）分析酶解多肽，最后采用生物信息檢索分析多肽序列和修飾位點(diǎn)。Top-down 策略通常是將組蛋白直接引入到質(zhì)譜中進(jìn)行分析，通過(guò)碎片裂解技術(shù)將組蛋白裂解成多肽的碎片分子，得到蛋白質(zhì)和碎片離子的質(zhì)量，最后采用生物信息檢索推演多肽序列和修飾位點(diǎn)。常見(jiàn)的碎片離子裂解技術(shù)主要有：碰撞誘導(dǎo)解離（CID/CAD）電子捕獲解離（ECD）電子轉(zhuǎn)移解離（ETD）等[3]。通常食品中含有復(fù)雜的基質(zhì)，在進(jìn)行質(zhì)譜分析前需要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行純化。常用的純化方法有SDS-PAGE 方法和二維電泳的方法。通過(guò)考馬斯亮藍(lán)、銀染等看到蛋白質(zhì)。然后切膠，再用胰酶處理，再通過(guò)質(zhì)譜鑒定。羅春萍等結(jié)合SDS-PAGE、MALDI-TOF/MS 和Western blotting 鑒定了花生過(guò)敏原Ara h 6[4]。

質(zhì)譜法與圓二色譜的方法相結(jié)合可應(yīng)用于過(guò)敏原的過(guò)敏機(jī)制研究。Iris Lauer 對(duì)Cor a 11 的分子學(xué)特征進(jìn)行研究，SDS-PAGE 和MALDI-TOF MS 結(jié)果表明Cor a 11 的2 個(gè)潛在糖基化作用部位中的一個(gè)是糖基化的，圓二色譜表明重組和自然Cor a 11 擁有相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)。與其他幾個(gè)榛子過(guò)敏原比較致敏性，通過(guò)對(duì)65 名榛子過(guò)敏患者進(jìn)行體外測(cè)試，研究重組Cor a 11、Cor a 1、Cor a 2、Cor a 8 的IgE 致敏模式，得到結(jié)論，榛子豌豆球蛋白Cor a 11 的IgE 反應(yīng)患病率在50 %以下。與Cor a 1 相比，1 000 倍濃度的Cor a 11 可以誘導(dǎo)相似的嗜堿細(xì)胞介體釋放[5]。胡純秋等從花生中提取Ara h 2，并用SDS-PAGE 和MALDI-TOF-MS 鑒定。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、圓二色譜（CD）熒光和紫外吸收譜衡量熱處理對(duì)Ara h 2 抗原性和結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明Ara h 2 抗原性在加熱至55 ℃和70 ℃有輕微的提高，在85 ℃以上時(shí)，抗原性明顯下降，并隨溫度上升不斷下降。CD 表明熱處理后Ara h 2 二級(jí)結(jié)構(gòu)被改變。紫外吸收光譜表明除了50 ℃30 min 的樣品外，Ara h 2 在被加熱后最大吸收波長(zhǎng)均有提高。因此，得出Ara h 2 的構(gòu)象變化導(dǎo)致了抗原性的下降[6]。Lauer Iris等通過(guò)研究重組榛子過(guò)敏原，得到的蛋白利用快速蛋白液相色譜（Fast protein liquid chromatography，F(xiàn)PLC）兩步法純化，IgE 抗體反應(yīng)性被驗(yàn)證。通過(guò)N-末端測(cè)序和MALDI-TOF-MS 分析來(lái)驗(yàn)證特征。用圓二色譜和NMR 來(lái)確定二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。可利用這種重組的榛子過(guò)敏原進(jìn)行體外測(cè)試診斷，研究過(guò)敏原特征[7]。

吳海強(qiáng)等將花生總蛋白2-DE 指紋圖譜與蛋白點(diǎn)MALDI-TOF/MS 分析聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)其中共有178 個(gè)特征性蛋白點(diǎn)，并得出結(jié)論，每個(gè)蛋白斑點(diǎn)都有各自的摩爾分子量和不同的MALDI-TOF/MS 圖譜[8]。Hird H 等利用原生雙向電泳檢測(cè)榛子過(guò)敏原，用堅(jiān)果過(guò)敏患者的血清進(jìn)行免疫印跡分析，可以使有相同等電點(diǎn)和分子質(zhì)量的花生和榛子過(guò)敏原得以鑒定。通過(guò)基質(zhì)輔助激光解析/離子化質(zhì)譜法（MALDI-MS）得到這2種蛋白的分子量為4 826 u[9]。

Schmidt H 等分別用單向和雙向電泳對(duì)弗吉尼亞型花生和印尼花生的基本提取物進(jìn)行比較。通過(guò)質(zhì)譜方法，在這些提取物中發(fā)現(xiàn)了一百多種不同成分，并得到了包含目前未知片段的主要花生過(guò)敏原的高分辨率圖譜。結(jié)果表明在各種印度尼西亞花生中Ara h 1水平的下降與Ara h 2 的豐度降低有關(guān)，用單克隆抗體和過(guò)敏患者血清的Western blotting 得到相同結(jié)果[10]。

Kottapalli K R 等用雙向電泳和nESI-LC-MS/MS方法研究了從NewMexico Valencia C（NM Valencia C），Tamspan 90，Georgia Green，及NC-7 這4 個(gè)花生品種的成熟種子中分離的總種子蛋白。先用硝酸銀染色的雙向電泳得出4種花生中分別有457、516、556、530 個(gè)蛋白斑點(diǎn)，用nESI-LC-MS/MS 分析20種顯示出相對(duì)豐度差別的大量蛋白斑點(diǎn)，鑒別出14種非冗余蛋白。這些蛋白中的大部分屬于由花生球蛋白和伴花生球蛋白種子貯存蛋白以及其他過(guò)敏原蛋白組成的球蛋白。一些確定的蛋白斑點(diǎn)的表達(dá)具有品種特定性，例如，過(guò)敏原Ara h 3/Ara h 4 和伴花生球蛋白斑點(diǎn)只在Tamspan 90 和NC-7 中檢測(cè)到，而Gly1 蛋白斑點(diǎn)只在New Mexico Valencia C 和NC-7 中檢測(cè)到。表明可以利用2-DE 和nESI-LC-MS/MS 檢測(cè)特定花生過(guò)敏原的存在[11]。White B L 等用nanoLC-MS/MS 測(cè)序?qū)ㄉN皮蛋白質(zhì)組分析，來(lái)研究蛋白質(zhì)組成和潛在過(guò)敏性。在去皮的種子和種皮中總共有123 個(gè)蛋白質(zhì)被鑒定，其中83 個(gè)是兩個(gè)部分都存在的。除了38 個(gè)在種子中不存在的蛋白，種皮中含有所有已知的花生過(guò)敏原[12]。

Hebling C M 等使用使用凝膠洗脫液相組分截留電泳技術(shù)（gel-eluted liquid fraction entrapment electrophoresis，GELFREE）根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的不同，對(duì)完整蛋白質(zhì)進(jìn)行分組，并結(jié)合LC-MS/MS 平臺(tái)對(duì)原料花生進(jìn)行球蛋白組表征。這種方法提高了獨(dú)特肽標(biāo)識(shí)的數(shù)量，提供蛋白異構(gòu)體的直觀圖[13]。

2.2 質(zhì)譜方法作為過(guò)敏原檢測(cè)方法

目前過(guò)敏原的檢測(cè)方法有很多。最常用的過(guò)敏原檢測(cè)方法是實(shí)時(shí)熒光PCR 的檢測(cè)方法，以過(guò)敏原物質(zhì)的DNA 為檢測(cè)目標(biāo)，通過(guò)分析確定DNA 序列上一段核苷酸片段作為過(guò)敏原的檢測(cè)標(biāo)志[14]。盡管實(shí)時(shí)熒光PCR 方法通過(guò)NCBI 檢索能夠很好地保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，可是由于實(shí)時(shí)熒光PCR 方法的檢測(cè)目標(biāo)是DNA，而引起過(guò)敏反應(yīng)的通常是蛋白質(zhì)，在檢測(cè)中即便是檢測(cè)到樣品中含有過(guò)敏原的DNA，但并不代表該樣品中含有過(guò)敏原的蛋白質(zhì)。

以蛋白質(zhì)為檢測(cè)目標(biāo)的方法有酶聯(lián)免疫（ELISA）和試紙條方法，這些方法主要是基于抗原抗體的特異性反應(yīng)。酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法是半定量檢測(cè)方法，其檢測(cè)限（LOD）通常在。ELISA 檢測(cè)方法的局限在于與抗體結(jié)合的抗原決定簇通常研究不深入，而且有一部分是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象，因此熱加工和機(jī)械加工均有可能影響抗原決定簇，從而會(huì)導(dǎo)致ELISA 檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)假陰性的結(jié)果。質(zhì)譜技術(shù)可以是DNA 檢測(cè)方法和酶聯(lián)免疫方法的有益補(bǔ)充。

由于蛋白質(zhì)或肽段的離子化效率受很多的物理化學(xué)因素（如分子的大小，電荷數(shù)量，極性等）的影響，因此，采用MS 技術(shù)定量需要對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品作為參照物質(zhì)。依據(jù)top-down 策略，完整蛋白的直接定量是將帶多電荷離子的信號(hào)強(qiáng)度與內(nèi)源或者外源的標(biāo)準(zhǔn)相比。然而，top-down 質(zhì)譜方法的靈敏度往往因?yàn)榈鞍踪|(zhì)帶電量不同而受限。因此bottom-up 策略即鳥槍方法更多地應(yīng)用于過(guò)敏原質(zhì)譜的檢測(cè)和定量。蛋白質(zhì)組學(xué)中定量分析越來(lái)越多地應(yīng)用bottom-up 的方法。定量分析方法如DILAC，ICAT，ITRAQ 或者非標(biāo)記方法能夠用于復(fù)雜樣品中整個(gè)蛋白質(zhì)的分析[15-16]。然而上述策略適合于目標(biāo)分析物是差異表達(dá)蛋白質(zhì)。

串接質(zhì)譜的SRM 檢測(cè)方式目前為復(fù)雜樣品中目標(biāo)蛋白準(zhǔn)確定量最好的方法[17]。SRM 在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用更多地依賴于穩(wěn)定的isotopedilution（SID）方法[18]，實(shí)際SRM 和SID 不是新技術(shù)，早在70年代晚期就已經(jīng)在小分子的定量分析中使用。與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合后，得到越來(lái)越多的應(yīng)用，因此可以認(rèn)為是絕對(duì)定量的“金標(biāo)”。這種對(duì)目標(biāo)前體離子與對(duì)應(yīng)產(chǎn)物離子的監(jiān)測(cè)，避免了“蛋白水解肽段”方法大量的主要成分的干擾，使定量的重現(xiàn)性得以提高?；谫|(zhì)譜的絕對(duì)定量方法需要用到內(nèi)源參考肽段。比如：用LC-MS/MSSRM 檢測(cè)食品中花生的Ara h 2 和Ara h 3/4 蛋白質(zhì)時(shí)，選用亮氨酸-腦啡肽作為內(nèi)源[19]。張偉等確定酪蛋白的3 個(gè)不同亞型的特征肽段分別為：β 酪蛋白的特征性肽段為：AVPYPQR 和VLPVPQK，αs1 酪蛋白的特征肽段為YLGYLEQLLR 和FFVAPFPEVFGK，αs2 酪蛋白的特征性肽段為：ALNEINQFYQK 和FALPQYLK[20]。

Parisa Ansari 等Lock Stephen J.等通過(guò)提取榛子蛋白Cor a 8、Cor a 9、Cor a 11，選定榛子特有的肽段[21-22]。Chassaigne H 等開(kāi)發(fā)了毛細(xì)管液相色譜（capillary LC）與納升電噴霧四極桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（nano-ESI QTOF MS/MS）結(jié)合的方法，來(lái)確定那些可以作為花生過(guò)敏原標(biāo)記的肽，著重確定主要花生過(guò)敏原Arah1，Ara h 2，和Ara h 3。所得的分析數(shù)據(jù)與de novo 測(cè)序組合，進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，并用于以上3種花生過(guò)敏原的大量序列標(biāo)簽的鑒定。通過(guò)分析花生原料和烤花生，可以鑒定作為特定過(guò)敏原蛋白標(biāo)記的5種花生特定序列標(biāo)簽。對(duì)Arah1，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)標(biāo)記肽鏈，即VLEENAGGEQEER（m/z 786.88，charge 2+）和DLAFPGSGEQVEK （m/z 688.85，charge 2+）；對(duì)Ara h 2，發(fā)現(xiàn)一個(gè)滿足所需條件，為RQQWELQGDR（m/z 439.23，charge 3+）；對(duì)Ara h 3，特異性的肽鏈?zhǔn)荢PDIYNPQAGSLK （m/z 695.35，charge 2+）和SQSENFEYVAFK（m/z 724.84，charge 2+）。其他的肽鏈已經(jīng)被提出作為食品加工的標(biāo)記[23-25]。

質(zhì)譜方法在開(kāi)發(fā)成為過(guò)敏原檢測(cè)方法過(guò)程中需要考核質(zhì)譜方法在不同的食品基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)，回收率，檢測(cè)低限，定量限等指標(biāo)。紅葡萄酒在澄清過(guò)程中需要加入酪蛋白作為澄清劑，紅葡萄酒含有大量的丹寧等鞣質(zhì)，傳統(tǒng)蛋白質(zhì)提取方法（超濾、透析、有機(jī)溶劑沉淀等）用于葡萄酒時(shí)回收率只有20%～30%，而十二烷基硫酸鉀（KDS）法、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）法提取后蛋白仍需要去除丹寧和兩性解電質(zhì)，工作量大，分析通量低，蛋白質(zhì)的回收率很低[26-28]。交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮（PVPP）能夠有效去除丹寧，結(jié)果表明用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析酪蛋白的回收率提高到80%以上，檢出限達(dá)10 μg/L。冰激淋中往往會(huì)添加花生作為風(fēng)味物質(zhì)。含有各級(jí)別花生蛋白的冰淇淋樣品可用50 kDa 的超濾膜可有效提高Ara h 1 回收率，低至10 mg/kg 的Ara h 1 可被反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（RPLC/MS/MS）法常規(guī)檢測(cè)[23-24]。類似的方法應(yīng)用于黑巧克力作為模型食品基質(zhì)的花生過(guò)敏原研究，預(yù)提取消化（20 mg/kg）比后提取消化（50 mg/kg）顯示出更好的檢出限。通過(guò)三重四級(jí)桿和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）可將檢出限進(jìn)一步減少到10 mg/kg。提取技術(shù)的改善結(jié)合提取的巧克力的數(shù)量增加（1 g），可將檢出限提高到2 mg/kg 花生蛋白[29]。大米脆皮和巧克力相關(guān)小吃作為模型食品基質(zhì)，開(kāi)發(fā)了基于過(guò)敏原蛋白生物標(biāo)志物肽段的液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（LC-ESIMS-MS）檢測(cè)方法來(lái)確定并定量食品中的花生過(guò)敏原。結(jié)果表明此方法對(duì)Ara h 2 和Ara h 3/4 有良好的檢出限，分別是5 μg/g 和1 μg/g，此類食品中花生蛋白線性在10 μg/g ～200 μg/g 范圍。通過(guò)分析樹(shù)木果仁（杏仁、山核桃、榛子、核桃）和食品成分如牛奶、大豆、巧克力、玉米片、米制脆皮，證明了這項(xiàng)方法的選擇性[30]。Careri M 等開(kāi)發(fā)了從早餐谷物中分離痕量花生過(guò)敏原Ara h 3/4 的選擇性免疫磁珠提取步驟，并結(jié)合了微波輔助蛋白質(zhì)提取和LC-ESI-IT-MS/MS 的方法。通過(guò)蛋白A 包被磁珠輔助，抗Ara h 3/4 單克隆抗體作為篩選捕獲分子。LC-ESI-IT-MS/MS 得到的檢測(cè)限為3 mg/kg，另外，明顯的抑制基質(zhì)效應(yīng)表明抗體包被磁珠能對(duì)早餐麥片中的Ara h 3/4 蛋白進(jìn)行有效的選擇性捕捉[31]。

Bignardi C 等在利用液相色譜電噴霧線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜（LC-ESI-LIT-MS/MS）檢測(cè)麥片和餅干中花生及其他堅(jiān)果類過(guò)敏原。此方法可對(duì)麥片和餅干中5種堅(jiān)果過(guò)敏原（Ana o 2，腰果；Cor a 9，榛子；Pru 1，扁桃仁；Ara h 3/4，花生；Jug r 4，胡桃）同時(shí)分析。在此過(guò)程中，從峰值形狀、分離度、分析時(shí)間和選擇性幾方面比較填C18 充柱和硅整體柱的性能。C18 填充柱表現(xiàn)出更高的性能，得到基質(zhì)良好匹配標(biāo)定曲線，檢測(cè)極限在14 mg/kg ～55 mg/kg 范圍。回收率在（76±4）%到（94±3）%范圍內(nèi)，RSD ＜15%[32]。

對(duì)花生或者含有花生的食品進(jìn)行熱加工（例如烘焙）會(huì)引起復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，從而改變花生蛋白的結(jié)構(gòu)構(gòu)象，阻礙利用免疫化學(xué)的方法對(duì)過(guò)敏原的精確檢測(cè)，但對(duì)質(zhì)譜方法檢測(cè)過(guò)敏原沒(méi)有影響。Hebling C M等改變了傳統(tǒng)的花生蛋白提取方法，包括蛋白變性劑和增溶劑。通過(guò)SDS-PAGE 和Western blot 對(duì)原料及烘焙花生提取物進(jìn)行定量表征分析，確定總蛋白回收率有所提高，并為Ara h 1，Ara h 3 的結(jié)合提供了證據(jù)，較輕程度的Ara h 2 在烘焙后形成高摩爾分子量的蛋白復(fù)合物。用HPLC-MS/MS 對(duì)花生裂解物中的過(guò)敏原相對(duì)定量，將原料和烘焙花生對(duì)MS 有差別反應(yīng)的過(guò)敏原肽段作為熱變性的候選目標(biāo)[33]。用HPLC-MS/MS 鑒定賴氨酸修飾的美拉德糖基化終末產(chǎn)物，確定了在烘焙花生品種中羧甲基賴氨酸（CML）、羧乙基賴氨酸（CEL）和pyrraline（Pyr）對(duì)Ara h 1 及Ara h 3 胰蛋白酶消化肽段的蛋白質(zhì)修飾[34]。

此外，CareriM 等基于ICP-MS，通過(guò)使用銪標(biāo)記的抗體，檢測(cè)低量的花生（低至接近2 mg 花生/千克谷物基質(zhì)）。富含蛋白的原料缺少可檢測(cè)的交叉反應(yīng)，證明了選擇性[35]。CareriM 等選取巧克力大米脆皮點(diǎn)心作為食品基質(zhì)，比較銪標(biāo)記ICP-MS 免疫法與LC/ESI-MS/MS 在花生過(guò)敏原檢測(cè)方面的性能。ICP-MS 檢測(cè)Ara h 2 和Ara h 3/4，檢測(cè)限分別為2.2 μg/g 和5 μg/g，回收率范圍是（86±18）%到（110±4）%，線性范圍是5 μg/g～50 μg/g。LC/MS/MS 方法得到Ara h 3/4 和Ara h 2 的檢出限分別是1 μg/g 和5 μg/g，表現(xiàn)明顯的高值，得到線性范圍為10 μg/g～200 μg/g，RSD ＜10%表明良好的精度[36]。

3 結(jié)語(yǔ)

食品過(guò)敏在兒童和成人間日益流行，但沒(méi)有措施應(yīng)對(duì)，避免接觸是主要的治療模式，因此，研究人員必須克服障礙，處理復(fù)雜食品基質(zhì)并快速準(zhǔn)確確定過(guò)敏原的存在。質(zhì)譜新技術(shù)的發(fā)展使得十年前十分復(fù)雜的生物樣品分析能在十幾分鐘得以完成，生物大分子研究的需要一直是質(zhì)譜新技術(shù)和新儀器發(fā)展的動(dòng)力之一。作為定性和定量的有力分析工具，質(zhì)譜技術(shù)在過(guò)敏原的研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。

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