實(shí)驗(yàn)室高效液相色譜儀的管理與使用維護(hù)

鄒月利，徐雅琴，白靖文，趙李霞

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 理學(xué)院， 哈爾濱 150030)

隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，高效液相色譜(HPLC)作為一種具有高靈敏度、高選擇性和高效快速分離的檢測(cè)技術(shù)得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，現(xiàn)已成為我國(guó)高等農(nóng)業(yè)院?；瘜W(xué)化工專業(yè)應(yīng)用最廣泛的分析方法［1］。它既能用于微量組分的分析測(cè)定，又能用于大量的制備分離，其應(yīng)用范圍已超過(guò)其他各種分離檢測(cè)方法，尤其在生化醫(yī)藥樣品的分析、分離方面更能充分發(fā)揮特長(zhǎng)，目前廣泛應(yīng)用于食品安全、化學(xué)分析、環(huán)境科學(xué)、農(nóng)藥殘留和石油化工等領(lǐng)域［2］。

高效液相色譜儀的科學(xué)管理和正確使用維護(hù)，是獲得良好色譜分離效果和延長(zhǎng)儀器使用壽命的前提和基礎(chǔ)?；瘜W(xué)實(shí)驗(yàn)中心于2012年12月對(duì)所有大型精密儀器設(shè)備實(shí)施網(wǎng)上預(yù)約共享管理模式，已經(jīng)取得了良好的運(yùn)行效果。雖然液相色譜儀的種類繁多，但是它們的管理方法與使用維護(hù)是一致的。本文結(jié)合對(duì)該實(shí)驗(yàn)室Agilent 1100高效液相色譜儀十幾年的管理和使用經(jīng)驗(yàn)，較詳細(xì)地介紹了高效液相色譜儀在日常管理和使用維護(hù)等方面的一些體會(huì)，希望與同行們共享［3－4］。

1 管理與維護(hù)

化學(xué)實(shí)驗(yàn)中心在液相色譜儀的管理上，要求所有用戶在使用儀器前必須仔細(xì)閱讀操作流程，按具體要求進(jìn)行操作。本科生一律在指導(dǎo)教師的陪同下方可使用，不得單獨(dú)操作。

1.1 流動(dòng)相

1)所用流動(dòng)相必須經(jīng)0.45 μm微孔濾膜真空抽濾2～3次，然后用超聲儀超聲45～60 min后，方可作為流動(dòng)相使用［5］。

2)甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑必須為色譜純，當(dāng)用酸或者堿來(lái)調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值時(shí)，范圍一定不能超過(guò)2～7.5。水則必須為去離子水，使用期限不得超過(guò)2 d，逾期則要重新配制。

3)流動(dòng)相瓶口不準(zhǔn)用密封帶封死，以保證內(nèi)外壓力相等。不要隨便更換流動(dòng)相接口，A瓶(棕色)固定為水，B瓶(白色)固定為甲醇或乙腈;流動(dòng)相的流速不要超過(guò)3.0 mL/min。

4)流動(dòng)相禁止使用氯仿、三氯(代)苯、亞甲基氯、四氫呋喃、甲苯等;慎重使用四氯化碳、乙醚、異丙醚、丙酮、甲基環(huán)己胺等，以免造成對(duì)柱塞密封圈的腐蝕。

5)當(dāng)有緩沖鹽做流動(dòng)相時(shí)，緩沖溶液與有機(jī)溶劑互相轉(zhuǎn)換前一定要用5 甲醇清洗泵，防止鹽在有機(jī)相中結(jié)晶損壞泵中各組件。緩沖溶液的濃度不能高于0.5 mol/L，盡量不超過(guò)該色譜柱的pH范圍。Cl－的濃度要小于0.1 mol/L(防止腐蝕流路)。高濃度的緩沖鹽會(huì)縮短密封墊和活塞的使用壽命，長(zhǎng)時(shí)間使用0.1 mol或更高濃度的緩沖液時(shí)，必須用10 異丙醇溶液從泵的背面沖洗掉所有可能存在的結(jié)晶，從而保護(hù)柱塞桿和密封墊。用后的異丙醇經(jīng)0.45 μm(或0.22 μm)濾膜過(guò)濾后可反復(fù)使用 2 ～3 次［6－7］。

6)當(dāng)泵的壓力上限超過(guò)6 000 psi時(shí)，應(yīng)及時(shí)檢查和更換泵頭過(guò)濾白頭和保護(hù)柱芯。

1.2 排氣泡

1)當(dāng)擰松快速清洗閥時(shí)不宜擰得過(guò)松，一般擰松2圈左右即可，擰得過(guò)松流動(dòng)相容易從清洗閥部位流進(jìn)泵頭中引起報(bào)警。

2)使用快速清洗閥時(shí)，只能一個(gè)一個(gè)通道地排氣泡，不得將幾個(gè)通道同時(shí)按比例排氣泡，因?yàn)楸壤y的快速切換易導(dǎo)致?lián)p壞。

1.3 自動(dòng)進(jìn)樣器

建議用甲醇∶水=1∶1的溶液洗針，同時(shí)每天洗針前要檢查一下洗針瓶中是否有洗液(50 甲醇)。

1.4 樣品處理

測(cè)定的樣品或標(biāo)樣在流動(dòng)相中一定要易溶，否則進(jìn)樣后會(huì)結(jié)晶造成定量不準(zhǔn)確或堵塞色譜柱。最好使用流動(dòng)相溶解樣品，樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液在進(jìn)樣前必須用0.45 μm(或 0.22 μm)濾膜(有機(jī)膜或者水膜)過(guò)濾，除去微粒雜質(zhì);樣品中一般不得含有鹽類及強(qiáng)酸、強(qiáng)堿性等物質(zhì)?？梢允褂妙A(yù)處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)［8］。

1.5 色譜柱

使用自帶色譜柱，則應(yīng)把換下的色譜柱用堵頭(無(wú)孔)及時(shí)密封。用完后需把實(shí)驗(yàn)室原來(lái)的色譜柱安裝好。換柱必須在有流動(dòng)相流出的情況下進(jìn)行，以免空氣進(jìn)入色譜柱。儀器長(zhǎng)時(shí)間不用，每個(gè)泵通道和整個(gè)流路一定要用甲醇沖洗后保存，以免結(jié)晶或造成污染［9］。

1.6 檢測(cè)器

1)檢測(cè)器的紫外或可見(jiàn)燈在長(zhǎng)期打開(kāi)的情況下，一定要保證有溶液流經(jīng)檢測(cè)池。若不需要做樣，可設(shè)置一個(gè)較低的流速(如0.05 mL/min)或關(guān)閉燈的電源。

2)檢測(cè)器的燈一般要在流通池有溶液連續(xù)流動(dòng)幾分鐘后才打開(kāi)，如果流動(dòng)池中有氣泡，則會(huì)提示漂移過(guò)大無(wú)法通過(guò)自檢和校正。

3)檢測(cè)器的氘燈或鎢燈不要經(jīng)常開(kāi)關(guān)，每開(kāi)關(guān)一次燈的壽命約損失30 h。若儀器經(jīng)常使用，可幾天開(kāi)關(guān)燈一次。

4)清洗檢測(cè)池時(shí)可以在不接柱子的情況下，用100 異丙醇沖洗整個(gè)流路。如果還不行，同法用10 或5 的稀硝酸沖洗，大約45～60 min，最后用水沖干凈。

1.7 實(shí)驗(yàn)結(jié)束

1)實(shí)驗(yàn)完畢立即清理操作臺(tái)面，打掃室內(nèi)衛(wèi)生，拖干凈地面，關(guān)好門窗。

2)如實(shí)做好實(shí)驗(yàn)登記。若機(jī)器出現(xiàn)異常，請(qǐng)勿擅自拆開(kāi)機(jī)器，應(yīng)及時(shí)通知儀器管理人員。使用液相色譜儀需提前預(yù)約，每次使用不準(zhǔn)超過(guò)3 d，如繼續(xù)使用則應(yīng)再次進(jìn)行網(wǎng)上預(yù)約。

2 操作流程

2.1 開(kāi)機(jī)步驟

1)打開(kāi)計(jì)算機(jī)后自動(dòng)彈開(kāi)＜CAG Bootp server＞→菜單→通信成功。

2)打開(kāi)色譜儀開(kāi)關(guān)，進(jìn)入在線工作站。(紅色:未就緒)

3)預(yù)熱30 min即可。(黃→未就緒，綠→已就緒，藍(lán)→采集數(shù)據(jù)，紅→報(bào)警)

4)設(shè)置泵。點(diǎn)擊＜泵＞＜檢測(cè)器＞開(kāi)關(guān)，左鍵點(diǎn)擊＜泵＞→＜Solvent bottles＞→＜Solvent Bottles Fillng:Instrument 1＞設(shè)置每瓶中實(shí)際液體量、最低液體量及瓶容量。

5)排氣泡。若新?lián)Q流動(dòng)相或長(zhǎng)時(shí)間沒(méi)開(kāi)機(jī)，應(yīng)向左旋開(kāi)排氣閥，逐個(gè)流動(dòng)相瓶排氣泡，排氣時(shí)應(yīng)逐漸升高流速(1～2 mL/min)，再逐漸降低流速。(1)在對(duì)話框中點(diǎn)擊相應(yīng)瓶A、B、C、D圖標(biāo)→＜Set up Pump… ＞。(2)出現(xiàn) ＜Set up Pump:Instrument 1＞→設(shè)置＜Flow＞流速為1.0和瓶B、C、D的百分比(例如:A為100、B為0、C為0、D為0)即排A內(nèi)的空氣){＜Pressure Limits＞(壓力)0～200之間;＜Timetable＞(設(shè)置梯度洗脫)。}(3)改變流速為1.5→OK!(當(dāng)沒(méi)有氣泡即洗脫完畢，向右旋關(guān)閉排氣閥，最后將流速調(diào)至使用流速——大約1.0 mL/min。)依次排B、C、D的氣泡。

6)編輯檢測(cè)方法。(1)首先編輯方法前將排氣閥門關(guān)閉，將流速逐漸降至1.0 mL/min。(2)點(diǎn)擊＜Method＞→ ＜Edit Entire Method＞。(3)彈出對(duì)話框 ＜Edit Method:Instrument 1＞a方法信息;b參數(shù)設(shè)置(可設(shè)置流量、波長(zhǎng)、溶劑配比);c數(shù)據(jù)分析、報(bào)告處理(一般不選);d運(yùn)行時(shí)間表。(4)點(diǎn)擊＜OK＞進(jìn)入＜Method Comments＞，可輸入實(shí)驗(yàn)名稱，也可不選，在后面也會(huì)提示輸入。

7)參數(shù)設(shè)定。點(diǎn)擊＜OK＞進(jìn)入?yún)?shù)設(shè)定(根據(jù)文獻(xiàn)或?qū)嶒?yàn)方法設(shè)定)。(1)＜Control＞(流速):一般為1～2 mL/min。(2)＜Solvents＞(溶劑名稱及配比)。(3)＜Presswre Limits＞(壓力限)Max:300 bar(壓力保護(hù)限，默認(rèn));Min:0bar。(4)＜Timetable＞(洗脫梯度)一般為:一種溶劑配比遞增或遞減。(5)點(diǎn) Display選擇顯示方式。(6)點(diǎn)＜OK＞→＜VWD Signal:Instrument 1＞(檢測(cè)器設(shè)置)對(duì)話框，＜Wavelength＞(波長(zhǎng))，＜Peakiwidth＞(檢測(cè)器響應(yīng)時(shí)間):默認(rèn)為＞0.1 min(2 s)。(7)點(diǎn)擊 ＜OK＞→ ＜Run Time Checklist:Instrument 1＞對(duì)話框，選中＜Data Aequistion＞和＜Standard Data Analysis＞。(8)點(diǎn)擊 ＜OK＞(存儲(chǔ)檢測(cè)方法):點(diǎn)＜Save Method as＞進(jìn)入對(duì)話框，可輸入名稱和注釋，也可不輸，然后點(diǎn)＜OK＞結(jié)束方法存儲(chǔ)。

8)基線調(diào)節(jié)。(1)點(diǎn)擊界面左下角“三箭頭”顯示＜Online Plot＞對(duì)話框，觀察基線是否平穩(wěn)(波動(dòng)在0.05個(gè)單位之間)＜Adjust＞(復(fù)位)，＜Balance＞(強(qiáng)制使基線歸零)。(2)點(diǎn)擊＜Change…＞(調(diào)節(jié)):基線走速(x軸)、吸收單位(y軸)、圖表顯示曲線數(shù)量，點(diǎn)＜OK＞結(jié)束進(jìn)樣前設(shè)置。

9)樣品信息。(1)點(diǎn)擊＜Run Method＞(運(yùn)行方法)→ ＜Simple Info… ＞ → ＜Sample info:instrument 1＞:＜Operator Name＞(操作者姓名)、＜Data File＞中選＜Manual File Name＞:(輸入文件名)(必須每次輸入新名，否則覆蓋前一次測(cè)試結(jié)果)，Subdirectory:(文件存儲(chǔ)名)，Simple Name:(樣品名)，Simple Amount:(進(jìn)樣量)，點(diǎn)＜OK＞結(jié)束樣品信息輸入。

10)開(kāi)始進(jìn)樣。進(jìn)樣量一般5～25 μL。(儀器配有自動(dòng)進(jìn)樣器)。

11)停止采樣。峰出完后按＜F8＞或者＜stop＞停止(也可在＜Run control＞下拉菜單中關(guān)閉)，自動(dòng)出現(xiàn)圖表?？芍苯哟蛴?，也可進(jìn)行峰型優(yōu)化后再打印。

12)峰優(yōu)化。打開(kāi)＜o(jì)ffline＞(離線)，點(diǎn)擊＜File＞→＜Load signal＞調(diào)出文件(或者點(diǎn)擊界面圖標(biāo)打開(kāi)):(1)打開(kāi)文件保存的所在位置。(2)點(diǎn)擊＜Graphics＞→＜Signal Options…＞可以進(jìn)行優(yōu)化處理。(3)選擇＜Autoscale＞可以進(jìn)行自動(dòng)譜圖優(yōu)化。(4)點(diǎn)擊＜Interqration＞→＜Interqration Event…＞進(jìn)行人為峰篩選。(5)設(shè)置峰高域和峰面積域進(jìn)行峰的篩選。(6)退出峰優(yōu)化。

13)打印報(bào)告:(1)點(diǎn)擊＜Report＞→＜Specfy Report…＞進(jìn)行打印格式和內(nèi)容設(shè)置。(2)選擇＜Printer＞為直接打印，選擇＜Screen＞為顯示到屏幕后再打印。選中＜File＞可選擇文件存儲(chǔ)格式(File Type)，一般為.TXT格式，其他項(xiàng)為打印內(nèi)容可選項(xiàng)。(3)點(diǎn)擊＜Report＞→＜Print Report＞打印報(bào)告［10］。

2.2 關(guān)機(jī)步驟

將手動(dòng)進(jìn)樣器扳手扳上去，拔出進(jìn)樣器(自動(dòng)進(jìn)樣器除外);停止檢測(cè)器和泵，退出色譜工作站;關(guān)閉液相色譜儀電源，關(guān)閉計(jì)算機(jī)。

3 結(jié)束語(yǔ)

以上介紹了液相色譜儀的日常管理維護(hù)和操作流程。分析工作者在實(shí)際工作中要管理和使用好儀器，使用過(guò)程中必須對(duì)儀器進(jìn)行認(rèn)真觀察和仔細(xì)分析。只有合理地使用、維護(hù)和保養(yǎng)好儀器，在出現(xiàn)異常時(shí)認(rèn)真分析產(chǎn)生異常的原因，對(duì)可能出現(xiàn)故障的部位作出正確的判斷和適當(dāng)?shù)奶幚?，才能使液相色譜儀更好地為實(shí)驗(yàn)教學(xué)和科研提供服務(wù)［11－12］。

［1］于世林.高效液相色譜方法及應(yīng)用［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2001:1－4.

［2］朱良漪，孫亦梁，陳耕燕.分析儀器手冊(cè)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2000:495－495.

［3］項(xiàng)曉慧，阮慧，李五一.高校大型儀器共享管理系統(tǒng)建設(shè)的探討與實(shí)踐［J］.實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2011，28(1):196－199.

［4］鞏克民，林銳，季宏建.高效液相色譜的優(yōu)化與維護(hù)［J］.分析儀器，2012(6):96－98.

［5］嚴(yán)勁，方炯，盧皖琴.高效液相色譜的管理和維護(hù)［J］.醫(yī)療裝備，2010，23(4):74－76.

［6］高惠玲，何予，李曉林.平臺(tái)式、協(xié)會(huì)式相結(jié)合構(gòu)建精密儀器管理網(wǎng)絡(luò)［J］.實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2011，30(2):180－182.

［7］張燕婉，孟憲敏.HPLC使用中常見(jiàn)問(wèn)題及對(duì)策［J］.中國(guó)醫(yī)學(xué)裝備，2006，3(4):31－33.

［8］吳少敏，張雅芝，殷博昊.高效液相色譜的使用與維護(hù)［J］.實(shí)驗(yàn)室科學(xué)，2011，14(3):183－186.

［9］蔡曉慶，金輝樂(lè)，楊培潔，等.大型儀器管理人員工作交接的實(shí)踐與探討［J］.現(xiàn)代科學(xué)儀器，2011(6):157－159.

［10］富玉，陳能武.高效液相色譜的原理及研究進(jìn)展［J］.中國(guó)測(cè)試技術(shù)，2007，33(3):36－40.

［11］張燕婉，汪劭婷.液相色譜技術(shù)在定量分析中的應(yīng)用［J］.實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理，2007，24(10):25－28.

［12］冀斌，高靜，顧文斌，等.淺談高等中醫(yī)藥院校大型儀器管理的實(shí)踐與探索［J］.實(shí)驗(yàn)室研究與探索，2011，30(8):402－404.