超突變細(xì)胞在進(jìn)化工程中的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用

欒國(guó)棟， 蔡 真， 李 寅

中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京100101

微生物細(xì)胞性能的改造和提高是現(xiàn)代工業(yè)生物技術(shù)的核心問(wèn)題，對(duì)生物煉制和生物經(jīng)濟(jì)發(fā)展有著重要意義［1～3］。進(jìn)化工程是改造微生物細(xì)胞各種復(fù)雜生理表型的主要策略和手段。盡管進(jìn)化工程新理論、新技術(shù)和新工具的開(kāi)發(fā)已取得了巨大的進(jìn)展和成果，但是誘變篩選［4］、連續(xù)馴化［5，6］和組合工程［7］等現(xiàn)行各種技術(shù)手段仍存在著不同程度的進(jìn)化效率低、對(duì)人工介入依賴性強(qiáng)、連續(xù)性差的問(wèn)題和缺陷［8］。近年來(lái)，生物技術(shù)領(lǐng)域?qū)Τ蛔兾⑸锛?xì)胞的認(rèn)識(shí)和應(yīng)用為進(jìn)化工程的發(fā)展指明了新的方向。通過(guò)設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)人工可控的微生物細(xì)胞超突變系統(tǒng)，可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)便捷的胞內(nèi)自動(dòng)誘變，推動(dòng)完成真正高效、連續(xù)、自動(dòng)化的微生物菌株選育，極大地提高細(xì)胞性能改造的效率和效果。本文將對(duì)超突變細(xì)胞的產(chǎn)生機(jī)制、構(gòu)建策略及其在進(jìn)化工程和生物技術(shù)領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)行概述，并探討其未來(lái)發(fā)展的可能方向。

1 進(jìn)化工程

進(jìn)化工程(evolutionary engineering)是一種模擬自然界進(jìn)化中的變異－選擇過(guò)程，通過(guò)人工選擇實(shí)現(xiàn)微生物的定向進(jìn)化，篩選獲得優(yōu)良菌株的育種技術(shù)。進(jìn)化工程通過(guò)對(duì)基因組突變的選擇和積累，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞表型的定向改造，其應(yīng)用并不依賴于對(duì)菌株遺傳背景的認(rèn)識(shí)，因此特別適合對(duì)反應(yīng)機(jī)制不清楚或有大量基因產(chǎn)物參與的復(fù)雜生理表型的改造［6，9］。

變異與選擇是進(jìn)化的兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。變異是指遺傳型的改變引發(fā)表型的改變，在特定的選擇壓力下表現(xiàn)為個(gè)體間適應(yīng)性的差異;選擇是指在特定選擇壓力下對(duì)微生物細(xì)胞抑制性培養(yǎng)，造成細(xì)胞間的生存競(jìng)爭(zhēng)，使菌群從遺傳到表型向著特定方向變化。進(jìn)化工程實(shí)際操作中還包括篩選的步驟，即在菌群進(jìn)化的最終階段從培養(yǎng)液中存在的不同突變體中精選出最符合需要的菌株。為了獲得具有理想表型的工業(yè)微生物菌株，通常要進(jìn)行反復(fù)的“變異－選擇－篩選”流程，即以前一輪進(jìn)化獲得的優(yōu)良菌株為出發(fā)菌進(jìn)行下一輪進(jìn)化，實(shí)現(xiàn)表型的連續(xù)改良［10，11］。

變異是進(jìn)化工程的基礎(chǔ)，微生物菌群遺傳型和表型的多樣性從根本上決定最終是否能獲得性能得到提高的菌株。傳統(tǒng)進(jìn)化工程技術(shù)通過(guò)連續(xù)傳代來(lái)積累基因組復(fù)制過(guò)程中的隨機(jī)突變，但是基因組復(fù)制過(guò)程中自然突變率極低［12～14］，極大地限制了進(jìn)化工程的效率;為了提高基因組復(fù)制突變率，在菌株改造過(guò)程中會(huì)使用各種理化誘變劑處理細(xì)胞，引發(fā)DNA復(fù)制錯(cuò)誤，加快突變產(chǎn)生，但是誘變劑的使用會(huì)對(duì)細(xì)胞造成極大傷害，而且容易使細(xì)胞對(duì)特定誘變劑產(chǎn)生抗性。近年來(lái)又出現(xiàn)了以隨機(jī)敲除和隨機(jī)過(guò)量表達(dá)、人工轉(zhuǎn)錄因子工程、全局轉(zhuǎn)錄機(jī)器工程、核糖體工程和基因組改組為代表的多種新型進(jìn)化工程技術(shù)，能夠高效地?cái)_動(dòng)復(fù)雜的細(xì)胞生理與代謝網(wǎng)絡(luò)，在菌群中引入多樣性，為表型篩選提供材料［7］。但其實(shí)施過(guò)程依賴于遺傳操作，需要反復(fù)的人工操作，降低了整個(gè)進(jìn)化工程的效率和連續(xù)性。

理想的進(jìn)化工程技術(shù)應(yīng)該同時(shí)具備過(guò)程的連續(xù)性和進(jìn)化的高效性，也即需要進(jìn)化體系中的微生物細(xì)胞群體能夠不依賴于人工介入就可以迅速地產(chǎn)生遺傳多樣性，并在篩選壓力下完成適應(yīng)性進(jìn)化。具有較高基因組復(fù)制突變率的超突變細(xì)胞可以充分滿足這一要求，并在進(jìn)化工程領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。

2 超突變細(xì)胞的產(chǎn)生與構(gòu)建

2.1 超突變細(xì)胞的產(chǎn)生機(jī)制

超突變細(xì)胞是指基因組復(fù)制突變率較高，DNA復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生大量隨機(jī)突變的細(xì)胞。正常情況下，微生物細(xì)胞DNA復(fù)制保真性極高，堿基突變率大約為 10－10～ 10－9/復(fù)制［12～14］。DNA復(fù)制的高度精確性保證了遺傳信息的穩(wěn)定傳遞和物種性狀的穩(wěn)定遺傳，在穩(wěn)定環(huán)境下有利于生物種群有效保持其經(jīng)過(guò)自然選擇優(yōu)化過(guò)的環(huán)境適應(yīng)性［12，15］，這種高度精確性是由復(fù)雜的、多層次的保真機(jī)制來(lái)維持的，主要包括堿基選擇、3'→5'外切校正、甲基化介導(dǎo)DNA錯(cuò)配修復(fù)(MMR)和DNA 損傷修復(fù)等［14，16，17］。DNA 聚合酶對(duì)堿基的正確選擇是復(fù)制準(zhǔn)確性的第一道保證，也是最根本的保證，只有正確配對(duì)的堿基對(duì)(A-T/G-C)才能滿足DNA聚合反應(yīng)時(shí)聚合酶生化與結(jié)構(gòu)上的要求，因此保證了整個(gè)反應(yīng)的高度準(zhǔn)確性，以大腸桿菌中最主要的DNA聚合酶DNA PolⅢ為例，其核心酶體催化反應(yīng)過(guò)程中堿基錯(cuò)配概率僅為10－5～10－4。而錯(cuò)配一旦發(fā)生，其帶來(lái)的聚合酶復(fù)合物構(gòu)型變化會(huì)終止反應(yīng)，隨即聚合酶中具有3'→5'外切酶活性的ε亞基會(huì)立即將錯(cuò)誤堿基切除并重啟反應(yīng)，3'→5'外切校正將DNA復(fù)制的保真性提高了2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。MMR系統(tǒng)是相對(duì)獨(dú)立于DNA聚合過(guò)程以外的復(fù)制錯(cuò)誤校正系統(tǒng)，該系統(tǒng)發(fā)揮作用通常依賴于Dam甲基化機(jī)制。當(dāng)DNA復(fù)制堿基錯(cuò)誤配對(duì)形成時(shí)，MMR系統(tǒng)會(huì)迅速識(shí)別配對(duì)錯(cuò)誤，并根據(jù)新鏈/舊鏈Dam甲基化程度的差異，將新生鏈上由錯(cuò)誤堿基開(kāi)始的一段序列切除。大腸桿菌中由MutS、MutL、MutH在內(nèi)的一系列功能元件參與的MMR機(jī)制將DNA復(fù)制保真性提高了1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。除了對(duì)DNA復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的錯(cuò)誤進(jìn)行識(shí)別和校正以外，對(duì)胞內(nèi)DNA損傷的修復(fù)也起著重要的保真作用。例如，DNA雙鏈中鳥(niǎo)嘌呤(G)可能被氧化形成8-oxoG，并在DNA復(fù)制時(shí)與腺嘌呤(A)配對(duì)從而導(dǎo)致突變，糖基酶MutM能將8-oxoG切除，以保證修復(fù)后復(fù)制時(shí)發(fā)生準(zhǔn)確的G-C配對(duì)。另一種糖基酶MutY則可以在8-oxoG-A配對(duì)形成時(shí)將A切除，使8-oxoG-C配對(duì)在短時(shí)間內(nèi)繼續(xù)保持，為MutM 修復(fù)爭(zhēng)取時(shí)間［16，18，19］。復(fù)雜的、層級(jí)式的保真機(jī)制保證了DNA復(fù)制過(guò)程的高度精確性，而當(dāng)其中相關(guān)基因發(fā)生結(jié)構(gòu)性的、可遺傳的功能缺陷甚至失活時(shí)，就會(huì)在不同程度上影響DNA復(fù)制的保真性，影響遺傳信息的準(zhǔn)確傳遞，形成超突變細(xì)胞。

此外，天然細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)極度缺乏、環(huán)境壓力脅迫嚴(yán)重時(shí)，也會(huì)激發(fā)一系列全局性應(yīng)激機(jī)制，造成基因組不穩(wěn)定性加強(qiáng)，復(fù)制突變率提高，形成暫時(shí)性的超突變狀態(tài)［20，21］。壓力應(yīng)激條件誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞突變機(jī)制尚未得到完全公認(rèn)的解釋，其中涉及的元件或機(jī)制包括σ因子RpoS表達(dá)上調(diào)，SOS系統(tǒng)激發(fā)，Pol VI、Pol V等易錯(cuò)型DNA聚合酶表達(dá)上調(diào)以及MMR系統(tǒng)表達(dá)下調(diào)等，而脅迫條件下胞內(nèi)各種造成DNA損傷的因子(例如ROS、H2O2等)的含量通常也會(huì)大量增加，進(jìn)一步促進(jìn)DNA復(fù)制突變率的提高［22］。

2.2 超突變細(xì)胞的人工構(gòu)建

超突變細(xì)胞較高的基因組復(fù)制突變率，可以為微生物進(jìn)化提供更強(qiáng)的動(dòng)力，因此超突變細(xì)胞在進(jìn)化工程和生物技術(shù)領(lǐng)域具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)和潛力。但是天然超突變細(xì)胞在自然界中以非常低的比率存在著，而且存在著遺傳背景不清楚、生理表型不明確、系統(tǒng)可控性差等問(wèn)題，在一定程度上限制了其有效應(yīng)用。為了充分利用超突變細(xì)胞，更好的選擇是從背景清晰、表型明確的宿主菌株出發(fā)構(gòu)建人工可控的超突變細(xì)胞?，F(xiàn)階段對(duì)DNA 復(fù)制機(jī)制的充分認(rèn)識(shí)［23，24］，大量增變/抑變基因的發(fā)現(xiàn)，為超突變細(xì)胞的構(gòu)建提供了大量操作靶點(diǎn)［16］，而各種遺傳操作的工具的出現(xiàn)和發(fā)展進(jìn)一步使得對(duì)細(xì)胞突變狀態(tài)進(jìn)行人工調(diào)控成為可能。

現(xiàn)階段，人工構(gòu)建超突變細(xì)胞的策略主要包括以下幾種:①通過(guò)基因敲除手段失活非生長(zhǎng)必須型保真元件。對(duì)于以MMR系統(tǒng)中MutS、MutL為代表的非生長(zhǎng)必需型保真元件來(lái)說(shuō)，通過(guò)直接的基因敲除就可以實(shí)現(xiàn)相關(guān)機(jī)制的失活，引發(fā)DNA復(fù)制突變率的提高，并且不會(huì)影響到宿主的正常生長(zhǎng)［25～27］;②通過(guò)遺傳修飾降低或消除生長(zhǎng)必須型保真元件的保真活性。參與DNA復(fù)制保真機(jī)制的很多元件與DNA的復(fù)制過(guò)程直接相關(guān)，是細(xì)胞生長(zhǎng)、復(fù)制所必須的，以大腸桿菌為例，其dnaE，dnaQ，polA等都是重要的保真元件 ，又是細(xì)胞生長(zhǎng)的必需基因。針對(duì)此類靶標(biāo)，通過(guò)解析其序列、結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，對(duì)特定位點(diǎn)進(jìn)行操作，在不影響其DNA復(fù)制功能的前提下，消除或降低其校正活性，也可以起到提高復(fù)制突變率的效果［28，29］;③通過(guò)上調(diào)表達(dá)細(xì)胞內(nèi)具有增變活性的元件或蛋白。微生物細(xì)胞中除了大量DNA復(fù)制保真元件外，還包含有部分對(duì)復(fù)制保真性有負(fù)面作用的基因，通常稱之為增變?cè)?，例如壓力?yīng)激突變系統(tǒng)的各個(gè)組分，當(dāng)在正常條件下人工上調(diào)此類基因表達(dá)時(shí)，即可使細(xì)胞進(jìn)入超突變狀態(tài)［30］。

3 超突變細(xì)胞的應(yīng)用

超突變細(xì)胞基因組中快速獲得并積累的隨機(jī)突變能夠制造豐富的遺傳和表型多樣性，以供性狀篩選，因此可以用于快速改造微生物細(xì)胞表型;另一方面，超突變細(xì)胞中較高的復(fù)制錯(cuò)誤率，也使其成為一種便捷的DNA誘變工具，將目標(biāo)基因以質(zhì)粒攜帶的形式導(dǎo)入超突變細(xì)胞進(jìn)行復(fù)制傳代后，就可以便捷地獲得目標(biāo)基因的突變體文庫(kù)。因此，超突變細(xì)胞在蛋白質(zhì)和微生物的進(jìn)化工程方面有著廣泛的應(yīng)用前景。

3.1 應(yīng)用超突變細(xì)胞進(jìn)化細(xì)胞生理表型

傳統(tǒng)進(jìn)化工程技術(shù)為了改造微生物細(xì)胞底物利用能力、環(huán)境耐受性等復(fù)雜表型需要通過(guò)連續(xù)傳代的手段，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期馴化，逐漸積累基因組中的隨機(jī)突變來(lái)達(dá)到改良細(xì)胞表型的目的［5，6］。為了加速進(jìn)化過(guò)程，往往會(huì)使用理化誘變劑處理、轉(zhuǎn)座子誘變等手段來(lái)加速基因組范圍內(nèi)突變產(chǎn)生的速度［10，31］。超突變細(xì)胞本身具有的基因組復(fù)制高突變率的特點(diǎn)使其在應(yīng)用于表型篩選改造時(shí)具有連續(xù)、高效的特點(diǎn)，無(wú)需進(jìn)行人工處理，即可在子代細(xì)胞基因組上生成大量突變，進(jìn)而形成表型多樣性以供篩選。

將超突變細(xì)胞應(yīng)用于微生物的生理表型改造最早報(bào)道于2001年，Genencor公司的Selifonova等［32］使用外源質(zhì)粒表達(dá)大腸桿菌強(qiáng)增變基因mutD5，使細(xì)胞的基因組復(fù)制突變率提高了近4 000倍，在此基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)兩輪篩選就獲得了對(duì)有機(jī)溶劑DMF的耐受濃度提高10～20 g/L的進(jìn)化菌株，在DMF耐受細(xì)胞中只要將外源質(zhì)粒消除，基因組復(fù)制突變率就能回復(fù)正常，使表型得以穩(wěn)定遺傳。Zhu等［33］通過(guò)敲除大腸桿菌的mutS基因，獲得了突變率提高100倍左右的超突變菌株，經(jīng)過(guò)進(jìn)化成功地提高了宿主對(duì)丁醇、NaCl以及高溫脅迫的耐受能力。Endo等［34］將枯草芽孢桿菌超突變細(xì)胞用于加速菌株的溫度適應(yīng)性進(jìn)化。在一株因GroEL基因替換而表現(xiàn)為熱耐受性減弱(52℃→50℃)的枯草芽孢桿菌的基礎(chǔ)上，通過(guò)敲除mutS、mutM和mutY基因形成了超突變細(xì)胞，經(jīng)過(guò)選擇成功地使宿主的溫度耐受性回復(fù)到了野生型的水平。Itakura等［35］通過(guò)對(duì)根瘤菌(Bradyhizobium japonicum)中編碼DNA聚合酶Ⅲ復(fù)合物ε亞基的dnaQ基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，使其關(guān)鍵的保守區(qū)域ExoI中重要的活性氨基酸位點(diǎn)Asp7和Glu9突變?yōu)锳la，成功地構(gòu)建了超突變菌株并應(yīng)用于馴化，最終獲得的突變菌株表現(xiàn)出比野生型高7～12倍的N2O呼吸活性。在真核細(xì)胞中，人工構(gòu)建超突變細(xì)胞主要通過(guò)對(duì)其DNA聚合酶3(delta)進(jìn)行改造。早在1993年，Morrison等［36］將釀酒酵母DNA聚合酶Pol3中負(fù)責(zé)3'→5'外切酶活性的氨基酸保守區(qū)域“Phe-Asp-Ile-Glu-Thr”進(jìn)行定點(diǎn)突變改為“Phe-Ala-Ile-Ala-Thr”(由Pol3基因突變?yōu)镻ol3-01)，獲得的菌株突變率相比野生型提高了130倍，而正常生長(zhǎng)未受影響，而將所獲得工程菌株中參與MMR校正的pms基因敲除時(shí)，細(xì)胞突變率甚至提高了19 000倍。類似的對(duì)DNA聚合酶2中相同保守區(qū)域進(jìn)行改造時(shí)，宿主的DNA復(fù)制突變率也有了22倍的提高［37］。2006年，Shimoda等［38］從染色體上表達(dá) Pol3-01的釀酒酵母超突變菌株出發(fā)，經(jīng)過(guò)進(jìn)化獲得了能夠耐受40℃高溫脅迫的突變株。Abe等［39，40］則使用質(zhì)粒表達(dá)Pol3-01來(lái)提高釀酒酵母和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(相應(yīng)的同源基因氨基酸保守區(qū)域進(jìn)行了與Pol3-01類似的突變)的基因組復(fù)制突變率，通過(guò)進(jìn)化成功改造了酵母菌對(duì)乙醇的耐受性和藥物蛋白合成分泌的能力。2013年韓國(guó)研究人員采用類似的策略構(gòu)建了漢遜酵母(Hansenula anomala)的超突變細(xì)胞，進(jìn)行全基因隨機(jī)突變，并篩選到對(duì)木糖利用能力提高的進(jìn)化菌株［41］。

本實(shí)驗(yàn)室針對(duì)進(jìn)化工程技術(shù)對(duì)連續(xù)性和高效性的要求，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了基因組復(fù)制工程輔助的連續(xù)進(jìn)化技術(shù)(genome replication engineering assisted continuous evolution，GREACE)，以“邊突變邊篩選”為設(shè)計(jì)原則，通過(guò)向微生物細(xì)胞中導(dǎo)入一組進(jìn)行了遺傳修飾的DNA聚合酶保真元件突變體來(lái)擾動(dòng)基因組復(fù)制過(guò)程的保真性進(jìn)而構(gòu)建超突變細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞在不斷加強(qiáng)的選擇性壓力下培養(yǎng)時(shí)，只有不斷富集適應(yīng)性突變的子代細(xì)胞才能存活并被篩選;當(dāng)保真元件突變體被消除的時(shí)候，就可以獲得具備優(yōu)良、可遺傳表型的突變菌株。在E.coli細(xì)胞中，我們應(yīng)用易錯(cuò)PCR技術(shù)構(gòu)建了DNA聚合酶Ⅲ復(fù)合物ε亞基的dnaQ基因的突變體文庫(kù)，導(dǎo)入宿主細(xì)胞后在脅迫環(huán)境下連續(xù)培養(yǎng)，在兩個(gè)月的時(shí)間內(nèi)成功地將細(xì)胞丁醇耐受濃度由6 g/L提高到10 g/L，將0.1%濃度乙酸環(huán)境中細(xì)胞飽和濃度提高了8倍［8］。

GREACE應(yīng)用過(guò)程還反映出不同性狀的改造過(guò)程中宿主傾向于富集突變強(qiáng)度不同的保真元件(dnaQ)突變體的趨勢(shì)，意味著微生物細(xì)胞在不同環(huán)境中的適應(yīng)與進(jìn)化可能偏好于不同強(qiáng)度的突變率，也印證了GREACE技術(shù)設(shè)計(jì)過(guò)程中對(duì)不同突變率需要進(jìn)行考慮的必要性。針對(duì)基因組復(fù)制突變率控制的需要，Luan等［26］進(jìn)一步在重要的工業(yè)菌株丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)中提出并開(kāi)發(fā)了一套可控性超突變系統(tǒng)，通過(guò)將基因組mutS/mutL敲除失活，再將由無(wú)水四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制的mutS/mutL操縱子通過(guò)質(zhì)粒導(dǎo)回細(xì)胞，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)梭菌細(xì)胞基因組復(fù)制突變率的人工精細(xì)調(diào)控，通過(guò)調(diào)整無(wú)水四環(huán)素的濃度，可以實(shí)現(xiàn)在本底強(qiáng)度到提高120倍范圍內(nèi)的變化。應(yīng)用該系統(tǒng)處于超突變狀態(tài)下的梭菌細(xì)胞表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的丁醇耐受性，反映了該系統(tǒng)的應(yīng)用潛力。

3.2 應(yīng)用超突變細(xì)胞進(jìn)行基因突變文庫(kù)構(gòu)建

定向進(jìn)化技術(shù)是進(jìn)化論和進(jìn)化工程理論在酶工程領(lǐng)域的重要應(yīng)用，該技術(shù)不需要或不依賴于對(duì)待改造蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)和功能方面的認(rèn)識(shí)，而主要通過(guò)構(gòu)建基因－蛋白突變體文庫(kù)并結(jié)合高通量篩選的策略來(lái)獲得酶學(xué)性質(zhì)有所改善提高或具備新的催化活性的酶蛋白突變體［42］。構(gòu)建具有豐富的遺傳多樣性的突變體文庫(kù)對(duì)定向進(jìn)化技術(shù)的成功應(yīng)用具有重要意義。傳統(tǒng)上，定向進(jìn)化技術(shù)主要是通過(guò)易錯(cuò) PCR(error-prone PCR，EPPCR)或DNA shuffling的手段來(lái)構(gòu)建待改造蛋白的突變體文庫(kù)。近年來(lái)，超突變細(xì)胞的胞內(nèi)誘變體系在該領(lǐng)域也表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力和價(jià)值。

1997年，Stratagene公司的研究人員構(gòu)建了第一個(gè)可用于構(gòu)建基因突變體文庫(kù)的大腸桿菌菌株XL1-Red。XL1-Red菌株中，3'→5'外切校正系統(tǒng)(mutD/dnaQ)、MMR系統(tǒng)(mutS)和DNA修復(fù)系統(tǒng)(mutT)的相關(guān)基因都進(jìn)行了改造，其基因組復(fù)制隨機(jī)突變率比野生型大腸桿菌高5 000倍以上，使用ColE1復(fù)制起始位點(diǎn)的質(zhì)粒攜帶目標(biāo)基因在XL1-Red菌株中傳代培養(yǎng)時(shí)，宿主僅需復(fù)制24代，就能使1 kb長(zhǎng)度的目標(biāo)基因上平均引入1個(gè)突變，而野生菌達(dá)到相同水平的突變效果需進(jìn)行120 000代復(fù)制［43］。XL1-Red系統(tǒng)使用時(shí)只需將待突變建庫(kù)的目標(biāo)基因插入ColE1來(lái)源的質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)入XL1-Red，根據(jù)需要的突變率，在合適的時(shí)間內(nèi)傳代培養(yǎng)細(xì)胞，然后將質(zhì)粒抽提出來(lái)就獲得了突變體文庫(kù)［43］。XL1-Red系統(tǒng)已經(jīng)成功地應(yīng)用于酯酶［44，45］、葡萄糖醛酸酶［46］、芳基丙二酸脫羧酶［47］以及聚羥基脂肪酸酯合酶［48］等大量酶蛋白的定向進(jìn)化，從中篩選到了活性、穩(wěn)定性、專一性等性質(zhì)有所提高的各種突變體，甚至噬菌體抗性蛋白［49］、肝炎病毒抗體［50］等特殊蛋白的進(jìn)化或改造也可以使用該系統(tǒng)進(jìn)行。

XL1-Red系統(tǒng)能夠有效地向外源質(zhì)粒上的DNA片段引入突變，但是理論上該系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA的突變是無(wú)差別的，無(wú)論是基因組DNA還是質(zhì)粒DNA都以近乎相同的強(qiáng)度進(jìn)行突變，同時(shí)還造成了菌株細(xì)胞本身極大的不穩(wěn)定性。理想的用于蛋白質(zhì)定向進(jìn)化的胞內(nèi)突變機(jī)制應(yīng)該是靶向性的，可以集中對(duì)特定區(qū)域的DNA進(jìn)行誘變。Loeb 等［51，52］開(kāi)發(fā)了一套新的基于易錯(cuò)型 DNA PolⅠ的胞內(nèi)誘變系統(tǒng)，在DNA胞內(nèi)突變的靶向性上取得了很大的進(jìn)展。大腸桿菌細(xì)胞中ColE1來(lái)源的質(zhì)粒DNA復(fù)制起始是由PolⅠ來(lái)執(zhí)行的，Loeb實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)PolⅠ的突變和改造，獲得了大量增變型突變體，會(huì)引發(fā)宿主細(xì)胞基因組復(fù)制保真性的提高或降低。將保真性降低的易錯(cuò)型PolⅠ編碼基因在質(zhì)粒載體(非ColEI來(lái)源)上表達(dá)，在此基礎(chǔ)上將目標(biāo)基因連入ColE1質(zhì)粒并導(dǎo)入宿主后，就可以進(jìn)行突變建庫(kù)。分析證明，使用該系統(tǒng)進(jìn)行突變體文庫(kù)構(gòu)建時(shí)突變效率與目標(biāo)基因的長(zhǎng)度以及與PolⅠ結(jié)合位點(diǎn)的距離直接相關(guān)，為了滿足不同的建庫(kù)要求，需要有針對(duì)性地進(jìn)行設(shè)計(jì)。雖然該體系尚未能實(shí)現(xiàn)完全地將突變限制在質(zhì)粒上，但是對(duì)目標(biāo)基因的突變率還是比基因組DNA突變率高一個(gè)數(shù)量級(jí)以上。

4 展望

高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)細(xì)胞DNA復(fù)制保真機(jī)制認(rèn)識(shí)的不斷加深以及新型高效遺傳操作工具的不斷涌現(xiàn)，使得構(gòu)建各種特殊性質(zhì)的超突變細(xì)胞成為可能。而隨著進(jìn)化工程相關(guān)領(lǐng)域理解和認(rèn)識(shí)的加深，對(duì)人工構(gòu)建超突變細(xì)胞的各種性質(zhì)也有了新的要求。未來(lái)的人工可控超突變細(xì)胞發(fā)展方向是:①超突變態(tài)/正常態(tài)的便捷切換;②不同程度突變強(qiáng)度的精細(xì)調(diào)控;③不同DNA突變類型的平衡引入;④特定區(qū)域DNA的定向集中突變。在突變的時(shí)序、空間和強(qiáng)度上都具備良好人工可控性的超突變細(xì)胞將為微生物細(xì)胞和蛋白的進(jìn)化提供更強(qiáng)更好的進(jìn)化動(dòng)力，有效地滿足各種性狀改善提高的需要，從而促進(jìn)生物技術(shù)在不同領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展。

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