蛋白酶在水產(chǎn)品加工中的應(yīng)用研究進展

俞麗娜， 邵興鋒

寧波大學食品科學與工程系，浙江 寧波 315211

我國海域遼闊，海洋資源豐富，是世界第一水產(chǎn)大國。但是每年約有30%的海洋資源無法得到充分利用，造成資源的浪費。水產(chǎn)品的傳統(tǒng)加工技術(shù)主要有腌制、干制、煙熏、糟制和天然發(fā)酵等，這些方法操作簡便，加工成本低，故只適于對水產(chǎn)品進行初加工。隨著科技的進步和生活水平的提高，人們更關(guān)注食品的感官品質(zhì)和營養(yǎng)價值，傳統(tǒng)工藝在改良食品品質(zhì)、促進加工深度以及實現(xiàn)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化方面存在很大的不足，而現(xiàn)代生物技術(shù)作為一種高新技術(shù)，改善了傳統(tǒng)工藝的不足，能夠?qū)λa(chǎn)資源進行有效利用，實現(xiàn)水產(chǎn)品的深加工［1］?，F(xiàn)代生物技術(shù)主要包括基因工程技術(shù)、細胞工程技術(shù)、酶技術(shù)和發(fā)酵技術(shù)等四個方面，其中，酶技術(shù)對水產(chǎn)品加工的影響最大。

近年來，由于水體污染和過度捕撈，低值水產(chǎn)品比例不斷上升，水產(chǎn)加工下腳料也無法得到有效利用，因而運用酶技術(shù)將低值水產(chǎn)品和水產(chǎn)加工下腳料來生產(chǎn)高附加值的產(chǎn)品已成為水產(chǎn)品加工業(yè)發(fā)展的主要趨勢［2，3］。酶制劑是從生物中提取的具有酶特性的一類活性物質(zhì)。在水產(chǎn)品加工業(yè)方面，研究人員對蛋白酶的研究最為深入，通過蛋白酶處理低值水產(chǎn)品和加工下腳料，可提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品質(zhì)量，降低環(huán)境污染，豐富水產(chǎn)品市場［4］。本文綜述了蛋白酶在水產(chǎn)品加工中的應(yīng)用研究現(xiàn)狀，提出了使用蛋白酶酶解過程中的注意事項，并對其未來的發(fā)展趨勢作出展望。

1 蛋白酶概述

蛋白酶，又名蛋白水解酶（proteolytic enzyme，proteinase），是最主要的酶制劑之一，能夠催化蛋白質(zhì)中肽鍵的水解。蛋白酶廣泛存在于動物內(nèi)臟、植物莖葉、果實和微生物中［5］。蛋白酶種類繁多，按其來源可分為動物蛋白酶（胰蛋白酶、胃蛋白酶）、植物蛋白酶（木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶）和微生物蛋白酶（枯草桿菌蛋白酶、鏈霉蛋白酶）；按其pH不同又可分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶；按其活性中心起催化作用的基團屬性則可分為金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和巰基蛋白酶；還可根據(jù)剪切基團分為內(nèi)切酶和外切酶兩種類型。蛋白酶作為一種生物酶制劑具有三大特點，一是來源于動植物和微生物，安全性高，幾乎沒有有害殘留物；二是蛋白酶具有專一性和高效性，因此酶用量較少；三是酶解反應(yīng)條件溫和，操作簡便。因此蛋白酶酶解技術(shù)作為一種安全、高效和快捷的加工技術(shù)廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)加工中［6］。

2 蛋白酶在水產(chǎn)品加工中的應(yīng)用研究現(xiàn)狀

2.1 水解魚蛋白研究

低值魚的食用價值較低，利用酶技術(shù)生產(chǎn)水解魚蛋白一方面能有效地對水產(chǎn)品進行綜合利用，另一方面可以提高水產(chǎn)品加工的經(jīng)濟效益，實現(xiàn)低值魚的高值化應(yīng)用。水解魚蛋白不僅蛋白質(zhì)含量高，且品質(zhì)優(yōu)于整塊魚肉組織或者魚蛋白的濃縮物［7］。采用蛋白酶酶解得到的水解魚蛋白營養(yǎng)豐富，水溶性好，且必需氨基酸比例恰當。

魚體本身含有內(nèi)源蛋白酶，所以可以利用內(nèi)源酶的自溶技術(shù)水解魚體自身蛋白質(zhì)。內(nèi)源蛋白酶最大的優(yōu)點在于其活性高、成本低，且內(nèi)源蛋白酶與底物結(jié)合的效果好。Choi等［8］對鳀魚三種內(nèi)源酶的性質(zhì)進行研究，結(jié)果表明胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶具有相同的最適作用條件，在pH 8.0、45℃條件下酶解效率最高，而組織蛋白酶的最適作用條件為pH 6.0、50℃。Pastoriza等［9］利用內(nèi)源蛋白酶（粉狀的原料蛋白酶和鰩魚內(nèi)臟中提取的內(nèi)源復合蛋白酶）和商業(yè)蛋白酶（木瓜蛋白酶和胃蛋白酶）對鰩魚下腳料進行動力學研究，結(jié)果表明利用鰩魚內(nèi)源蛋白酶在pH 8.5、49℃時的水解效果最佳，明顯優(yōu)于商業(yè)蛋白酶。榮婧等［10］以羅非魚內(nèi)臟為原料，研究了其內(nèi)臟蛋白酶的自溶工藝，得到在最佳工藝條件下的水解度為18.8%。但是內(nèi)源蛋白酶的酶解過程難以控制，在生產(chǎn)過程中還易受到微生物的污染，得到的產(chǎn)物其功能特性也較差［11］，因此在實際加工過程中更多地使用外源蛋白酶。利用外源蛋白酶水解不僅可以避免魚肉組織中營養(yǎng)素的損失，還能有效提高產(chǎn)品品質(zhì)，避免微生物的危害。胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶等都適于魚蛋白的水解，使其具有更好的溶解性或得到較長的肽鏈。研究發(fā)現(xiàn)，用堿性蛋白酶分別對白鰱內(nèi)臟和藍圓鯵進行水解，水解產(chǎn)物的水解度較高，可分別達27.1%和51.9%，為低值魚的高值化利用提供了研究方向［12，13］。

蛋白酶水解低值水產(chǎn)品或水產(chǎn)加工下腳料得到的水解蛋白制品會產(chǎn)生不宜的腥味和苦味，影響產(chǎn)品的感官品質(zhì)，限制了資源的綜合開發(fā)利用。蛋白水解液的苦味是因為蛋白質(zhì)經(jīng)內(nèi)切酶作用后，水解過程中產(chǎn)生含有疏水基團的多肽及疏水性游離氨基酸形成苦味肽［14］。徐錦等［15］應(yīng)用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和風味蛋白酶等6種商品蛋白酶研究了對鰱魚蛋白的水解效果，結(jié)果表明木瓜蛋白酶的水解度最高，而風味蛋白酶的水解液風味最佳，由此可見，運用風味蛋白酶能夠有效改善水解液的風味。風味蛋白酶作為真菌蛋白酶／肽酶的復合體，具有內(nèi)切蛋白酶和外切肽酶兩種活性。外切酶能夠從多肽末端切斷釋放出氨基酸，將苦味肽降解為氨基酸［16］。但是外切酶必須與內(nèi)切酶復合使用或在內(nèi)切酶使用后添加才可有效水解苦味肽，減輕苦味甚至達到完全去苦的效果。因此可以將水解度較高的蛋白酶與水解風味較好的蛋白酶進行雙酶復合酶解。孫克巖等［17］研究了木瓜蛋白酶和風味蛋白酶雙酶酶解牡蠣，提高了酶解液中氨基氮的含量，改善了其風味。姚芳等［18］通過研究三種復合酶（堿性蛋白酶和風味蛋白酶；胰酶和風味蛋白酶；堿性蛋白酶、胰酶和風味蛋白酶）對鰱魚酶解效果的比較，得出堿性蛋白酶和風味蛋白酶以1∶1組合水解效果最佳，風味最好。另一方面，在酶解魚蛋白過程中，當肽鏈的長度足夠長時則可將疏水性氨基酸包埋在其結(jié)構(gòu)內(nèi)部，也能達到減弱苦味的效果［19，20］。除了應(yīng)用酶法去苦外，通過吸附、沉淀、掩蓋等理化手段也可起到去苦作用，或者將酶法去苦和和理化去苦相結(jié)合，去苦效果更佳。

2.2 提取生物活性物質(zhì)

利用蛋白酶的水解作用，適度水解蛋白質(zhì)，使活性物質(zhì)游離出來，最后進行分離，是制備生物活性物質(zhì)的一般流程。生物活性物質(zhì)主要包括生物活性肽、多糖和高度不飽和脂肪酸等。其中，生物活性肽是一類能夠優(yōu)化機體代謝環(huán)境，促進機體健康的多肽。采用酶法從低值水產(chǎn)品及加工副產(chǎn)物中提取活性肽是目前研究的熱點。

淡水魚及其加工下腳料中蛋白質(zhì)含量豐富，富含抗菌肽、降血壓肽、抗氧化肽和免疫活性肽等多種活性物質(zhì)［21，22］，它們以非活性狀態(tài)潛藏于下腳料蛋白中，只有將其釋放出來才能發(fā)揮生物活性作用。近年來，國內(nèi)外學者致力于研究通過蛋白質(zhì)的可控酶解技術(shù)制備天然的抗氧化肽。鰱魚作為我國淡水魚的主要品種，由于其特有的腥味和多骨多刺的特點而不受消費者喜愛，但是鰱魚酶解產(chǎn)物具有抗氧化活性，可以制備抗氧化肽，提高鰱魚附加值。尤娟等［23］應(yīng)用酶法提取鰱魚蛋白抗氧化肽，研究了風味蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶等5種酶水解其魚肉蛋白，結(jié)果表明胃蛋白酶酶解產(chǎn)物具有較強的清除DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）自由基的能力。胃蛋白酶還能用于水解魚皮蛋白質(zhì)，水解后添加蜂蜜、葡萄糖能夠制備營養(yǎng)豐富的多肽口服液。申鋒等［24］用4種蛋白酶水解草魚魚鱗，結(jié)果表明胃蛋白酶水解魚鱗膠原蛋白的水解產(chǎn)物具有較好的凝膠能力，制得的魚鱗膠原肽可作為膠凝劑、增稠劑和乳化劑應(yīng)用于保健品、化妝品等領(lǐng)域。

二十碳五烯酸（eicosapntemacnioc acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）屬于生物活性物質(zhì)中的高度不飽和脂肪酸。淡水魚內(nèi)臟中含有一定的EPA和DHA，具有降低人體血液中的低密度脂蛋白、減少血液的粘稠度、預(yù)防動脈粥樣硬化和心腦血管疾病、增強免疫力和保護視力等作用。因此，利用蛋白酶法提取魚油，可以使淡水魚加工副產(chǎn)物得以充分利用。此過程是通過蛋白酶的水解作用，破壞了蛋白質(zhì)和魚油的結(jié)合，從而使油脂釋放出來。熊光權(quán)等［25］應(yīng)用酶解法從鰱魚內(nèi)臟中提取魚油，結(jié)果表明中性蛋白酶是最佳酶源，提取率可達17.2%。此外，應(yīng)用胰蛋白酶制備的魚油提取率也很高，例如用胰蛋白酶提取金槍魚魚油，其提取率高達90.2%［26］。蛋白酶法提取魚油的優(yōu)勢在于其作用條件溫和，魚油提取率高，生產(chǎn)的魚油質(zhì)量好，并且提高了低值魚類的附加值。

2.3 研發(fā)水產(chǎn)調(diào)味品

利用低值魚、蝦蟹和貝類等加工下腳料為原料生產(chǎn)水產(chǎn)調(diào)味品，實現(xiàn)了對海洋資源的綜合利用，豐富了水產(chǎn)品市場。

魚露是一類風味獨特的水產(chǎn)調(diào)味品，味咸鮮美，略帶腥味。傳統(tǒng)生產(chǎn)魚露的生物技術(shù)是天然發(fā)酵法，高鹽腌制后進行發(fā)酵。但此法生產(chǎn)周期長，產(chǎn)品鹽濃度高，無法滿足現(xiàn)代人對健康飲食的需求。運用以加酶法為主的現(xiàn)代速釀技術(shù)生產(chǎn)魚露不僅縮短了魚露的生產(chǎn)周期，還能大大降低產(chǎn)品的鹽度。例如，遲玉森等［27］利用As1398蛋白酶水解鳀魚，20h即制成魚鮮醬油。何建君等［28］利用復合蛋白酶水解小雜魚和鰱魚下腳料中的蛋白質(zhì)，發(fā)酵后制成了淡水魚露，降低了調(diào)味品的鹽濃度。近幾年，對魚露快速發(fā)酵工藝的研究更加深入，將發(fā)酵工藝細分為前期、中期和后期三個階段。黃紫燕等［29］研究表明，通過前期高鹽酶解、中期加曲自然發(fā)酵和后期高鹽保溫的分段式魚露發(fā)酵工藝，可以顯著提高魚露的可溶性氮、氨基酸態(tài)氮和游離氨基酸的含量。

蛋白酶除了能生產(chǎn)魚露調(diào)味品，還能水解海蟹類和魚貝類加工下腳料制備海鮮調(diào)味品。目前，我國許多海鮮調(diào)味品中添加了合成香精、動植物蛋白質(zhì)和味精來提高氮含量及鮮味，這種調(diào)味品不僅風味不佳，而且營養(yǎng)價值低。而天然海鮮調(diào)味品富含有益的活性物質(zhì)，具有特定的營養(yǎng)和保健功能，有益于人體健康。劉光明等［30］利用木瓜蛋白酶和風味蛋白酶水解制得的海蟹調(diào)味品蟹味濃郁、鮮味明顯，不僅保持了原材料的營養(yǎng)成分和獨特風味，而且蛋白質(zhì)資源也得到了有效回收。靳挺等［31］也用木瓜蛋白酶和風味蛋白酶水解龍頭魚，制備出風味純正、自然的海鮮調(diào)味料。陳超等［32］則通過酶解貝類加工廢棄物制得了復合海鮮調(diào)味料，不僅風味極佳，而且富含游離氨基酸態(tài)氮，提高了調(diào)味料的營養(yǎng)價值。

2.4 其他應(yīng)用研究

蛋白酶除了以上三種主要應(yīng)用外，還能用于去皮、脫鱗以及制備不帶魚肉的魚骨制品。水產(chǎn)品加工中去皮和去鱗的步驟較繁瑣，目前主要采用機械法，但易造成水生動物體損傷，且處理后仍有殘留物粘附在其表面，降低了產(chǎn)品得率。一般機械法處理后還需人工去皮，二次處理更提高了加工成本，故此法不經(jīng)濟。研究表明，蛋白酶尤其是木瓜蛋白酶具有較好的去皮和脫鱗效果。陳青等［33］研究了木瓜蛋白酶對東海海參的脫皮工藝，先將干海參水發(fā)，然后用木瓜蛋白酶處理，最后脫皮。結(jié)果表明，0.09%的木瓜蛋白酶液在40℃下處理8h即能去除東海海參粗糙厚實的表皮，并且保持了其營養(yǎng)成分和優(yōu)良的口感。呂飛等［34］則將木瓜蛋白酶應(yīng)用于魚皮去鱗，首先清洗帶鱗黑魚魚皮表面黏液并除去殘留的魚肉，接著用木瓜蛋白酶處理，不停攪拌酶溶液。結(jié)果表明，0.6%的木瓜蛋白酶酶溶液在20℃下攪拌20min能有效去除魚鱗，且操作簡便。魚骨粉和魚骨休閑食品則需要在加工前首先將魚肉去除。例如利用堿性蛋白酶將魚骨上殘存的碎肉酶解，過濾即能制得不帶魚肉的魚骨［35］?？莶輻U菌蛋白酶也能去除殘存在魚骨間的魚肉，不僅脫肉效果好能得到干凈的魚肉，還能降低魚骨的腥味［36］。

3 蛋白酶技術(shù)應(yīng)用的注意事項

3.1 酶種類的選取

蛋白酶種類繁多、應(yīng)用廣泛，在對不同的水產(chǎn)品加工過程中，并非所有的蛋白酶都適合加工同一水產(chǎn)品，不同的蛋白酶對同一酶底物表現(xiàn)出的水解能力差異很大。徐錦等［14］研究了6種商品蛋白酶對鰱魚蛋白的水解效果，在各酶的最佳水解條件下得出木瓜蛋白酶的水解度最高，達26.3%，而風味蛋白酶的水解度最低，為17%。田寶玉等［37］也研究了不同酶對白鰱蛋白的水解效果，結(jié)果同樣顯示風味蛋白酶的水解度最低。因此，不同的蛋白底物選擇合適的蛋白酶至關(guān)重要。

3.2 作用方式的確定

在水產(chǎn)品加工中，一般多酶水解可溶性蛋白得率要高于單酶水解。楊萍等［38］分別用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味蛋白酶對青鱗魚肉進行單酶水解和兩兩組合水解，測得木瓜蛋白酶與風味蛋白酶雙酶水解的可溶性蛋白得率高達85.6%，而單酶水解的得率僅有40%左右。此外，內(nèi)源酶水解水產(chǎn)品往往產(chǎn)生不適宜的苦腥味，風味蛋白酶雖然水解度較低，但是其水解風味較好，所以可以將其與水解度高的蛋白酶混合酶解，改善水產(chǎn)品的水解度和水解液的風味［17，18］。

3.2 使用方法的選擇

在水產(chǎn)品加工中，蛋白酶的使用方法主要有以下三種：第一，直接加入商業(yè)酶制劑［12，13］，此法因使用方便而應(yīng)用最為廣泛，缺點是生產(chǎn)成本較高；第二，利用內(nèi)源蛋白酶水解［8，9］，與商業(yè)酶制劑相比可降低生產(chǎn)成本，節(jié)約資源，但酶解時間相對較長；第三，還可以通過直接加入富含蛋白酶的產(chǎn)品來提供水解所需的蛋白酶［39］，但易殘留蛋白酶源的食品特性而影響加工產(chǎn)品的品質(zhì)，故使用最少。根據(jù)不同蛋白酶和加工產(chǎn)品的特點選擇合適的使用方法，既能獲得所需的產(chǎn)品，又能最大限度降低生產(chǎn)成本，在生產(chǎn)加工中至關(guān)重要。

4 展望

隨著漁業(yè)資源的衰退，應(yīng)用蛋白酶對水產(chǎn)品進行綜合利用，不僅降低生產(chǎn)成本、節(jié)約資源，而且實現(xiàn)了對低值水產(chǎn)品的高值化利用，促進了水產(chǎn)加工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。但是我國酶制劑工業(yè)仍處于初步發(fā)展階段，提取設(shè)備和工藝技術(shù)落后，難以在生產(chǎn)實踐中得到廣泛應(yīng)用。此外，酶制劑的安全性問題也關(guān)系到廣大消費者的健康。雖然酶作為一種生物產(chǎn)品比化學制劑的安全性高，但是在酶制劑的生產(chǎn)過程中極易受到微生物的污染，產(chǎn)生生物毒素。今后在酶制劑工業(yè)發(fā)展中，應(yīng)利用現(xiàn)代新技術(shù)開發(fā)具有高活力和良好風味的酶制劑，降低生產(chǎn)成本，實現(xiàn)大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。隨著酶技術(shù)的進一步發(fā)展以及酶工業(yè)的進步，酶制劑尤其是蛋白酶在水產(chǎn)品加工中的應(yīng)用將會越來越廣泛。

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