生物體中PAEs和AEs檢測技術及安全評價研究進展

蔡 艷， 賀小雨， 楊震峰＊， 蘇新國

1.浙江萬里學院生物與環(huán)境學院，浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室，浙江 寧波 315100；

2.寧波市出入境檢驗檢疫局，浙江 寧波 315012；

3.廣東食品藥品職業(yè)學院，廣州 510520

鄰苯二甲酸酯（phthalic acid esters，PAEs，又稱酞酸酯）和己二酸酯（adipate acid esters，AEs）是眾所周知的聚合物添加劑，它們在改變聚合物的性質(zhì)、聚合物的加工及產(chǎn)品性能等方面發(fā)揮著巨大作用，因此，在20世紀30年代以后被當作增塑劑廣泛添加于日用及工業(yè)的高分子塑料產(chǎn)品及包裝材料中。作為增塑劑，PAEs和AEs與塑料分子以氫鍵或范德華力連接，而并非共價聚合，為塑料產(chǎn)品提供了必要的可塑性。但由于全球塑料制品的大量使用和時間的推移，PAEs和AEs從塑料分子中溶解出來，造成環(huán)境的污染［1］。目前，PAEs和AEs在全球的生態(tài)環(huán)境中已達到了普遍檢出的程度，在空氣、土壤、水體、食品，甚至在生物體中均檢測到了 PAEs和 AEs的存在［2，3］。

由于PAEs和AEs具有親脂性、殘留期長及難以降解等特點，會通過食物鏈逐級傳遞并富集，最后以較高的濃度蓄積在人體或動物體內(nèi)［3，4］。近年來的動物實驗顯示，極微量的PAEs和AEs即會干擾生物體內(nèi)激素的分泌，造成動物生殖擾亂，包括精囊萎縮、精子數(shù)量減少以至于精子形成中止、生殖能力下降、后代數(shù)量減少、體重下降、子宮粘膜組織增生等［5］。鄰苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）是一種常見PAEs類增塑劑，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)DEHP會影響小鼠體內(nèi)的過氧化物酶的合成，造成肝臟、腎臟和甲狀腺衰竭［6］，雌鼠懷孕期間暴露DEHP會引起孕期縮短，并造成胎鼠的性別異常［7］。AEs類物質(zhì)也具有潛在毒性，如己二酸二（2-乙基己基）酯（DEHA）屬于三類致癌物，在體內(nèi)長期積累會導致畸形、癌變和致突變。動物實驗顯示，高劑量DEHA能引起老鼠產(chǎn)生肝臟腫瘤，影響胎鼠發(fā)育［8］；對胎體發(fā)育有一定影響，可造成出生Wistar仔鼠體重明顯下降，當DEHA達到一定劑量后，可使小鼠致死［9］。另外，PAEs和AEs的綜合毒性也不容忽視，Jarfelt等［10］研究表明，DEHA會調(diào)控DEHP對Wistar仔鼠的影響，且兩者的綜合作用會導致Wistar鼠產(chǎn)仔數(shù)下降，出生后死亡率升高。

基于PAEs和AEs的毒性和污染普遍性，本文總結(jié)了當前PAEs和AEs化合物的分析方法和檢測手段，并綜述了其在生物體中的污染情況及安全評價進展，以期對控制其應用，建立增塑劑在生物體中的殘留量和相關標準提供參考。

1 PAEs和AEs的檢測方法

1.1 生物樣品的前處理方法

生物樣品前處理是目前生物體分析的瓶頸，而且往往是測定誤差的主要來源。常用的PAEs和AEs前處理方法有液-液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）、液-液微萃取（liquid-phase micro-extraction，LPME）、固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）、固相微萃取（solid-phase Microextraction，SPME）、索氏提?。⊿oxhlet extraction，SE）、超臨界流體萃?。╯upercritical fluid extraction，SPE）、超聲萃?。╱ltrasonic extraction）、微波輔助萃?。╩icrowave assisted extraction，MAE）和加速溶劑萃?。╝ccelerated solvent extraction，ASE）等［11］。

液-液萃取、液-液微萃取、固相萃取以及固相微萃取主要適用于水樣和大氣樣品的檢測，如朱莉萍等［12］采用中空纖維膜-液相微萃取結(jié)合GC-MS對蔬菜汁中15種鄰苯二甲酸酯進行檢測，并對萃取溶劑、振蕩速度、振蕩時間等條件進行了優(yōu)化；童寶鋒等［13］對比了C18固相萃取和液液萃取兩種前處理方法測定水中的PAEs和AEs；張偉亞等［14］采用固相微萃取技術測定了塑料浸泡液中DEHA的含量，并考察了鹽效應、萃取溫度、萃取時間和熱解吸時間對方法靈敏度的影響。而生物樣品由于基質(zhì)復雜，因而樣品的提取方式和凈化在測定PAEs和AEs的過程中非常關鍵，通常采用索氏提取、超聲提取、微波萃取等方法初步富集分離后，再對提取液進行富集或凈化后進行分析檢測［15］。

索氏提取主要利用溶劑回流和虹吸原理，使溶劑反復萃取固體物質(zhì)，從而使被提取物溶解于溶劑中，優(yōu)點是設備花費低且易于操作，缺點是提取耗時長，提取過程需要消耗大量的溶劑，易對環(huán)境造成污染［16］。超聲波提取是利用超聲波的空化效應、熱效應以及機械作用提取樣品中的目標成分，樣品適用范圍廣。微波萃取利用電磁場的作用使樣品中的有機成分與基體有效的分離，具有熱效率高、升溫快速均勻，試劑用量少，節(jié)能污染小等特點［16，17］。陳麗旋等［18］對比了微波萃取、超聲波萃取、索氏提取3種預處理方法對土壤或沉積物中PAEs的提取效果。結(jié)果表明，微波萃取、超聲波萃取比索氏提取方法提取效率更高，所需溶劑更少。

傳統(tǒng)的樣品前處理通常需要大體積的溶劑，且消耗時間長，很難實現(xiàn)自動化。加速溶劑萃取法（ASE）利用升高溫度和增加壓力來提高物質(zhì)溶解度和溶質(zhì)擴散效率，其突出的優(yōu)點是萃取效率高、萃取時間短、自動化程度高、有機溶劑用量少、對環(huán)境二次污染小等?，F(xiàn)常用來取代索氏提取、超聲提取、微波萃取等方法［19］。超臨界流體萃?。⊿FE）是利用超臨界條件下的流體作為萃取劑，從樣品中取出待測組份的分離技術。ASE與SFE的萃取效率相近，原理相似。ASE使用常規(guī)的有機溶劑萃取，而SFE的萃取溶劑為液態(tài)CO2，對環(huán)境的影響小，可以說是一項比較理想的清潔的樣品前理技術。邵海洋等［20］采用ASE法對沉積物中PAEs物質(zhì)進行提取，建立了快速溶劑萃?。瘹庀嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用（GC／MS）檢測沉積物中16種PAEs物質(zhì)的方法，該前處理方法處理簡單，定性與定量分析準確可靠。任麗等［21］用吸附劑對黃河水中的有機污染物富集，比較超臨界CO2萃取和溶劑洗脫水中的4種PAEs物質(zhì)含量，并進行了GC-MS定性。結(jié)果表明，采用超臨界CO2萃取PAEs的萃取效率比溶劑萃取效率略高。

近幾年來國內(nèi)外關于生物體中PAEs和AEs類化合物的前處理技術的報道較多。相對而言，超聲、微波及索氏提取等方法雖然都能檢測到PAEs和AEs含量，但是整個前處理過程耗費大量有機溶劑，且費時費力，計量準確度不高，檢測限達不到要求。而超臨界流體萃取、加速溶劑萃取等樣品前處理技術少用或不用有機溶劑，對環(huán)境友好，且萃取效率高，分析結(jié)果準確度和精密度高，已逐步應用于生物樣品中痕量PAEs和AEs的提取。

1.2 PAEs和AEs的測定方法

1.2.1 色譜法 近年來，國內(nèi)外對PAEs和AEs的分析方法報道逐漸增多，并且隨著現(xiàn)代儀器和分析手段的發(fā)展，氣相色譜法、液相色譜法、熒光光譜法、紅外光譜法、核磁共振法、薄層色譜法以及毛細管電泳法等已被廣泛地用來檢測分析水、大氣、土壤及食品等固體樣品中PAEs和AEs［15，16］。尤其是色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術，由于其具有分離效率高、靈敏度高、用樣量少，同時通過離子監(jiān)測模式可以確定化合物的分子量分子式甚至官能團，實現(xiàn)有效的定性定量等優(yōu)點在PAEs和AEs檢測中得到廣泛的應用。如劉俊等［22］采用氣相色譜-質(zhì)譜法同時測定食品包裝材料中14種PAEs和5種AEs類增塑劑，在優(yōu)化的實驗條件下，19種目標物的平均回收率達到85%～108%，相對標準偏差（RSD）為0.16%～2.7%。郭春海等［23］則利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術分析PVC包裝材料中46種增塑劑，各組分檢出限均在0.005～0.05mg／kg之間。Ezerskis等［24］也利用氣相色譜-質(zhì)譜分析比較了不同PVC食品包裝材料中AEs的含量，實現(xiàn)了有效的定性定量。

1.2.2 免疫分析法 雖然氣相色譜、高效液相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術能快速分析生物樣品中的PAEs和AEs，但這些分析方法對儀器條件要求高，前處理的操作過程相對復雜、耗時。近年來，隨著生物技術的發(fā)展，免疫分析尤其是酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）由于不需要昂貴的儀器設備，且特異性強、靈敏度高、操作簡便快捷，在現(xiàn)場篩選和大量樣本的快速檢測中顯示出獨特的優(yōu)勢。張明翠［25］通過合成5種PAEs半抗原衍生物與載體蛋白BSA偶聯(lián)形成全抗原和抗體，并采用熒光免疫技術和免疫實驗，建立了快速測定PAEs類環(huán)境激素的固相抗原競爭熒光免疫分析方法，可應用于水樣和塑料溶出液的測定。李樂［26］運用混合酸酐法將鄰苯二甲酸單丁酯（MBP）與載體蛋白BSA分別以不同的偶聯(lián)比率進行連接，制備成三種偶聯(lián)比率的免疫抗原對小鼠進行免疫，確定了最佳偶聯(lián)比，并建立了MBP的ELISA檢測方法，其檢測范圍為0.8～1 000 ng／mL，最低檢測限為0.8ng／mL，這為今后制備檢測MBP的酶聯(lián)免疫試劑盒和膠體金的研制奠定了一定的基礎。魏晨曦［27］建立了兩種基于鄰苯二甲酸二丁酯（DBP）單抗的ELISA檢測方法，采用人工抗原包被間接競爭ELISA和半抗原包被間接競爭ELISA檢測方法，檢測的線性范圍分別是11.56～863.72μg／L和2.16～155.92μg／L；最低檢測限分別為（9.21±1.28）μg／L和（0.93±0.20）μg／L，并對水樣進行的DBP添加回收試驗，回收率都接近100%，檢測靈敏度和準確性可以滿足水環(huán)境中DBP的殘留檢測要求。

1.2.3 PCR法 利用具有高靈敏度的聚合酶鏈式反應（PCR）檢測技術檢測PAEs也逐漸受到關注。白舟等［28］從魚肝臟中提取含雌激素受體的細胞溶質(zhì)，與不同濃度的PAEs結(jié)合，采用常規(guī)PCR方法擴增制備雙鏈結(jié)合DNA，將其與配體-受體復合物反應的結(jié)合物，用核酸外切酶ExoⅢ和S1核酸酶處理，消解游離DNA，并以消解后產(chǎn)物作為模板，進行熒光定量PCR擴增反應，該方法應用于水樣中PAEs的檢測，最低檢測限達到10～100μg／mL。

2 PAEs和AEs的污染及安全評價研究

2.1 水體環(huán)境污染

由于PAEs和AEs是中等極性化合物，因而在水中的溶解性小，進入水環(huán)境的PAEs和AEs主要在水體中發(fā)生相應的吸附、富集以及遷移轉(zhuǎn)化等一系列反應［29］。作為一種典型的疏水性化合物，PAEs和AEs與沉積物的相互作用是其突出的特點，調(diào)查發(fā)現(xiàn)水體中的PAEs不斷向底泥中遷移［30，31］。Srivastava 等［32］對印度Gomti河中30個不同位置的沉積物樣品中的PAEs進行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)DMP、DEP、DBP、DEHP和DOP這些物質(zhì)含量較高，分別為10.54μg／kg、4.57μg／kg、10.41μg／kg、31.61μg／kg和5.16μg／kg，其中DEHP的檢出率最高。

2.2 水生生物污染

我國海洋水體資源豐富，水生生物中如養(yǎng)殖淡水魚、螄螺等生活環(huán)境基本固定，當水環(huán)境受到污染后，在濾食餌料等過程中不可避免地從水、底泥中吸入PAEs和AEs。雖然PAEs和AEs在水環(huán)境中的初始濃度不是很高，并不足以構(gòu)成對人和生物的直接危害，但是通過食物鏈的逐級傳遞和生物放大效應，可使這些環(huán)境中痕量的物質(zhì)，在高營養(yǎng)級生物體內(nèi)的含量提高幾十倍甚至成千上萬倍，因而可能對人和高等生物造成危害。王兆梅等［33］測得廣東省主要養(yǎng)殖基地的羅非魚體內(nèi)PAEs污染物主要有DMP、DEHP、DBP和DEP，其中DBP含量高達38mg／kg，其余三種PAEs含量在16～25mg／kg之間。Glam 等［34］對墨西哥灣魚體中PAEs進行了測定，DEHP含量為5μg／g。Aranda等［35］的研究表明，動物對PAEs有一定富集作用，某些魚類的生物富集因子高達102～104。張?zhí)N暉等［36］發(fā)現(xiàn)PAEs的含量呈現(xiàn)出水體＜土壤＜底泥＜水生生物的趨勢，不同水生物對PAEs的生物富集程度不同，泥螺和蝦較易富集DEP和DBP，而魚類和河蚌較易富集DEHP。對養(yǎng)殖池塘中3種淡水魚類（草魚、鯽魚和羅非魚）體內(nèi)6種PAEs含量的測定結(jié)果表明，這些魚類均受到DEHP、DBP和DOP的污染［37］。在模擬受控條件下，4種PAEs化合物在龍須菜-籃子魚食物鏈中存在積累放大現(xiàn)象，表現(xiàn)為：DEHP＞DBP＞DEP＞ DMP［38］；在30d的食物暴露條件下，總含量分別為1.72mg／kg、3.11 mg／kg、0.41mg／kg和0.08mg／kg，在魚體不同組織中富集程度不一，DEHP和DBP在內(nèi)臟組織中有較高的積累和分布，其次為魚殘體組織，肌肉組織中含量最低［39］。

2.3 安全評價研究

PAEs和AEs在全球塑料制品中廣泛存在，并在生物體中存在累積效應等，因此很多國家和組織紛紛出臺相應的標準和法規(guī)，明確規(guī)定塑料包裝材料中PAEs和AEs的最大使用量和遷移限量，以降低增塑劑對生物體所造成的危害。如日本于2002和2003年發(fā)布通報，規(guī)定PVC醫(yī)療器械中禁止使用 DEHP［40］；歐盟2005／84／EC標準中規(guī)定在所有兒童玩具PVC材料中禁止使用鄰苯二甲酸二己酯，鄰苯二甲酸二丁酯和鄰苯二甲酸苯基丁酯，且在2002／72／EC中規(guī)定包裝材料中DEHA向食品中的遷移量必須小于18mg／kg；韓國在2005年6月規(guī)定，PVC食品包裝材料中禁止使用DEHA［41］。我國也已出臺的相應的衛(wèi)生標準要求地表水、食品PVC包裝材料中禁止使用鄰苯二甲酸酯和DEHA，但對生物體中PAEs和AEs的限量標準并未涉及。因此，如何有效地降解塑料中的增塑劑以及采用無毒增塑劑，如檸檬酸三丁酯、乙酰檸檬酸三丁酯（ATBC）來代替PAEs和AEs以保障生物體的安全性是今后增塑劑研究的熱點。

3 展望

由于生物基質(zhì)的復雜性，樣品前處理過程仍然是分析PAEs和AEs的“瓶頸”步驟。因此，開發(fā)操作簡便、快速、無污染的前處理技術和在線檢測將是分析和檢測PAEs和AEs的一個趨勢。而且，目前生物體中關于PAEs的檢測較多，而AEs的分析涉及還很少，因此有必要開展多組分同時分析，可以大大降低檢驗投入。另外，PAEs和AEs在生物體中累積的影響尤其值得關注，研究揭示PAEs和AEs向生物體遷移的規(guī)律，闡明其在生物體中的富集機制，建立增塑劑在生物體內(nèi)的殘留量及相關衛(wèi)生標準，是未來研究的重要方向。

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