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    液相芯片分析技術(shù)檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者血清中VEGF和MMP-9的臨床意義

    2014-04-08 11:25:46張君瑩吳建中季明華曹海霞唐金海
    中國(guó)腫瘤外科雜志 2014年2期
    關(guān)鍵詞:浸潤(rùn)性乳腺芯片

    張君瑩,吳建中,季明華,張 燁,尹 麗,徐 濤,羅 舟,馬 蓉,曹海霞,唐金海

    乳腺癌的發(fā)病率呈逐年遞增趨勢(shì),居女性惡性腫瘤之首,遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是造成治療失敗和患者死亡的主要原因。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變和血管生成是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵,其中基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在此過(guò)程中起到了重要作用。MMPs通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)以及細(xì)胞間接觸等方式促進(jìn)上皮細(xì)胞與周圍組織分離,促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。VEGF是目前已知的最關(guān)鍵、作用最強(qiáng)的血管生長(zhǎng)刺激因子,促進(jìn)毛細(xì)血管袢形成并向瘤體內(nèi)延伸,加速腫瘤組織生長(zhǎng),此外通過(guò)增加血管通透性,協(xié)助腫瘤細(xì)胞進(jìn)入脈管系統(tǒng),促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。VEGF和MMPs均參與惡性腫瘤的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移過(guò)程,且兩者可能存在協(xié)同作用[1]。相較于傳統(tǒng)的ELISA等檢測(cè)方法,液相芯片分析技術(shù)有其明顯優(yōu)勢(shì),芯片技術(shù)靈敏度更高,精確值亦可達(dá)到0.01 pg/ml。本研究通過(guò)高通量液相芯片技術(shù)檢測(cè)了正常人、良性乳腺纖維瘤和乳腺癌患者血清MMP-9和VEGF的表達(dá),旨在探討其表達(dá)水平在乳腺癌臨床診斷、治療及預(yù)后評(píng)估中的意義。

    1 資料和方法

    1.1 臨床資料 收集2011年9月至2012年12月在江蘇省腫瘤醫(yī)院就診的384例患者以及未罹患乳腺相關(guān)疾病的正常人40例,均為女性,其中乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(infiltrative ductal carcinoma, IDC) 301例,其中有118例IDC患者于術(shù)后復(fù)查VEGF、MMP-9;乳腺纖維瘤患者83例,所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)證實(shí)。根據(jù)國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)UICC建議的TNM分期將IDC組分為Ⅰ期125例,Ⅱ期58例,Ⅲ期98例,Ⅳ期20例;其中,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的為127例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為166例,未查到有無(wú)轉(zhuǎn)移為8例。本研究符合倫理學(xué)要求,口頭告知實(shí)驗(yàn)情況并經(jīng)患者同意簽署知情同意書。

    1.2 標(biāo)本收集 抽取患者及正常人清晨空腹靜脈血3 ml,將采集的靜脈血放于無(wú)內(nèi)毒素和熱源的試管中,上下振搖3次,室溫凝血30 min后2 500 rpm/min離心10 min。吸取血清,分裝后放于-80 ℃冰箱中保存待檢。

    1.3 儀器與試劑 本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)方法采用液相芯片分析技術(shù),F(xiàn)LEXMAP 3DTM(三維)系統(tǒng)由Luminex公司(USA)提供。用來(lái)檢測(cè)血清中VEGF和MMP-9的試劑盒Human Cytokine/Chemokine和Human CVD Panel 1均購(gòu)自上海Millipore貿(mào)易有限公司。

    1.4 實(shí)驗(yàn)步驟 操作步驟嚴(yán)格遵循說(shuō)明書。將收集在-80 ℃的血清放置4 ℃解凍,取200 μl血清至96孔板?;旌暇鶆蛩芰现榕c緩沖液,將混懸液每孔25 μl加至標(biāo)本檢測(cè)板中。然后逐步加入陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)標(biāo)本,25 μl每孔(以上操作均在冰上進(jìn)行)。依次加入檢測(cè)緩沖液,每孔25 μl。于室溫中振搖標(biāo)本檢測(cè)板,VEGF:16 h,MMP-9:2 h。洗板兩次后,每孔50 μl加入檢測(cè)抗體至標(biāo)本檢測(cè)板。室溫振搖1 h,加入鏈霉親和素-藻紅蛋白液。兩次洗板完畢后每孔100 μl向標(biāo)本檢測(cè)板中加入洗液。室溫中振搖5 min。蛋白質(zhì)全定量檢測(cè),開(kāi)機(jī)預(yù)熱30 min,設(shè)定儀器參數(shù)為如下,Events:50;Gate:8 000~15 000;Sample Size:VEGF 100 μl,MMP-9 50 μl;Time Out:60 s;Bead Region:VEGF 86#,MMP-9為27#。在檢測(cè)池中放入標(biāo)本檢測(cè)板,運(yùn)行相關(guān)檢測(cè)程序。最后用Xponent 4軟件分析檢測(cè)中產(chǎn)生的微球中位熒光讀數(shù),并獲得最終結(jié)果,以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布,使用非參數(shù)檢驗(yàn)。兩組間比較采用獨(dú)立樣Mann-WhitneyU檢驗(yàn),多組間比較采用獨(dú)立樣本Kruskal-Wallis單因素檢驗(yàn)。兩因子間相關(guān)分析采Spearman等級(jí)相關(guān),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用ROC曲線下面積分析評(píng)估血清中VEGF和MMP-9的水平對(duì)IDC患者的診斷價(jià)值。

    2 結(jié)果

    2.1 各組血清中VEGF和MMP-9的表達(dá) 各組血清中VEGF和MMP-9的水平見(jiàn)表1,血清中VEGF和MMP-9在乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者中的表達(dá)明顯高于乳腺纖維患者和正常人(均P<0.05)。

    表1 各組血清中VEGF、MMP-9的比較

    2.2 手術(shù)治療后IDC患者血清中VEGF和MMP-9的變化 118例IDC患者術(shù)后復(fù)查血清VEGF、MMP-9表達(dá)量分別(135.26±131.20) pg/ml和(680.36±551.77) ng/ml,與術(shù)前的(180.89±167.82) pg/ml和(903.92±704.76) ng/ml相比,表達(dá)水平明顯下降(均P<0.05)。

    2.3 VEGF和MMP-9與臨床病理特征的關(guān)系 IDC患者血清中VEGF和MMP9與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系見(jiàn)表2。乳腺癌患者血清中VEGF、MMP-9表達(dá)水平與年齡無(wú)關(guān)(均P>0.05);而與臨床分期、原發(fā)灶大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(均P<0.01)。

    表2 MMP-9和VEGF與未治療組乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌IDC臨床病理特征的關(guān)系

    2.4 VEGF和MMP-9兩者間的相關(guān)性 用Spearman秩和檢驗(yàn)分析顯示血清中VEGF和MMP-9兩者的表達(dá)水平呈正相關(guān)性(r=0.601,P<0.01),如圖1所示。

    圖1 VEGF和MMP9的相關(guān)性分析

    2.5 VEGF和MMP-9對(duì)于IDC的診斷價(jià)值 VEGF的ROC曲線下面積為0.788(95%置信區(qū)間:0.711~0.864),而MMP-9曲線下面積為0.861(95%置信區(qū)間:0.806~0.916)。由此可見(jiàn),血清VEGF和MMP-9對(duì)于IDC的診斷均具有一定的可信性。

    圖2 VEGF和MMP-9對(duì)于IDC診斷價(jià)值的ROC曲線

    3 討論

    新生血管形成與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),其為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)、氧氣,同時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)旁分泌作用及產(chǎn)生腫瘤生長(zhǎng)啟動(dòng)因子,直接促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。腫瘤血管的生成一般是促進(jìn)血管生成因子和抑制血管生成因子之間達(dá)到了某種動(dòng)態(tài)平衡的結(jié)果。在眾多促血管生成因子中,VEGF已經(jīng)被公認(rèn)為是作用很強(qiáng)的因子之一,其是一種內(nèi)皮細(xì)胞中特異性的有絲分裂原,通過(guò)與血管生成血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體-2(VEGFR-2)結(jié)合,強(qiáng)有力的增加血管通透性。MMP-9則可以通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF的生物利用度從而同樣促進(jìn)腫瘤血管生長(zhǎng),也可調(diào)節(jié)生成的腫瘤血管的穩(wěn)定性和滲透性。

    本研究結(jié)果顯示,乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(IDC)、乳腺纖維瘤以及正常人群中,IDC組VEGF和MMP-9的表達(dá)量明顯高于后兩者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí),良性病變?nèi)橄倮w維瘤組與正常人對(duì)比,前者血清VEGF和MMP-9的表達(dá)水平略高,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),兩者表達(dá)水平與腫瘤的TNM分期關(guān)系密切。有文獻(xiàn)報(bào)道表明,隨著TNM分期的進(jìn)展,血清VEGF的表達(dá)水平也隨之升高[2]。另有報(bào)道無(wú)論在三陰性乳腺癌中還是雌激素依賴的乳腺腫瘤中,MMP-9的表達(dá)水平也隨著IDC的臨床病理分期的提高而增加[3]。本研究結(jié)果與以上報(bào)道結(jié)果結(jié)論相一致。進(jìn)一步分析VEGF和MMP-9與腫瘤大小以及年齡的關(guān)系,研究結(jié)果顯示VEGF和MMP-9的表達(dá)和腫瘤大小關(guān)系密切,隨著腫瘤體積的增大,VEGF和MMP-9的表達(dá)水平呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。此與Goldhirsch等[4]及Rakha等[5]的研究結(jié)果相似。故我們認(rèn)為患者血清中VEGF和MMP-9的表達(dá)水平與原發(fā)灶大小存在相關(guān)性,可以從某種程度上預(yù)測(cè)乳腺癌預(yù)后。本研究顯示,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者血清中VEGF和MMP-9的水平顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者。VEGF能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖,增加細(xì)胞的滲透性,容易造成腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。而MMP-9則能夠破壞基底膜,導(dǎo)致癌細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此,VEGF和MMP-9的表達(dá)水平在一定層面上可以預(yù)示IDC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的高低。

    此外,我們?cè)诜治鲅芯縑EGF和MMP-9的相關(guān)性時(shí)發(fā)現(xiàn),二者之間存在正相關(guān)。Riedel等[6]曾經(jīng)報(bào)道VEGF和MMP-9之間存在著協(xié)同作用,可以作為腫瘤血管生成與腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)標(biāo)志。Zucker等[7]發(fā)現(xiàn)VEGF能夠間接促進(jìn)MMP-9的分泌并增加其活性。因此,聯(lián)合檢測(cè)VEGF和MMP-9的表達(dá)對(duì)于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。

    本研究通過(guò)液相芯片分析技術(shù)在血清中檢測(cè)因子,較之外科手術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附等方法,其具有以下顯而易見(jiàn)的優(yōu)點(diǎn):芯片技術(shù)靈敏度高,較傳統(tǒng)ELISA 法高2~3個(gè)數(shù)量級(jí),檢測(cè)值可以精確到0.01 pg/ml。液相環(huán)境對(duì)于生物大分子的天然構(gòu)象保持更有利,利于探針與檢測(cè)物的反應(yīng);血樣標(biāo)本容易收集,成本較低,創(chuàng)傷小,患者接受程度高,容易操作,術(shù)前、術(shù)中及術(shù)后均可檢測(cè),可重復(fù)性好。利用液相芯片技術(shù)檢測(cè)血清中核酸、蛋白質(zhì)生物大分子,如臨床細(xì)胞因子、腫瘤標(biāo)志物等,較傳統(tǒng)ELISA法更準(zhǔn)確、靈敏與快速,高通量,重復(fù)性好,節(jié)省樣品和時(shí)間。

    當(dāng)然,僅在血清中檢測(cè)VEGF和MMP-9可能有所局限。因?yàn)橛醒芯勘砻餮“鍟?huì)釋放VEGF至血清中,血清中的VEGF和血小板的計(jì)數(shù)高度相關(guān)。因此,有學(xué)者認(rèn)為檢測(cè)血漿中VEGF對(duì)于反映血循環(huán)中VEGF更精準(zhǔn)[8]。關(guān)于VEGF和MMP-9對(duì)于乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌的預(yù)后等關(guān)系將來(lái)需要進(jìn)行大規(guī)模的研究證實(shí)。

    參考文獻(xiàn):

    [1] Riedel F,Gotte K,Bergler W,et al.Inverse correlation of apoptotic and angiogenic markers in squamous cell carcinoma of the head and neck[J].Oncol Rep,2001,8(3):471-476.

    [2] Hao L,Zhang C,Qiu Y,et al.Recombination of CXCR4, VEGF, and MMP-9 predicting lymph node metastasis in human breast cancer[J].Cancer lett,2007,253(1):34-42.

    [3] Pellikainen JM,Ropponen KM,Kataja VV,et al.Expression of matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9 in breast cancer with a special reference to activator protein-2, HER2, and prognosis[J].Clin Cancer Res,2004,10(22):7621-7628.

    [4] Goldhirsch A,Glick JH,Gelber RD,et al.Meeting highlights: international expert consensus on the primary therapy of early breast cancer 2005[J].Ann Oncol,2005,16(10):1569-1583.

    [5] Rakha EA,El-Sayed ME,Green AR,et al.Prognostic markers in triple-negative breast cancer[J].Cancer,2007,109(1):25-32.

    [6] Riedel F,Gotte K,Bergler W,et al.Inverse correlation of apoptotic and angiogenic markers in squamous cell carcinoma of the head and neck[J].Oncol Rep,2001,8(3):471-476.

    [7] Zucker S,Mirza H,Conner CE,et al.Vascular endothelial groth factor induces tissue factor and matrix metalloproteinase production in endothelial cells: Conversion of prothrombin to thrombin results in progelatininase activation and cell proliferation[J].Int J Cancer,1998,75(5):780-786.

    [8] Reeves KW,Ness RB,Stone RA,et al.Vascular endothelial growth factor and breast cancer risk[J].Cancer Causes & Control,2009,20(3):375-386.

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