自身抗體檢測在早期診斷原發(fā)性膽汁性肝硬化的研究進(jìn)展

門翼君，馬順高，秦紅群

（1. 大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，大理 671000；2. 云南省大理州人民醫(yī)院檢驗科，大理 671000）

原發(fā)性膽汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis, PBC）是一種病因不明，以肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞進(jìn)行損傷為主要特征的自身免疫性疾病。多見于中年女性。病理學(xué)特點為非化膿性的小葉間膽管炎、匯管區(qū)淋巴細(xì)胞聚集甚至形成淋巴濾泡，有非干酪樣肉芽腫形成，最終小葉間膽管消失，可導(dǎo)致肝細(xì)胞破壞、肝纖維化、肝硬化和肝衰竭[1,2]。其臨床診斷主要是根據(jù)臨床表現(xiàn)，生化指標(biāo)，自身抗體檢測以及病理學(xué)檢查。PBC患者的臨床表現(xiàn)主要為疲乏無力，瘙癢，黃疸，其臨床表現(xiàn)缺乏特異性。PBC診斷根據(jù)2009年歐洲肝病學(xué)會和美國肝病學(xué)會診斷標(biāo)準(zhǔn)[3,4]，符合以下3項中的至少2項：（1）堿性磷酸酶大于2倍正常值上限或γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶大于5倍正常值上限，（2）抗線粒體抗體或抗線粒體抗體M2亞型陽性，（3）特征性小膽管損害的病理學(xué)改變。病理學(xué)改變的確診需要進(jìn)行肝活檢，其操作危險性也較高，所以病人對于病理活檢接受程度較差，而在對沒有肝臟疾病臨床表現(xiàn)的PBC患者的長期隨訪觀察顯示，相關(guān)的自身抗體可在PBC開始出現(xiàn)臨床癥狀的幾年甚至十幾年之前在患者的血清中被檢測到[5]。故自身抗體檢測在早期診斷PBC有著重要意義。本文就自身抗體檢測在診斷PBC的研究進(jìn)展作以綜述。

1 抗核抗體（Antinuclear antibodies, ANA）的檢測

ANA是一種廣泛存在于血清中的抗體，可見于多種自身免疫性疾病，而在健康老年人中也可見低滴度抗核抗體[6]。ANA是診斷PBC的重要標(biāo)志之一。ANA檢測方法有很多種，醫(yī)院中常用的方法為間接免疫熒光法，免疫印跡法和酶聯(lián)免疫吸附法。作為PBC的初篩實驗，我們一般采用間接免疫熒光法，間接免疫熒光法具有快速，價格較低等優(yōu)勢。通過間接免疫熒光法檢測ANA在PBC患者中可出現(xiàn)多種熒光核型，如核膜型，核點型，細(xì)胞胞漿型和著絲點型。據(jù)國內(nèi)劉紅虹等[7]對123例PBC患者實驗室檢測指標(biāo)進(jìn)行了分析，54例ANA陽性的PBC患者中，有33例為核膜型，約占61%。血清AMA檢測在PBC患者中的陽性率可以達(dá)到90%～95%，是診斷PBC的重要免疫學(xué)指標(biāo)。然而仍有5%～10%的PBC患者因AMA檢測陰性而被延誤診斷與治療。故相關(guān)的ANA檢測對AMA陰性的PBC患者的診斷十分關(guān)鍵。

1.1 抗-核包膜蛋白gp210

抗gp210抗體是一種抗核包膜蛋白抗體，為診斷PBC的高度特異性抗體。抗gp210抗體在PBC患者的特異性可高達(dá)99% ，但敏感性僅為10%～41%[8]?？筭p210抗體的熒光染色型為核膜型?？筭p210抗體的靶抗原為位于核孔復(fù)合物上的210kD跨膜糖蛋白，其所識別的表位是gp210羧基末端上15個氨基酸殘基。國外相關(guān)文獻(xiàn)報道[9]，抗gp210抗體也存在于20%～47%的AMA陰性PBC患者中。這對于AMA陰性的PBC患者的早期診斷至關(guān)重要。相關(guān)文獻(xiàn)表示，抗gp210抗體還可提示疾病預(yù)后[10]，其陽性的PBC患者與陰性者相比，更容易發(fā)展為肝衰竭，說明抗gp210抗體還可以作為PBC患者的獨立預(yù)后指標(biāo)，對患者的進(jìn)展及預(yù)后的判斷具有重要價值。

1.2 抗-可溶性酸性磷酸化核蛋白Sp100

spl00是一種核蛋白，是一種分子量100kDa的可溶性酸性磷酸化核蛋白質(zhì)，點狀分布于細(xì)胞核內(nèi)?？筭p210抗體的熒光染色型為多核點模型。spl00抗體診斷PBC特異性較高，尤其在大部分AMA陰性PBC患者血清中可被檢測到。國外相關(guān)研究[11,12]顯示，抗核點抗體sp100不僅對PBC診斷特異性高，可達(dá)到為97%[13]，且對疾病監(jiān)測、預(yù)后判斷很有價值[14]，Muratori等[12]報道，老年人更容易表達(dá)spl00抗體。據(jù)國內(nèi)潘盈等人的研究[15]表示，該抗體陽性的PBC患者出現(xiàn)肝硬化的幾率顯著增高，血清中膽紅素升高，患者病情進(jìn)展速度快，預(yù)后較差。說明抗SP100抗體對于PBC患者疾病的進(jìn)展與預(yù)后有著十分重要的意義。然而抗sp100抗體對于診斷PBC的敏感性較低，我們可以進(jìn)行多種自身抗體的聯(lián)合檢測，將抗gp120抗體與抗sp100抗體、AMA進(jìn)行聯(lián)合檢測，從而同時提高診斷PBC的特異性和敏感性。

1.3 抗著絲點抗體（Anticentromere antibodies, ACA）

ACA的靶抗原是著絲點蛋白A、B和C，其中著絲點蛋白B是最主要的靶抗原。ACA不僅可見于硬皮病，其在PBC患者血清中也有較高的陽性率。史旭華等[16]人研究顯示，ACA在PBC患者中的陽性率為53.5%，尤其是高滴度的ACA，可作為PBC的另外一種免疫學(xué)標(biāo)志。Nakamura等[17]研究顯示，ACA陽性PBC患者與ACA陰性患者相比。門靜脈高壓表現(xiàn)更為突出.。ACA陽性代表的門脈高壓型PBC患者的臨床特點為無進(jìn)展性黃疸的靜脈曲張。

1.4 其它抗核抗體

抗PML抗體是快速診斷急性早幼粒細(xì)胞白血病的重要免疫學(xué)標(biāo)志，但也可見于PBC患者血清中。國外相關(guān)研究[18]顯示，約19%的PBC患者血清中可檢測到抗PML抗體，并且抗PML抗體和抗sp100抗體經(jīng)常相伴出現(xiàn)。

抗釀酒酵母菌抗體（Anti-Saccharomyces cerevisiae Antibodies，ASCA）是針對釀酒酵母菌細(xì)胞壁甘露聚糖成分的一種抗體。既往研究報道顯示，ASCA主要見于克羅恩病患者血清中，是克羅恩病患者血清中的特異性自身抗體[19]。該抗體還可見于乳糜泄[20]等多種自身免疫性疾病患者的血清中。ASCA分為IgA和IgG兩種亞型，根據(jù)國內(nèi)胡朝軍等人的研究[21]顯示ASCA-IgA在PBC患者中的陽性率為24.2%，ASCA-IgG在PBC患者中的陽性率為13.6%，在PBC患者ASCA不同亞型的陽性和陰性組與肝功能分析結(jié)果顯示ASCA-IgA與PBC患者的病情發(fā)展密切相關(guān)，較ASCA-IgG在PBC中有更重要的臨床意義。ASCA是PBC患者血清中存在的自身抗體，并且ASCA在中國人群的PBC患者中陽性率高于國外的文獻(xiàn)報道。

抗p62抗體，抗板層素抗體與抗LBR抗體均屬于抗核包膜蛋白抗體?？筽62抗體又稱抗核心蛋白抗體，抗p62抗體的靶抗原是位于核孔復(fù)合物上的62 kDa跨膜蛋白，LBR抗體又稱抗核板層B受體抗體，LBR抗體的靶抗原是由60個氨基酸組成的核內(nèi)膜多肽蛋白，李永哲等[22]研究顯示通過ELISA檢測PBC患者血清結(jié)果顯示，抗p62抗體與抗LBR抗體陽性率分別為30.9%和5.9%。但抗p62抗體與抗LBR抗體僅在PBC患者血清中檢測出，其特異性為100%。其極高的特異性提示抗p62抗體與抗LBR抗體可能與疾病的病理生理過程有關(guān)。抗板層素抗體又稱抗核纖層抗體，并不是PBC患者血清中特有的自身抗體，能在多種疾病患者血清中檢測到如自身免疫性肝炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡。根據(jù)靶抗原不同分為抗板層素A抗體、抗板層素B、抗體和抗板層素C 抗體三種亞型。一般情況下，PBC患者血清中能檢測到抗板層素抗體A和C，抗板層素抗體的臨床意義有待于深入研究。

2 抗線粒體抗體（Antimitochondrial antibody, AMA）檢測

AMA是一種以線粒體為靶抗原，無種屬和器官特異性的自身抗體，主要針對線粒體兩層生物膜蛋白。該抗體主要是IgG。線粒體存在于多種組織細(xì)胞胞漿中，故其熒光模型為胞漿顆粒型。線粒體的靶抗原位于線粒體內(nèi)外膜，AMA作為一種自身抗體可進(jìn)入細(xì)胞，直接與線粒體靶抗原發(fā)生中和作用，導(dǎo)致組織細(xì)胞的損傷[23]。1965 年Walker 等[24]首次采用間接免疫熒光法，發(fā)現(xiàn)PBC患者血清中存在一種物質(zhì)，經(jīng)鼠肝線粒體預(yù)處理后可阻斷這種間接免疫熒光反應(yīng)，證實該物是AMA。

AMA是診斷PBC最重要的特異性抗體，將近95%的PBC患者AMA陽性[25]。此抗體的出現(xiàn)可早于臨床癥狀出現(xiàn)前若干年，具有十分重要的早期診斷價值。根據(jù)線粒體內(nèi)外膜上能與AMA反應(yīng)的9種自身抗原，將AMA分為9 種亞型（Ml～M9），不同的亞型其臨床意義存在差異，與PBC診斷相關(guān)的是M2、M4、M8 和M9亞型。

2.1 AMA-M2抗體檢測

AMA-M2是目前輔助診斷PBC主要檢查項目。AMA-M2對PBC檢測的敏感性達(dá)93%以上，特異性幾乎為100%[26]。AMA-M2的靶抗原主要是線粒體內(nèi)膜上的丙酮酸脫氫酶復(fù)合體（PDC-E2）、酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體(OGDC-E2)和支鏈二氧酸脫氫酶復(fù)合體(BCOADC-E2)。

AMA-M2的主要檢測方法有：間接免疫熒光法、免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法，不同方法的敏感性和特異性不同。間接免疫熒光法是檢測AMA-M2的經(jīng)典檢測方法，國內(nèi)相關(guān)研究[26]表明根據(jù)其滴度水平越高，對PBC診斷更具意義，但AMA-M2抗體滴度水平與疾病嚴(yán)重程度之間無相關(guān)性。但是其結(jié)果判斷主要依賴于檢驗人員的熟悉程度，尤其當(dāng)AMA滴度較低時容易造成漏診。而免疫印跡法與ELISA可將三個靶抗原PDC—E2、OGDC-E2和BCOADC-E2與天然M2抗原形成的復(fù)合體（M2-3E/BPO）作為檢測抗原，國外相關(guān)文獻(xiàn)[27]報道，對于3個靶抗原的檢測重組成的三聯(lián)體蛋白，使其診斷PBC的敏感性和特異性都會升高。82%的PBC患者血清皆與這個三聯(lián)體抗原反應(yīng)，在正常人群中卻沒有與該抗原反應(yīng)的抗體[28]。這表明M2-3E 對PBC 的診斷有較強(qiáng)的特異性。

國內(nèi)相關(guān)研究[29,30]表明，AMA-2，AMA-4，AMA-9聯(lián)合檢測在診斷PBC中的意義并不優(yōu)于單獨檢測AMA-M2,而檢測的成本明顯增高。

2.2 AMA-M4抗體檢測

AMA-M4所針對的抗原是亞硫酸氧化酶（PDC-E1），AMA-M4是分子量為52 kDa 的單抗原。統(tǒng)計既往國內(nèi)文獻(xiàn)[30～32]顯示該抗體陽性率在42.6%～53.3%。現(xiàn)為AMA-M4是一個重要的判斷病情程度的抗體，提示疾病處于進(jìn)展期，或者是病人病情較重、預(yù)后不佳[33]。因此對M2亞型陽性患者可再做M4亞型檢測，以作判斷病情進(jìn)展。

2.3 AMA-M8抗體檢測

AMA-M8針對的抗原位于線粒體外膜。AMA-M8只與AMA-M2同時出現(xiàn)，但并非所有AMA-M2陽性時都出現(xiàn)ANAM8陽性。若AMA-M2，AMA-M4，AMA-M8的同時存在PBC患者血清中，可說明疾病處于活動期。

2.4 AMA-M9抗體檢測

AMA-M9針對的抗原為糖原磷酸化酶(胞漿酶)，包含四個分子量為98kDa的亞單位[34]。歐蒙公司質(zhì)控顯示M9亞型抗體在PBC病人的陽性率為9%～37%。AMA-M9可于AMAM2陰性的PBC患者血清中檢測呈陽性。Klein等[35]研究認(rèn)為與AMA-M4相反，AMA-M9被認(rèn)為是提示處于病情早期或病情預(yù)后樂觀的抗體，AMA的分型能夠提示預(yù)后。而Joshi等[36]則認(rèn)為AMA的分型對于估計預(yù)后是否樂觀沒有幫助，Vleggaar等[37]也認(rèn)為AMA的分型沒有預(yù)后意義。

綜上所述，自身抗體檢測不僅在早期診斷PBC上有著重要意義，對PBC疾病進(jìn)展，疾病分期，治療以及預(yù)后也有著不可缺少的作用。隨著方法的不斷改進(jìn)，研究的不斷深入，越來越多新的與PBC相關(guān)的自身抗體會被發(fā)現(xiàn)，同時提高對于PBC的特異性和敏感性，從而成為新的免疫學(xué)指標(biāo)。

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