載脂蛋白B基因多態(tài)性與激素性股骨頭壞死筋脈淤滯證的相關性

曾 平，梁景超，韋向東，韋標方

(1廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，南寧530001;2廣西中醫(yī)藥大學;3橫縣人民醫(yī)院;4臨沂市人民醫(yī)院)

激素性股骨頭壞死(SONFH)是骨科臨床常見病與疑難病，屬于中醫(yī)“骨蝕”范疇，臨床上以筋脈瘀滯證與肝腎虧虛證多見。研究發(fā)現(xiàn)，脂代謝紊亂在SONFH的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用，而位于ApoB基因外顯子的兩個位點XbaⅠ(rs693)和EcoRⅠ(rs1042031)的多態(tài)性與脂代謝紊亂有關。已有證據(jù)表明，載脂蛋白B(ApoB)基因多態(tài)性與SONFH關系密切［1，2］，且與中醫(yī)證型相關［3，4］，而 SONFH 的發(fā)病與遺傳易感性有關［5］。關于ApoB基因多態(tài)性與SONFH遺傳易感性的關系目前尚未見報道。為此，我們于2010年1月～2013年12月進行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2010年1月～2013年12月于廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院、臨沂市人民醫(yī)院及廣西橫縣人民醫(yī)院住院治療確診為SONFH的患者108例，其中男 53例，女 55例，年齡(39.85±10.07)歲;診斷參照《股骨頭壞死診斷與治療的專家建議》［6］，中醫(yī)辨證分型參照《中藥新藥臨床研究指導原則(試行)》［7］筋脈瘀滯證64例(筋脈瘀滯組)，肝腎虧虛證44例(肝腎虧虛組);使用腎上腺皮質激素的原發(fā)病為格林巴利綜合征9例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡30例，腎病綜合征16例，腎移植手術13例，血小板減少性紫癜17例，皮膚科疾病11例，五官科疾病12例。另選同院經腎上腺皮質激素治療未發(fā)生SONFH的患者98例為對照組，其中男38例，女60例，年齡(41.04±13.61)歲;原發(fā)病為格林巴利綜合征11例，系統(tǒng)性紅斑狼瘡25例，腎病綜合征15例，腎移植手術18例，血小板減少性紫癜15例，皮膚科疾病6例，五官科疾病8例。三組激素使用均符合以下條件［8］:連續(xù)使用;時間不少于6周;3個月內總量不少于2 000 mg強的松(折合后)。三組年齡、性別、原發(fā)病資料具有可比性。

1.2 ApoB基因XbaⅠ、EcoRⅠ多態(tài)性檢測

1.2.1 DNA提取 三組常規(guī)禁食12 h后，采集外周靜脈血5 mL，EDTA抗凝，DNA提取試劑盒直接提取DNA。應用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品質量并估計DNA濃度，稀釋樣品至工作濃度(5～10 ng/μL)。

1.2.2 DNA測序 135例DNA樣品采用直接測序法進行DNA分型，71例DNA樣品采用聚合酶鏈反應—連接酶法(PCR-LDR)進行DNA分型。直接測序: ①PCR擴增:根據(jù)目的序列，設計并合成引物進行擴增，PCR擴增體系(25 μL)包括DNA模板1 μL、10 × PCR Buffer(Mg2+free)2.5 μL、MgCl2(50 mM)0.8 μL、dNTP(10 mM)0.5 μL、Primer F 0.5 μL、Primer R 0.5 μL、Platinum Taq(5U)0.2 μL、ddH2O 18 μL;反應條件為94℃預變性5 min，1個循環(huán)，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，共33個循環(huán)，72℃終末延伸5 min，一個循環(huán)。PCR-LDR法測序:PCR擴增體系(15 μL)包括DNA模板 1 μL、10 × PCR Buffer(Mg2+free)1.5 μL、dNTP(10 mM)0.3 μL、Primer F 0.25 μL、Primer R 0.25 μL、Platinum Taq(5U)0.25 μL、ddH2O 11.45 μL;反應條件為94℃預變性2 min，一個循環(huán)，94℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)，72℃終末延伸3 min，一個循環(huán)。PCR擴增產物均用1.5%瓊脂糖凝膠、150 V電壓下電泳進行檢測。采用蝦堿酶方法進行PCR產物純化，用ABI PRISM 3730 DNA Sequencer對產物進行測序。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，Hardy-Weinberg平衡法檢驗群體代表性。等位基因型和基因頻率組間比較采用χ2檢驗，計量資料用±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 遺傳平衡檢驗 Hardy-Weinberg定律檢驗顯示，各組ApoB基因XbaⅠ、EcoRⅠ的基因型和等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計學意義(P均＞0.05)，符合遺傳平衡定律，具有群體代表性。

2.2 ApoB基因XbaⅠ位點基因型及等位基因分布XbaⅠ位點共檢測出2種基因型:X-X-和X+X-。其中筋脈瘀滯組 X-X-、X+X-分布頻率分別為79.7%(51/64)、20.3%(13/64)，肝腎虧虛組分別為86.4%(38/44)、13.6%(6/44)，對照組分別為93.9%(92/98)、6.1%(6/98);等位基因 X+、X-分布頻率筋脈瘀滯組分別為10.2%(13/128)、89.8%(115/128)，肝腎虧虛組分別為 6.8%(6/88)、93.2%(82/88)，對照組分別為 3.1%(6/196)、96.9%(190/196);筋脈瘀滯組X+X-基因型及X+等位基因頻率高于肝腎虧虛組及對照組(P均＜0.05);肝腎虧虛組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。

2.3 ApoB基因EcoRⅠ位點基因型及等位基因分布 EcoRⅠ位點共檢測出2種基因型:E+E+和E+E-。其中筋脈瘀滯組E+E+、E+E-分布頻率分別為 85.9%(55/64)、14.1%(9/64)，肝腎虧虛組分別為 90.9%(40/44)、9.1%(4/44)，對照組分別為98.0%(96/98)、2.0%(2/98);等位基因 E+、E-分布頻率筋脈瘀滯組分別為93%(119/128)、7%(9/128)，肝腎虧虛組分別為 95.5%(84/88)、4.5%(4/88)，對照組分別為 99.0%(194/196)、1.0%(2/196);筋脈瘀滯組E+E-基因型及E-等位基因頻率高于肝腎虧虛組及對照組(P均＜0.05);肝腎虧虛組與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

股骨頭壞死在傳統(tǒng)中醫(yī)典籍里并沒有確切病名，中醫(yī)學對該病的認識很大程度上基于西醫(yī)現(xiàn)代醫(yī)學研究。中醫(yī)認為，痰瘀是SONFH的病理基礎，脂代謝紊亂是引起機體痰瘀發(fā)生的主要物質基礎。攝入腎上腺皮質激素導致體內膏脂布化失調，痰濁內生，日久痹阻脈道血絡。虛實錯雜，夾痰夾濕是其證候特點，早期以筋脈瘀滯證常見，晚期以肝腎虧虛證常見，而筋脈瘀滯證貫穿疾病始終［9］?，F(xiàn)代基因學說中，基因多態(tài)性旨在闡明不同個體對疾病的易感性及耐受性的實質，多基因論點與中醫(yī)學證型的整體性有著共同特點。因此，研究基因多態(tài)性與中醫(yī)證候的相關性，有助于為闡明“證”的物質基礎及中醫(yī)診斷的客觀性標準提供依據(jù)［10］。

ApoB是低密度脂蛋白的結構蛋白，在脂質代謝過程中發(fā)揮關鍵作用［11，12］。研究表明，ApoB 基因多態(tài)性是引起脂代謝紊亂的重要因素。ApoB基因位于染色體2p24-p23，其中 XbaⅠ(rs693)與 EcoRⅠ(rs1042031)兩個位點的基因多態(tài)性與股骨頭壞死的發(fā)生發(fā)展密切相關，這主要是由于相關等位基因改變了體內TG、HDL-C水平，導致脂代謝紊亂，而脂代謝紊亂是SONFH的危險因素之一。SONFH是一個多因素疾?。?3］，已有證據(jù)表明，SONFH的發(fā)病與遺傳易感性有關［5］，而基因多態(tài)性分析顯示，部分患者存在促凝血基因［14］、脂質合成基因［15］等異常，從而誘發(fā)SONFH。本研究結果顯示，筋脈瘀滯組XbaⅠ、EcoRⅠ基因型與等位基因頻率分布與肝腎虧虛組及對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，而肝腎虧虛組與對照組差異無統(tǒng)計學意義。這提示ApoB基因XbaⅠ、EcoRⅠ位點多態(tài)性可能與SONFH筋脈瘀滯證型有一定關系，其中XbaⅠ位點的X+X-基因型、X+等位基因及EcoRⅠ位點的E+E-基因型、E-等位基因可能導致SONFH筋脈瘀滯證的遺傳易感性增強。

總之，在基因水平研究SONFH脂代謝相關基因的多態(tài)性與中醫(yī)證候之間的關系，能進一步闡明中醫(yī)證候的物質基礎，為中醫(yī)臨床診治提供科學依據(jù)。但疾病過程中證候的變化具有動態(tài)性而基因多態(tài)性相對恒定，且當前研究樣本量較少，存在個體差異，尚未排除基因與環(huán)境相互作用的影響，故仍需進一步深入探討SONFH的證候變化與相關基因多態(tài)性的關系，驗證本研究結果。

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