足細(xì)胞足突融合的機(jī)制及意義

鐘永忠　綜述　曾彩虹　審校

腎臟的基本功能是將體內(nèi)的代謝廢物排出體外，而腎小球?yàn)V過屏障的完整是發(fā)揮腎功能的基本保證。濾過屏障由內(nèi)向外分別由三個(gè)部分組成：有孔內(nèi)皮細(xì)胞、腎小球基膜(GBM)及足細(xì)胞。足細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，由胞體、初級突起、足突構(gòu)成，通過足突黏附在GBM上，胞體則漂浮在包囊腔的濾液中，這使足細(xì)胞存在以活性細(xì)胞從GBM脫離的危險(xiǎn)。為了抵抗毛細(xì)血管跨膜壓，阻止足細(xì)胞的脫落，足細(xì)胞不但擁有細(xì)胞間黏附分子——裂孔隔膜，還存在細(xì)胞-基質(zhì)黏附分子——足突-基膜連接。正常生理狀況下，尿液中存在少量足細(xì)胞，但在腎小球疾病中，這種脫落的足細(xì)胞數(shù)量明顯增加。足細(xì)胞在長期的進(jìn)化中可能演變出某種機(jī)制來抵抗足細(xì)胞脫落。在損傷應(yīng)激過程中，足細(xì)胞的形狀發(fā)生改變，足突融合則是最顯著的變化，足突融合是否為足細(xì)胞抵抗脫落的機(jī)制之一尚存疑問。本文就足細(xì)胞-基膜黏附的分子基礎(chǔ)及足細(xì)胞對損傷所作出的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化作一簡述，著重探討足突融合的機(jī)制及意義。

足細(xì)胞-基膜黏附及其信號傳導(dǎo)通路

足細(xì)胞足突面表達(dá)一系列的細(xì)胞-基質(zhì)黏附受體，最重要是整合素α3β1。整合素α3β1是非共價(jià)結(jié)合的異二聚體，亞基的氨基末端形成胞外配體結(jié)合域，與GBM內(nèi)的層黏連蛋白、Ⅳ型膠原和纖維連接蛋白等結(jié)合。整合素胞質(zhì)側(cè)的尾部較短，它通過相關(guān)的銜接分子(如talin、vinculin、paxillin等)將整合素亞基連接到肌動(dòng)蛋白骨架上。配體與整合素結(jié)合后，通過胞質(zhì)內(nèi)的激酶[如整合素連接激酶(ILK)、黏附斑激酶(FAK)]將外界的刺激信號傳導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，誘導(dǎo)足細(xì)胞骨架形態(tài)及功能改變以應(yīng)對外界環(huán)境的變化。

ILK是一個(gè)高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要有三個(gè)結(jié)構(gòu)域：氨基端的錨蛋白重復(fù)序列(ANK)，是ILK與黏著斑蛋白PINCH結(jié)合位點(diǎn)。PINCH通過與Nck-2相結(jié)合募集肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白(如WASP、Dock180、PAK)，并進(jìn)一步通過核化蛋白(Arp2/3、MLC Kinase、confilin等)調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白聚集排列[2]。中間為磷脂酰肌醇結(jié)合結(jié)構(gòu)域(PH結(jié)構(gòu)域)，PI3K的產(chǎn)物PIP3與此結(jié)構(gòu)域結(jié)合后激活I(lǐng)LK。羧基端為激酶催化結(jié)構(gòu)域，也是整合素及許多actin銜接蛋白的結(jié)合區(qū)域，包括parvin家族、paxillin等。ILK是 ILK-PINCH-parvin復(fù)合物中的核心部分，參與黏著斑復(fù)合體及細(xì)胞骨架形成，影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及遷移。ILK還是整合素與裂孔隔膜上濾過膜分子耦合的橋梁[3]，因此足細(xì)胞黏附或者ILK信號的變化都將影響腎小球?yàn)V過屏障。

FAK是非受體酪氨酸激酶。FAK肽鏈的N端是FREM結(jié)構(gòu)域，為細(xì)胞因子等受體的結(jié)合位點(diǎn)，此區(qū)域也能結(jié)合和促進(jìn)整合素介導(dǎo)的非酪氨酸激酶(如Erk)的激活。中段的激酶結(jié)構(gòu)域(PTK)在結(jié)合整合素后，Y397位點(diǎn)的酪氨酸自磷酸化，為Scr提供結(jié)合位點(diǎn)，Src的結(jié)合使FAK得到充分活化。FAK的C端含有黏著斑靶向定位結(jié)構(gòu)域(FAT)，當(dāng)與整合素結(jié)合后，此區(qū)域發(fā)生聚集，通過與paxinlin及talin結(jié)合后招募FAK到黏附處，此區(qū)域活化后為多種蛋白的活化提供場所，其中包含P130Cas和GRAF/ASAP1等，這些蛋白可調(diào)控Rac和Rho的活性等，并影響α-actinin-4的磷酸化水平與肌動(dòng)蛋白的解離與聚合[4]。

為了應(yīng)對外界的機(jī)械力，防止足細(xì)胞的丟失，細(xì)胞基質(zhì)黏附受體必須與細(xì)胞骨架相偶聯(lián)。足細(xì)胞胞體含有三種細(xì)胞骨架組分(F-actin、中間絲和微管蛋白)，而肌動(dòng)蛋白束只在足突表達(dá)，并且延伸到細(xì)胞細(xì)胞連接面和細(xì)胞基質(zhì)連接面[5]，且與整合素黏附相關(guān)蛋白復(fù)合物介導(dǎo)的黏附功能相偶聯(lián)[6]。外界機(jī)械力可通過細(xì)胞表面的整合素引起Rho移位，通過Rho的下游效應(yīng)器Rho激酶引起細(xì)胞骨架的重排。因此，正常生理機(jī)制下，Rho的活性受到嚴(yán)格的調(diào)控，且抑制Rho激酶可改善許多實(shí)驗(yàn)性腎病。

足細(xì)胞對損傷的反應(yīng)

在損傷應(yīng)激狀態(tài)下，足細(xì)胞形態(tài)會發(fā)生巨大變化，這些形態(tài)變化包括：(1)細(xì)胞體的過度肥大(胞質(zhì)變稀薄和足細(xì)胞下間隙擴(kuò)大形成假性囊腫)；(2)自噬的增加，溶酶體內(nèi)物質(zhì)聚集，引起胞質(zhì)的脫落；(3)足突融合，是最主要的變化；(4)胞質(zhì) “微絨毛化”。這些微絨毛既可延伸到GBM，也可延伸到壁層上皮細(xì)胞之間的壁層基膜(PBM)。這種現(xiàn)象可解釋為足細(xì)胞在尋找可以黏附的地方(如GBM或PBM)[7]，之后引起整個(gè)足細(xì)胞向這個(gè)新黏附點(diǎn)遷移。雖然以上這些變化可逆，但也可進(jìn)展為更加嚴(yán)重的損傷，如細(xì)胞凋亡(溶酶體酶釋放使細(xì)胞溶解)或以活性的細(xì)胞從GBM上剝離。

足突融合

病理變化足突融合是指相鄰的正常足細(xì)胞的趾狀結(jié)構(gòu)消失，導(dǎo)致覆蓋在GBM上的足細(xì)胞足突融合成片，廣泛擴(kuò)張，從而引起腎小球?qū)Υ蠓肿游镔|(zhì)的通透性增加。足突融合的形成包括兩個(gè)階段：第一階段，規(guī)律的梳齒狀結(jié)構(gòu)消失，足突回縮成短而不規(guī)則的細(xì)胞突起狀結(jié)構(gòu)[8]，同時(shí)裂孔隔膜消失或移位，足突之間形成緊密型連接。第二階段，次級足突向初級足突回縮，導(dǎo)致覆蓋在GBM上的足突廣泛形成類似于碟狀的結(jié)構(gòu)，且最終與胞體融合。此時(shí)，正常的足細(xì)胞下間隙也大部分消失，足細(xì)胞胞體廣泛直接黏附于GBM，從而防止足細(xì)胞的脫落。

足突融合形成過程中同時(shí)伴精密、有序的足細(xì)胞骨架的重排。在足突的GBM側(cè)形成細(xì)胞骨架叢，這是微絲通過α-actinin連接形成的高度密集有序的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[9]。在各類腎小球疾病都能觀察到這種結(jié)構(gòu)，包括微小病變性腎病(MCD)、膜性腎病(MN)和IgA腎病[10]。在大鼠Masugi 腎炎模型中，細(xì)胞骨架的重排伴隨著actin、α-actinin-4 和synaptopodin表達(dá)的增加，同時(shí)α-actinin-4主要定位于靠近GBM側(cè)的高密度區(qū)域[9]。在氨基核苷嘌呤霉素腎病中，α-actinin-4的表達(dá)增加發(fā)生在足突融合和蛋白尿之前[11]。足突GBM側(cè)致密微絲的聚集表明足細(xì)胞-GBM之間的連接發(fā)生了變化，可能增強(qiáng)足細(xì)胞與GBM的連接，防止足細(xì)胞的脫落。

體外培養(yǎng)的足細(xì)胞無足突，予機(jī)械應(yīng)力后，足細(xì)胞轉(zhuǎn)換成“運(yùn)動(dòng)表型”，類似于體內(nèi)的足突融合。體內(nèi)足突融合的早期階段其實(shí)也伴隨著遷徙能力的增加，但是足突融合的晚期階段，足突融合成片，融合的足突區(qū)域與GBM緊密結(jié)合。體外培養(yǎng)足細(xì)胞轉(zhuǎn)換成“運(yùn)動(dòng)表型”后，常伴整合素亞型表達(dá)的變化，下調(diào)整合素α3β1，上調(diào)整合素αvβ3，增加足細(xì)胞對機(jī)械應(yīng)力的抵抗[12]。糖尿病患者及動(dòng)物模型中，也同樣發(fā)現(xiàn)了足細(xì)胞中整合素α3β1表達(dá)的下調(diào)[13]。

功能聯(lián)系迄今為止，僅少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道足突融合是足細(xì)胞的一種適應(yīng)性反應(yīng)，而非單一認(rèn)為是細(xì)胞損傷的結(jié)果。足突融合時(shí)，足突GBM側(cè)細(xì)胞骨架內(nèi)肌動(dòng)蛋白束成分的增加增強(qiáng)了足細(xì)胞收縮能力，以抵抗跨膜壓的增加。雖然跨膜壓的增加在某種程度上促發(fā)了足突融合，但足突融合形成的根本目的并不是為了抵抗跨膜壓。

首先，增加的跨膜壓影響了整個(gè)絲球體，但是足突融合卻是局灶分布的。其次，在高血壓導(dǎo)致的腎損害模型中[14]，早期缺乏足突融合。相反，高度擴(kuò)張的毛細(xì)血管壁外側(cè)足突非常規(guī)律地呈梳齒狀分布。因此足突融合的形成必有其他功能上的優(yōu)點(diǎn)。

足細(xì)胞丟失

機(jī)體在生理情況下及疾病狀態(tài)下足細(xì)胞丟失的原因和機(jī)制一直存在爭議。目前認(rèn)為兩種機(jī)制參與了足細(xì)胞的丟失，即足細(xì)胞凋亡和活性足細(xì)胞的脫落。

足細(xì)胞原位凋亡造成的足細(xì)胞丟失在進(jìn)展性腎小球疾病中，凋亡被廣泛認(rèn)為是足細(xì)胞丟失的主要機(jī)制。由于體外足細(xì)胞并未完全分化，有的明顯處于細(xì)胞分裂期，并不能完全具備原位足細(xì)胞的特點(diǎn)。而體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中檢測細(xì)胞凋亡的方法主要是TUNEL染色法，此方法雖然非常敏感，但也易出現(xiàn)假陽性。即使尿液中發(fā)現(xiàn)凋亡的足細(xì)胞并不一定意味足細(xì)胞在原位發(fā)生凋亡，因?yàn)樽慵?xì)胞在腎單位內(nèi)移動(dòng)過程中失去了與基膜的連接也可導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡，即失巢凋亡。且尿液在到達(dá)缺氧及酸性的膀胱之前可檢出活性的足細(xì)胞。

腎小球疾病晚期，在包囊腔中偶見少量孤立性的死亡足細(xì)胞及細(xì)胞碎片，表明足細(xì)胞在剝離之前或剝離同時(shí)發(fā)生了細(xì)胞死亡。但這些原位死亡的足細(xì)胞是由于胞質(zhì)內(nèi)溶酶體酶釋放導(dǎo)致細(xì)胞溶解而引起的，且相鄰的足細(xì)胞內(nèi)也出現(xiàn)溶酶體成分的增加。死亡的足細(xì)胞中也未觀察到凋亡的典型特點(diǎn)，如凋亡小體的形成[15]。即使足細(xì)胞細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生很大變化，電鏡下其細(xì)胞核染色質(zhì)仍保存完好。綜上所述，凋亡并不是造成足細(xì)胞丟失的主要原因。

活性足細(xì)胞剝脫造成的足細(xì)胞丟失足細(xì)胞的位置與結(jié)構(gòu)使其容易受濾出液剪切力的影響，造成脫落。越來越多的證據(jù)表明足細(xì)胞可沿GBM遷移，這對足細(xì)胞黏附在GBM上提出了巨大的挑戰(zhàn)。

尿液中的足細(xì)胞腎小球疾病中足細(xì)胞的脫落是一個(gè)比較常見的病理現(xiàn)象，進(jìn)一步研究證實(shí)這些足細(xì)胞大部分仍具有活性[16]，提示凋亡或壞死并非是足細(xì)胞脫落的主要原因。足細(xì)胞剝離速率和在尿液中出現(xiàn)的多少與疾病的病理進(jìn)展相關(guān)[17]，持續(xù)的足細(xì)胞數(shù)量減少將進(jìn)展成腎小球硬化。

原位證據(jù)研究表明局灶性的足細(xì)胞剝離，是部分腎小球疾病足細(xì)胞丟失的機(jī)制之一[18]。足細(xì)胞的完全剝離需經(jīng)多個(gè)步驟才能完成，足細(xì)胞部分足突已與GBM剝離時(shí)，部分依然固定在GBM上。此時(shí)，足細(xì)胞形態(tài)雖然已存在明顯的改變(如足突融合)，但絕大多數(shù)足細(xì)胞的核膜依然完整，胞質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞器保存完好，提示足細(xì)胞依然具有活性。局灶的足突剝離并不意味著整個(gè)足細(xì)胞將不可逆的從GBM上脫落。因?yàn)樵谀撤N程度上，足突的局灶剝離是可逆的，如MCD緩解時(shí)，足突融合消失，恢復(fù)正常的足突結(jié)構(gòu)。

在炎癥性動(dòng)物模型如抗GBM腎炎模型[7]及抗中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體相關(guān)性血管炎腎炎模型[19]中，病變明顯處的足細(xì)胞出現(xiàn)足突融合，但只有節(jié)段的足突從GBM上剝離，大部分依然與GBM保持黏連，因此足突融合形成于完全剝離之前。在Thy-1介導(dǎo)的腎小球腎炎模型中[20]，由于系膜基質(zhì)破壞和系膜細(xì)胞損傷，失去對毛細(xì)血管袢的支撐，使得尿極處的血管袢突入近端腎小管中。由于此處超濾液流速最快，使足細(xì)胞暴露在增強(qiáng)的剪切力中，細(xì)胞外形拉長，易發(fā)生足細(xì)胞脫落。為了應(yīng)對增強(qiáng)的剪切力，防止細(xì)胞脫落，此處的足細(xì)胞出現(xiàn)了足突融合。因此，在上述情況下足突融合是足細(xì)胞應(yīng)對機(jī)械應(yīng)力的一種反應(yīng)，且發(fā)于剝離之前。

因此，足突融合似乎代表著一種特殊的、反應(yīng)性的足細(xì)胞表型，它可以增加與GBM的黏合力，至少在一定時(shí)間內(nèi)可降低足細(xì)胞剝離的風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)局部的條件改善后，為重建濾過膜提供基礎(chǔ)。

足突融合是對損傷的反應(yīng)還是原發(fā)性損害

要驗(yàn)證足突融合是足細(xì)胞防止脫落丟失的一種保護(hù)性措施這個(gè)假說，必須在不同的腎小球疾病中得到驗(yàn)證。分為兩類腎小球疾?。阂活愂莻€(gè)別腎小球局灶性損傷(至少病變的嚴(yán)重程度不一樣)，足突融合被認(rèn)為是對局灶損傷的一種保護(hù)性機(jī)制；另一類是所有的腎小球同時(shí)受累，此類主要是因?yàn)榫S持正常足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)機(jī)制存在原發(fā)性缺陷，或因網(wǎng)絡(luò)中的成分受到異常刺激。

腎小球局灶損傷中的足突融合此類腎小球疾病是累及個(gè)別腎小球的節(jié)段區(qū)域，如炎癥性腎小球腎炎，足突融合的出現(xiàn)被認(rèn)為是足細(xì)胞防止脫落的一種保護(hù)性機(jī)制。足細(xì)胞中整合素與肌動(dòng)蛋白骨架的連接易被補(bǔ)體激活產(chǎn)物及其他有害的炎癥介質(zhì)破壞[21]。在上皮側(cè)免疫復(fù)合物沉積的疾病中(如MN、膜增生性腎小球腎炎和狼瘡性腎炎等)，免疫復(fù)合物的沉積減弱了足細(xì)胞與GBM的連接。在糖尿病腎病、Alport 和 Pierson 綜合征等疾病時(shí),GBM中基質(zhì)成分的變化將減弱足細(xì)胞與GBM的黏附。在高灌注腎小球疾病中，增加的毛細(xì)血管靜水壓引起GBM張力增加，導(dǎo)致足細(xì)胞和GBM之間相互作用的負(fù)荷過重,從而使足細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白骨架發(fā)生反應(yīng)性變化[22]。在高濾過的疾病中，如糖尿病、妊娠、繼發(fā)性局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)等,增加的剪切力在發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[23]，尤其對尿極處的足細(xì)胞影響更加明顯，形成“頂部病變”或者頂部型FSGS。促進(jìn)足細(xì)胞生長的刺激也會引起足細(xì)胞分裂[24]，引起細(xì)胞骨架重排，從而影響足細(xì)胞與GBM的黏附，但足細(xì)胞不能完成胞質(zhì)分裂，最終導(dǎo)致有絲分裂的“流產(chǎn)”或者雙核的出現(xiàn)。

足突融合的形成是這類疾病的共同特征，損傷應(yīng)激又是如何引起足突融合的呢？可能涉及以下兩種機(jī)制:(1)機(jī)械力的增加影響了足細(xì)胞-GBM相互作用，引起整合素介導(dǎo)的由外到里的信號傳導(dǎo)。如前所述，此過程涉及整合素、TPV復(fù)合物、ILK、和FAK。小鼠ILK過表達(dá)會引起足突融合，繼而形成FSGS，抑制FAK可減少蛋白尿和足突融合的形成[25]。(2)足細(xì)胞剝離早期為節(jié)段足突的部分剝脫，這種微小的變化有時(shí)在透射電鏡中難以辨認(rèn)，但會影響到裂孔隔膜，改變它的分子結(jié)構(gòu)，同時(shí)促發(fā)了危險(xiǎn)信號導(dǎo)致局部足突融合的形成。而且TRPC通道和小GTPase的Rho家族的信號傳導(dǎo)通路在足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架調(diào)節(jié)中的作用也成為研究熱點(diǎn)[26]。

足突融合是維持正常結(jié)構(gòu)機(jī)制缺陷的結(jié)果在許多的遺傳性疾病，將足突融合解釋為足細(xì)胞應(yīng)對應(yīng)激的一種保護(hù)性反應(yīng)并不恰當(dāng)。在這類疾病中，維持足突結(jié)構(gòu)的基因表達(dá)發(fā)生變化，這些變化或影響了足細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，降低了足細(xì)胞對損傷的適應(yīng)性反應(yīng)能力，或影響了細(xì)胞骨架蛋白的編碼從而導(dǎo)致足突融合[27]。因此，在以上情況下，足突融合并不代表對損傷的一種反應(yīng)，而是直接誘發(fā)了足突融合。

MCD在電鏡下表現(xiàn)為足細(xì)胞足突廣泛融合，足突融合的出現(xiàn)是由于循環(huán)因子引起細(xì)胞骨架蛋白調(diào)節(jié)異常的結(jié)果，而不是對損傷的反應(yīng)，雖然出現(xiàn)了大范圍的足突融合，但無足細(xì)胞的丟失及疾病的進(jìn)展。近年來，suPAR被認(rèn)為是與FSGS發(fā)病相關(guān)的一種循環(huán)因子，循環(huán)中的suPAR與足細(xì)胞上的β3類整合素結(jié)合后，可激活Rac1和Cdc42信號通路引起足突融合和蛋白尿[28]。

足突融合和蛋白漏出

除了裂孔隔膜，GBM或內(nèi)皮細(xì)胞的損傷也可導(dǎo)致蛋白尿。但蛋白尿的發(fā)生與足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化最相關(guān)?，F(xiàn)有假說一般認(rèn)為足突融合與蛋白尿之間存在因果關(guān)系，且足突融合的寬度與蛋白尿程度相關(guān)，但也有文獻(xiàn)證實(shí)不相關(guān)[29]。有學(xué)者認(rèn)為白蛋白以胞吞作用的方式通過融合成片的足突區(qū)域形成蛋白尿[35]。但以下解釋更具有說服力：如前所述，足突融合是一個(gè)多步驟的過程，早期階段足突在GBM上的移動(dòng)能力的增強(qiáng)，造成局部短暫的從GBM剝離，可能短暫的引起大分子通過此區(qū)域，且在活動(dòng)性腎小球疾病中，這種短暫的剝離在不同的部位時(shí)有發(fā)生，因此會出現(xiàn)持續(xù)的蛋白尿。

總之，足突融合是足細(xì)胞應(yīng)對損傷的一種保護(hù)性機(jī)制，阻止足細(xì)胞剝離，最終目的是為了限制蛋白的漏出，阻止疾病的進(jìn)展。在嚴(yán)重疾病狀態(tài)下，足突融合似乎能夠阻止濾過屏障廣泛的泄漏，但這也導(dǎo)致濾過率的短暫下降。同時(shí)，足突融合并不能完全阻止血漿蛋白的漏出，因?yàn)樵谧阃蝗诤闲纬蛇^程中，裸露的基膜不斷增加，導(dǎo)致蛋白的漏出；其次在完全融合區(qū)域的邊緣，相鄰足細(xì)胞的異常連接會影響裂孔隔膜的正常功能。

小結(jié)：足細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，胞體通過足突黏附在GBM上，周圍浸泡在包囊腔的濾過液中。任何破壞足突與GBM連接的損傷都有導(dǎo)致足細(xì)胞以活性形式從GBM脫落的危險(xiǎn)。在應(yīng)激狀態(tài)下足細(xì)胞的結(jié)構(gòu)表型發(fā)生變化，最顯著的變化就是足突融合。足突融合并不是損傷后的病理紊亂，而是細(xì)胞為了生存而進(jìn)化的一種適應(yīng)性反應(yīng)。本文認(rèn)為足突融合是足細(xì)胞表型的一種調(diào)節(jié)性改變，防止足細(xì)胞其從GBM上脫落至尿液，甚至以暫時(shí)性犧牲濾過率和選擇性通透性的方式防止足細(xì)胞丟失。

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