乙型肝炎病毒基因突變與臨床疾病進(jìn)展的關(guān)系*

李 梵 綜述，陳國鳳，徐東平 審校

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是一個(gè)全球公共衛(wèi)生問題。HBV感染人體后可以引起急性肝損傷和慢性病毒感染。慢性HBV感染者疾病的臨床轉(zhuǎn)歸包括：慢性肝炎、肝硬化、肝細(xì)胞癌以及肝衰竭。宿主、病毒因素[1]、環(huán)境、藥物、酒精等因素與慢性HBV感染的進(jìn)程相關(guān)。在諸多因素中，HBV基因突變是影響病毒生物學(xué)特性的基本因素。因HBV聚合酶無校對功能，病毒在復(fù)制過程中容易產(chǎn)生變異。循環(huán)中變異病毒數(shù)量巨大，突變在一定范圍內(nèi)累積，使得在感染者體內(nèi)HBV是以準(zhǔn)種形式存在，在環(huán)境選擇壓力下，準(zhǔn)種的病毒組合不斷變化，引起病毒生物學(xué)特點(diǎn)的變化。突變隨著HBV感染時(shí)間的延長而逐步累積，不同疾病階段突變率有顯著差別。以下將可能與臨床疾病進(jìn)展相關(guān)的各個(gè)HBV基因區(qū)突變做一綜述。

1 C基因區(qū)突變

前 C區(qū) （nt 1814-1901）參與編碼 HBV E抗原（HBeAg），由29個(gè)氨基酸組成。最常見的突變是HBV前C區(qū)G1896A突變，HBeAg的合成終止，但HBV核心抗原（HBcAg）的正常翻譯卻未受影響。HBeAg是小分子可溶性蛋白，可以緩解細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）對細(xì)胞膜上HBcAg的攻擊，導(dǎo)致HBV感染的肝細(xì)胞無法被清除[2]，如果HBeAg合成或分泌障礙，CTL容易攻擊感染肝細(xì)胞，造成肝細(xì)胞損傷。G1896A突變還增加HBV nt1847-1917莖環(huán)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，上調(diào)HBcAg的表達(dá)；HBcAg由核型轉(zhuǎn)為胞漿型，增加了其對肝細(xì)胞的毒性。

核心啟動(dòng)子區(qū)（core promoter，CP）（nt1643-1849）是直接引發(fā)前基因組RNA轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，包括基本核心啟動(dòng)子區(qū)（basic core promoter，BCP）（nt1742-1849）和其上游調(diào)節(jié)元件。CP區(qū)能夠調(diào)節(jié)前核心RNA(precoreRNA)轉(zhuǎn)錄、HBeAg產(chǎn)量以及影響病毒前基因組（pregenome RNA，pgRNA）的復(fù)制和HBcAg的表達(dá)。

BCP區(qū)是研究的熱點(diǎn)。目前，常見T1753A/C、T1754C/G、A 1762T、G 1764A、C1766T等突變形式，其中以1762/1764雙聯(lián)突變最為常見，聯(lián)合突變可以上調(diào)pgRNA的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)pgRNA衣殼化，增加HBcAg產(chǎn)量，從而增強(qiáng)HBV復(fù)制力。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)顯示，聯(lián)合突變可以抑制precoreRNA的轉(zhuǎn)錄，繼而降低HBeAg合成。多聯(lián)突變的影響高于雙聯(lián)突變，例如1762/1764雙聯(lián)突變病毒復(fù)制力和HBeAg合成量分別是野生株的2倍和80%，而1753/1762/1764三聯(lián)突變分別是4倍和70%，1753/1762/1764/1766四聯(lián)突變則達(dá)到了8倍和20%[3]。另外，BCP區(qū)基因突變還可以增加肝細(xì)胞凋亡[4]。

C區(qū)（1901-2452）有500多個(gè)核苷酸，表達(dá)的HBcAg是CTL攻擊的靶抗原，可導(dǎo)致表達(dá)靶抗原的感染肝細(xì)胞死亡，C基因突變可引起HBcAg抗原表位發(fā)生改變，從而直接影響到宿主對HBV的免疫應(yīng)答。例如，Sugiyama等的研究認(rèn)為，A2339G變異會(huì)在體外增強(qiáng)HBV復(fù)制，發(fā)生此變異的患兒ALT峰值較沒有該變異的患兒高[5]。

由于上述可能的機(jī)制，許多研究發(fā)現(xiàn)隨著乙肝病情嚴(yán)重程度的增加，前C/BCP區(qū)突變檢出率隨之增高。例如：前C區(qū)1896位突變和1762/1764雙聯(lián)突變更多見于HBeAg陰性和疾病進(jìn)展程度更高的患者；同時(shí)不論基因B型還是C型，1762/1764雙聯(lián)突變都會(huì)加速疾病的進(jìn)展和增加肝癌的發(fā)生機(jī)率[6-9]。

一項(xiàng)多中心研究對250例慢性HBV（基因B或C型）患者1762/1764雙聯(lián)突變率進(jìn)行了分析，結(jié)果提示隨著疾病嚴(yán)重程度增加，1762/1764雙聯(lián)突變率也相應(yīng)增加；而且該雙突變陽性率在肝癌患者中顯著增高，是HBV攜帶者發(fā)生肝癌的病毒學(xué)預(yù)測因素[6]。另一研究得出相似的結(jié)果，該研究對400例HBV攜帶者進(jìn)行長期縱向隨訪，發(fā)現(xiàn)1762/1764雙聯(lián)突變是疾病進(jìn)展和發(fā)生肝癌的獨(dú)立預(yù)測因素[10]。另外，先前Meta分析表明從無癥狀攜帶者到肝硬化，C1653T、T1753V及1762/1764雙聯(lián)突變檢出率逐漸增加，CP區(qū)其他位點(diǎn)突變也與肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)性的增加密切相關(guān)[11]，且CP區(qū)其他位點(diǎn)突變大部分發(fā)現(xiàn)始終與1762/1764雙聯(lián)突變相伴隨，提示1762/1764雙聯(lián)突變在肝癌發(fā)生中可能具有重要作用?？v向的研究表明1762/1764雙聯(lián)突變在診斷肝癌之前很多年就發(fā)生，而其他位點(diǎn)突變在臨近診斷肝癌時(shí)發(fā)生，說明1762/1764雙聯(lián)突變在肝癌早期階段發(fā)生具有作用，而CP區(qū)其他位點(diǎn)突變在促進(jìn)肝癌發(fā)生也有作用的[12]。Yin等完成的一項(xiàng)大樣本橫斷面（846名無癥狀攜帶者、235名慢性肝炎、188名肝硬化患者、190名肝癌）研究[13]提示：在HBV基因C型感染的患者中，肝硬化患者 HBV C1673T、A1726C、A1727T、C1730G、C1766T、T1768A、C1773T、C1799G 的 突 變率明顯高于慢性乙型肝炎患者，肝癌患者上述位點(diǎn)突變率高于肝硬化，逐步多因素回歸分析提示HBV基因C型、患者年齡、性別、轉(zhuǎn)氨酶水平，及T1768A、A1762T/G1764A和A1846T突變與肝硬化的發(fā)病獨(dú)立相關(guān)；肝癌發(fā)生的獨(dú)立預(yù)測因素有患者年齡、異常轉(zhuǎn)氨酶、HBVD NA≥104IU/ml、基因C型以及C1653T、T1674C/G、T1753V和A1762T/G1764A突變。除了T1674 C/G以外，這些發(fā)現(xiàn)和Meta分析的結(jié)論[11]一致。在該項(xiàng)研究中，即使平衡年齡因素的影響，CP區(qū)變異仍與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。我們之前大樣本量的研究也表明，前C/BCP區(qū)基因突變與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[14]。

2 S基因區(qū)突變

S基因包括前 S1區(qū)（nt2848-3204），前 S2區(qū)（nt3205-0154），S區(qū)（nt155-835）。分別編碼 119個(gè)氨基酸（amino acid，aa）殘基的前S1蛋白、55個(gè)aa的前S2蛋白和226個(gè)aa的S蛋白。

前S區(qū)位于S基因的5’端，分為前S1區(qū)和前S2區(qū)。前S1區(qū)包涵有119個(gè)氨基酸，分為2個(gè)部分，N端（aa1-57）和C端（aa58-119）；前S2區(qū)包含55個(gè)氨基酸。前S區(qū)具有T細(xì)胞和B細(xì)胞的識(shí)別位點(diǎn)，因此易影響免疫反應(yīng)[8，15，16]。前S區(qū)含有在病毒生活周期中起關(guān)鍵作用的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)[8]，如：肝細(xì)胞結(jié)合區(qū)域（位于前S1域的N端，對感染至關(guān)重要）、熱休克蛋白70-結(jié)合位點(diǎn)（位于前S1域的C端）、細(xì)胞溶質(zhì)停留決定子（cytosolic anchorage determinant，CAD、位于前 S1域的 C端）、核衣殼結(jié)合位點(diǎn)（位于前S1域的C端）、CCAAT結(jié)合因子（CCAAT-binding factor，CBF）結(jié)合位點(diǎn)（位于前 S1域的 C端，對S基因表達(dá)必需的）、多聚人血清白蛋白（polymerized human serum albumin，pHSA）結(jié)合位點(diǎn)、S啟動(dòng)子（位于前S1域的C端）等。研究證實(shí)，前S1/前S2區(qū)為HBV變異最大的區(qū)域，最容易發(fā)生缺失突變。前S區(qū)突變位置通常包括在：前S1的3’端缺失和前S2的5’端缺失、前S2的起始密碼子缺失，以及前S2的起始密碼子的點(diǎn)突變等。

前S區(qū)突變可能改變病毒的感染性及分泌能力，改變病毒的抗原性及結(jié)合位點(diǎn)識(shí)別能力，從而影響疾病的發(fā)生、發(fā)展過程。前S1和前S2突變通常使得大蛋白、中蛋白、小蛋白比例失調(diào)，大蛋白在肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）上過量產(chǎn)生和滯留，增加了ER壓力，導(dǎo)致DNA損傷以及基因組不穩(wěn)定性[17]，造成肝細(xì)胞進(jìn)一步損傷及肝癌的發(fā)生。另外，前S2基因的表達(dá)與腫瘤抑制基因p53的表達(dá)高度相關(guān)[17]，截短了的前S2片段在整合進(jìn)入宿主基因組時(shí)仍具有轉(zhuǎn)錄交易能力可能是致癌的機(jī)制之一[18]，前S2突變誘導(dǎo)周期蛋白依賴性激酶抑制劑的分解，使得細(xì)胞周期不受控制進(jìn)展[19]也是可能致癌的機(jī)制之一。Mun等選取241例不同程度的韓國HBV感染者進(jìn)行分析，結(jié)果提示HBV F141L與肝癌密切相關(guān)。通過穩(wěn)定細(xì)胞系研究，發(fā)現(xiàn)F141L-LHBs可以通過下調(diào)p53和P21、上調(diào)CDK4和細(xì)胞周期蛋白A使得細(xì)胞周期進(jìn)展[20]。前S2基因缺失可形成毛玻璃樣肝細(xì)胞（ground glass hepatocytes，GGHs）類型[18]，與肝病進(jìn)展到更嚴(yán)重的階段如肝硬化有關(guān)。

S區(qū)基因在某些藥物如免疫抑制劑、核苷類抗病毒藥物等誘導(dǎo)下，容易發(fā)生突變。S區(qū)基因a決定簇突變是病毒逃避表現(xiàn)抗原免疫的主要原因，這種形式突變常見于出生時(shí)應(yīng)用了乙肝疫苗和免疫球蛋白免疫但卻感染HBV的嬰兒，后來在肝移植患者也發(fā)現(xiàn)。目前報(bào)道較多的有sG145R，其他位點(diǎn)也可見變異，但其臨床意義有待進(jìn)一步研究。

前S基因缺失突變多見于基因C型，病情嚴(yán)重程度較無前S缺失的患者嚴(yán)重，且隨著肝臟疾病嚴(yán)重程度的增加，突變率相應(yīng)增加。因此在較晚的疾病階段患者中前S區(qū)缺失檢出率更高。前S區(qū)缺失突變也與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。Lin等[21]檢測了266名慢性HBV感染患者，包括202例無癥狀攜帶者、64名肝癌患者，總體上前S缺失率為16.5%，肝癌和基因C型者更易發(fā)生前S基因的缺失突變。年輕的肝癌患者前S缺失發(fā)生率更高。香港大學(xué)Yeung等[22]分析69名慢性乙肝患者和115名肝癌患者后發(fā)現(xiàn)，前S缺失檢出率為21.9%，規(guī)模從3-189bp，集中在前S1的3’端和前S2的 5’端，可見前S1啟動(dòng)子、前S2啟動(dòng)子區(qū)域缺失突變。人血清白蛋白受體區(qū)及S啟動(dòng)子區(qū)缺失較為多見，而肝細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)及CCAAT盒子缺失較為少見。前S2缺失突變是肝癌發(fā)生的獨(dú)立預(yù)測因素，小于50歲的肝癌患者前S缺失率更高。劉世建等進(jìn)行功能位點(diǎn)分析后前S缺失類型主要以PreS2的 N端缺失和突變最為多見，占缺失突變62.5%，較前S1的更為多見。功能位點(diǎn)分析主要見于病毒分泌、核苷酸結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄和pHSA結(jié)合位點(diǎn)。

前S1涵蓋了對病毒生活周期相關(guān)的位點(diǎn)，如肝細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)，S啟動(dòng)子區(qū)域，而前S2涵蓋大量的T細(xì)胞及B細(xì)胞表位，對免疫壓力的反應(yīng)更活躍。前S1和前S2區(qū)缺失可以導(dǎo)致不同的GGHs組織病理類型[23]，與前S1相比,前S2缺失具有導(dǎo)致更高的ER壓力能力，通過DNA損傷,更完全的導(dǎo)致肝癌[23]，提示前S1和前S2缺失引起疾病進(jìn)展的模式可能不同，因此在針對韓國病人的研究中，前S1缺失比前S2缺失與肝癌更相關(guān)，Mun[24]研究檢測了120名乙肝不同疾病程度的患者，發(fā)現(xiàn)總體前S缺失率為30.8%，前S缺失隨著臨床疾病程度增加逐步增加，但是發(fā)現(xiàn)前S1啟動(dòng)子缺失在肝癌患者中比率明顯增高，約22.5%。前S1缺失在肝癌患者中較肝硬化檢出率更高，前S2缺失在肝硬化患者中檢出率高于肝癌，另外韓國數(shù)篇相關(guān)文章研究也認(rèn)為肝癌發(fā)生與前S1缺失更相關(guān)[25，26]。推測其主要原因可能是韓國的研究對象幾乎大部分感染基因C型。Yin[27]等的研究驗(yàn)證了上述結(jié)論，前S2突變和慢性肝病進(jìn)展相關(guān)，前S1突變和肝癌發(fā)病相關(guān)。與慢性肝病相比，81%的前S1突變在基因C型中與肝硬化負(fù)相關(guān)，多因素回歸分析表明C2964A、C3116T和C7A是肝癌發(fā)病的獨(dú)立預(yù)測因素，同時(shí)A2964C和C3116T是與發(fā)生肝硬化風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的標(biāo)記。

3 P基因區(qū)突變

P基因區(qū)（nt2307-0-1623）共涉及4個(gè)功能區(qū)：末端蛋白區(qū)、間隔區(qū)、多聚酶（polymerase，POL）/逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase，RT）區(qū)，核糖核酸酶H區(qū)。RT基因是P基因的重要組成部分，包括 7 個(gè)功能亞區(qū)：A、B、C、D、E、F、G 亞區(qū)。RT區(qū)突變意義體現(xiàn)在兩個(gè)方面：一是該區(qū)是抗HBV核苷（酸）類似物的作用靶位，病毒產(chǎn)生耐藥突變后可引起病毒反跳，不合理停藥可導(dǎo)致野生病毒復(fù)制迅速增加，誘導(dǎo)過度免疫反應(yīng)，引起病情加重，疾病進(jìn)展。目前常用藥物有拉米夫定、阿德福韋酯、替比夫定、恩替卡韋。拉米夫定最常見的耐藥形式是 rtM204Ⅰ和 rtM204V，rtL80Ⅰ、rtV173L、rtL180M 為其補(bǔ)償突變。我們的研究也發(fā)現(xiàn)rtL229F可繼發(fā)于rtM204I變異，雖然不能直接降低病毒對藥物的敏感性，但可補(bǔ)償rtM204I復(fù)制力的降低，也是一種補(bǔ)償突變[28]。替比夫定與其分子及結(jié)構(gòu)和作用目標(biāo)位點(diǎn)相似，存在交叉耐藥，rtN236T、rtA181V是阿德福韋酯常見的耐藥形式。恩替卡韋的耐藥形式是在拉米夫定耐藥位點(diǎn)基礎(chǔ)上加上T184、S202和/或M250變異；二是該區(qū)突變有可能引起S蛋白抗原表位改變[29]，兩者同時(shí)突變有可能影響到病毒的復(fù)制能力，使得病毒復(fù)制動(dòng)力學(xué)變化，加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，增加肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[30，31]。

4 X基因區(qū)突變

X基因區(qū)（nt1374-1838）是HBV最小的開放讀碼框架（open reading frame，ORF），可分為 A-F 6 個(gè)功能區(qū)，序列相對保守?？赡茉诓《緩?fù)制中發(fā)揮重要作用。HBx可反式激活 BCP，啟動(dòng) pg-RNA和m-RNA的轉(zhuǎn)錄，使HBV復(fù)制和表達(dá)增強(qiáng)；可與多種細(xì)胞因子相互作用而增強(qiáng)原癌基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞惡變。HBx加強(qiáng)肝細(xì)胞表面 MHC I類和II類抗原的表達(dá)，促進(jìn) CTL介導(dǎo)的肝細(xì)胞壞死。另外，HBx基因在HCC癌變過程中起著重要作用。

5 多基因聯(lián)合突變

除了上述以研究HBV不同ORF基因突變對疾病轉(zhuǎn)歸的影響外，目前多區(qū)基因聯(lián)合突變逐漸得到重視。如前所述，HBV基因組非常緊湊，復(fù)制高效。不同基因區(qū)相互重疊，比如S基因完全包含在P基因區(qū)內(nèi)，因此某的區(qū)基因突變通常會(huì)導(dǎo)致其它基因功能的異常。因此，在對不同區(qū)基因突變對HBV生物學(xué)、機(jī)體免疫學(xué)等影響進(jìn)行初步了解后，研究HBV基因突變對疾病的影響應(yīng)該在將HBV視為一個(gè)整體的基礎(chǔ)上進(jìn)行，即不同基因區(qū)聯(lián)合突變的進(jìn)一步研究。

Preikschat等[32]縱向觀察38名腎移植術(shù)后感染HBV的患者3年半，其中14名患者隨訪期間患肝硬化，或死于終末期肝病，24名患者隨訪期間無肝硬化。發(fā)生肝硬化的患者有CP基因的插入缺失伴隨C基因的缺失及（或）前S基因的缺失突變。未發(fā)生肝硬化的患者沒有突變或僅有CP突變。發(fā)生肝硬化的患者有如下基因突變特點(diǎn)：1、CP基因的插入缺失伴隨C基因的缺失及（或）前S缺失；2、C基因的缺失伴隨CP基因的插入缺失及（和）前S缺失。2006年Chen[8]等分析了46名乙型肝炎攜帶者和106名年齡匹配的不同疾病進(jìn)程的患者（包括38名慢性乙型肝炎、18名肝硬化、50名肝癌患者）結(jié)論：前S缺失和BCP及PC突變患者隨著疾病進(jìn)展發(fā)生率增高，Logistic回歸分析顯示前S缺失聯(lián)合BCP突變在疾病進(jìn)展中更有意義，聯(lián)合突變比單突變更有意義，尤其是聯(lián)合前S突變患者。2007年Chen[15]縱向研究了141例HBeAg陰性的病例，包括45例無癥狀攜帶者、96例慢性乙肝患者。同未發(fā)生肝硬化患者相比，發(fā)生肝硬化的患者基因C型、前S 區(qū) 缺 失 、C/G1753、T1762/A1764、T1766 和/或 A1768、和G1799突變株發(fā)生幾率更高，Cox回歸分析顯示，年齡大、高總膽紅素，HBV DNA水平、前S缺失、T1766和/或 A1768突變與肝硬化發(fā)生有關(guān)?；颊逪BV有復(fù)雜變異模式（前S缺失、T1762/A1764、和T1766和/或A1768突變株）的較單位點(diǎn)突變者更易進(jìn)展至肝硬化階段。且病毒基因型不同，模式也不一樣。更進(jìn)一步說前S基因缺失突變是肝病進(jìn)展有意義的危險(xiǎn)因素。另有研究結(jié)果表明，140名乙肝后肝癌和280名乙肝未患肝癌的病人經(jīng)多因素分析[33]后，基因C型、病毒載量、A2962G、preS2啟動(dòng)子突變、C105T、T1753V 和 A1762T/G1764A與肝癌的發(fā)生獨(dú)立相關(guān)；105C和2962G在肝癌患者中檢出率更高；2962G聯(lián)合preS2啟動(dòng)子突變、105C和1762T/1764A突變在肝癌患者檢出率高于其它患者。新近的研究表明[34]：135例乙肝肝癌患者和與之在年齡、性別及HBeAg狀態(tài)匹配的非肝癌的乙肝患者相比，前S缺失在兩者檢出明顯不同，A1762T/G1764A在肝癌組中檢出率增高。兩者聯(lián)合在韓國基因亞型C2中與肝癌發(fā)生強(qiáng)相關(guān)。

[1]徐春利，郝友華，楊東亮.影響慢性乙型肝炎病毒感染者臨床結(jié)局

的病毒學(xué)因素研究進(jìn)展.實(shí)用肝臟病雜志，2012，25（3）:270-272.

[2]Chen MT，Billaud JN，Sallberg M，et al.A function of the hepatitis B virus precore protein is to regulate the immune response to the core antigen.Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101（41）:14913-14918.

[3]Tong S，Kim KH，Chante C，et al.Hepatitis B virus e antigen variants. Ⅰnt J Med Sci，2005，2（1）:2-7.

[4]Baumert TF，Yang C，Schurmann P，et al.Hepatitis B virus mutations associated with fulminant hepatitis induce apoptosis in primary Tupaia hepatocytes.Hepatology，2005，41（2）:247-256.

[5]Sugiyama M，Tanaka Y，Kurbanov F，et al. Ⅰnfluences on hepatitis B virus replication by a naturally occurring mutation in the core gene.Virology，2007，365（2）:285-291.

[6]Kao JH，Chen PJ，Lai MY，et al.Basal core promoter mutations of hepatitis B virus increase the risk of hepatocellular carcinoma in hepatitis B carriers.Gastroenterology，2003，124（2）:327-334.

[7]Lin CL，Liao LY，Wang CS，et al.Basal core-promoter mutant of hepatitis B virus and progression of liver disease in hepatitis B e antigen-negative chronic hepatitis B.Liver Ⅰnt，2005，25（3）:564-570.

[8]Chen BF，Liu CJ，Jow GM，et al.High prevalence and mapping of pre-S deletion in hepatitis B virus carriers with progressive liver diseases.Gastroenterology，2006，130（4）:1153-1168.

[9]Liu CJ，Chen BF，Chen PJ，et al.Role of hepatitis B viral load and basal core promoter mutation in hepatocellular carcinoma in hepatitis B carriers.J Ⅰnfect Dis，2006，193（9）:1258-1265.

[10]Tong MJ，Blatt LM，Kao JH，et al.Precore/basal core promoter mutants and hepatitis B viral DNA levels as predictors for liver deaths and hepatocellular carcinoma.World J Gastroenterol，2006，12（41）:6620-6626.

[11]Liu S，Zhang H，Gu C，et al.Associations between hepatitis B virus mutations and the risk of hepatocellular carcinoma:a meta-analysis.J Natl Cancer Ⅰnst，2009，101（15）:1066-1082.

[12]Guo X，Jin Y，Qian G，et al.Sequential accumulation of the mutations in core promoter of hepatitis B virus is associated with the development of hepatocellular carcinoma in Qidong，China.J Hepatol，2008，49（5）:718-725.

[13]Yin J，Xie J，Liu S，et al.Association between the various mutations in viral core promoter region to different stages of hepatitis B，ranging of asymptomatic carrier state to hepatocellular carcinoma.Am J Gastroenterol，2011，106（1）:81-92.

[14]Xu Z，Ren X，Liu Y，et al.Association of hepatitis B virus mutations in basal core promoter and precore regions with severity of liver disease:an investigation of 793 Chinese patients with mild and severe chronic hepatitis B and acute-on-chronic liver failure.J Gastroenterol，2011，46（3）:391-400.

[15]Chen CH，Hung CH，Lee CM，et al.Pre-S deletion and complex mutations of hepatitis B virus related to advanced liver disease in HBeAg-negative patients.Gastroenterology，2007，133（5）:1466-1474.

[16]Kim H，Lee SA，Kim DW，et al.Naturally occurring mutations in large surface genes related to occult infection of hepatitis B virus genotype C.Plos One，2013，8（1）:e54486.

[17]Hsieh YH，Su ⅠJ，Wang HC，et al.Pre-S mutant surface antigens in chronic hepatitis B virus infection induce oxidative stress and DNA damage.Carcinogenesis，2004，25（10）:2023-2032.

[18]Wang HC，Chang WT，Chang WW，et al.Hepatitis B virus pre-S2 mutant upregulates cyclin A expression and induces nodular proliferation of hepatocytes.Hepatology，2005，41（4）:761-770.

[19]Hsieh YH，Su ⅠJ，Wang HC，et al.Hepatitis B virus pre-S2 mutant surface antigen induces degradation of cyclin-dependent kinase inhibitor p27Kip1 through c-Jun activation domainbinding protein 1.Mol Cancer Res，2007，5（10）:1063-1072.

[20]Mun HS，Lee SA，Kim H，et al.Novel F141L pre-S2 mutation in hepatitis B virus increases the risk of hepatocellular carcinoma in patients with chronic genotype C infections.J Virol，2011，85（1）:123-132.

[21]Lin CL，Liu CH，Chen W，et al.Association of pre-S deletion mutant of hepatitis B virus with risk of hepatocellular carcinoma.J Gastroenterol Hepatol，2007，22（7）:1098-1103.

[22]Yeung P，Wong DK，Lai CL，et al.Association of hepatitis B virus pre-S deletions with the development of hepatocellular carcinoma in chronic hepatitis B.J Ⅰnfect Dis，2011，203（5）:646-654.

[23]Wang HC，Huang W，Lai MD，et al.Hepatitis B virus pre-S mutants，endoplasmic reticulum stress and hepatocarcinogenesis.Cancer Sci，2006，97（8）:683-688.

[24]Mun HS，Lee SA，Jee Y，et al.The prevalence of hepatitis B virus preS deletions occurring naturally in Korean patients infected chronically with genotype C.J Med Virol，2008，80（7）:1189-1194.

[25]Song BC，Kim H，Kim SH，et al.Comparison of full length sequences of hepatitis B virus isolates in hepatocellular carcinoma patients and asymptomatic carriers of Korea.J Med Virol，2005，75（1）:13-19.

[26]Ahn SH，Yuen L，Han KH，et al.Molecular and clinical characteristics of hepatitis B virus in Korea.J Med Virol，2010，82（7）:1126-1134.

[27]Yin J，Xie J，Zhang H，et al.Significant association of different preS mutations with hepatitis B-related cirrhosis or hepatocellular carcinoma.J Gastroenterol，2010，45（10）:1063-1071.

[28]Ji D，Liu Y，Li L，et al.The rtL229 substitutions in the reverse transcriptase region of hepatitis B virus（HBV）polymerase are potentially associated with lamivudine resistance as a compensatory mutation.J Clin Virol，2012，54（1）:66-72.

[29]Locarnini SA，Yuen L.Molecular genesis of drug-resistant and vaccine-escape HBV mutants.Antivir Ther，2010，15（3 Pt B）:451-461.

[30]Yeh CT，Chen T，Hsu CW，et al.Emergence of the rtA181T/sW172*mutant increased the risk of hepatoma occurrence in patients with lamivudine-resistant chronic hepatitis B.BMC Cancer，2011，11:398.

[31]Dai J，Chen EQ，Bai L，et al.Biological characteristics of the rtA181T/sW172*mutant strain of hepatitis B virus in animal model.Virol J，2012，9:280.

[32]Preikschat P，Gunther S，Reinhold S，et al.Complex HBV populations with mutations in core promoter，C gene，and pre-S region are associated with development of cirrhosis in long-term renal transplant recipients.Hepatology，2002，35（2）:466-477.

[33]Liu S，Xie J，Yin J，et al.A matched case-control study of hepatitis B virus mutations in the preS and core promoter regions associated independently with hepatocellular carcinoma.J Med Virol，2011，83（1）:45-53.

[34]Lee MH，Kim do Y，Kim JK，et al.Combination of preS deletions and A1762T/G1764A mutations in HBV subgenotype C2 increases the risk of developing HCC. Ⅰntervirology，2012，55（4）:296-302.