超高壓液相色譜－飛行時間質(zhì)譜法分析牡丹皮化學(xué)成分

韓聰敏， 朱靖博， 丁 燕， 寇自農(nóng)， 王振中， 蕭 偉

（1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 分析測試中心，遼寧 大連 116034；3.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，江蘇 連云港 222001）

0 引 言

牡丹皮（Moutan Cortex）系毛茛科（Ranunculacease）芍藥屬植物牡丹Paeonia suffruticaosa Andr.的干燥根皮，至今發(fā)現(xiàn)含有酚酸類、萜類、黃酮類、鞣質(zhì)、甾醇等多類化學(xué)成分［1］，其主要有效成分為丹皮酚、芍藥苷類及沒食子酸［2］。牡丹皮化學(xué)成分分析的研究已有較多報道，均為HPLC－UV、HPLC－MS方法［3－5］，本文首次采用具有更高靈敏度和高分辨能力的UPLC／Q－TOFMS對牡丹皮甲醇提取物進(jìn)行分析，并對芍藥苷等單萜類化合物的質(zhì)譜裂解途徑進(jìn)行探討。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器、試劑和材料

ACQUITY UPLC／Q－TOF－MS 質(zhì) 譜儀，美國Waters公司；FW100型高速萬能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；UC－3120超聲波振蕩儀，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；MDF反滲透純水機(jī)，大連美德環(huán)保設(shè)備有限公司。

乙腈（色譜純），美國Fisher公司；甲醇（色譜純），山東禹王實(shí)業(yè)。

牡丹皮藥材由江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司提供。

1.2 色譜條件

色譜 柱 Waters BEH－C18柱 （10.0mm×2.1mm i.d.，1.7μm）；流動相 A相為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈；梯度洗脫條件為0～20min，5%～16%B；20～45min，16%～33%B；45～55min，33%～80%B；55～59min，80%～95%B；59～60min，95%～5%B。體積流量0.25mL／min，檢測波長 254nm，進(jìn)樣量0.5μL，柱溫為30℃。

1.3 質(zhì)譜檢測條件

ACQUITY UPLC／Q－TOF－MS 質(zhì) 譜儀，配有電噴霧電離接口，正、負(fù)離子模式檢測；使用高純度氮?dú)庾鲮F化氣和輔助氣，氬氣作碰撞氣；正、負(fù)離子模式下毛細(xì)管電壓為＋3和－3kV；離子源溫度120℃；加熱毛細(xì)管溫度350℃；脫溶劑氣體積流量800L／h，錐孔氣體積流量50L／h；錐孔電壓35V；正負(fù)離子模式下碰撞能分別為5.0和7.0eV；掃描范圍m／z100～1 000。

1.4 樣品制備

準(zhǔn)確稱取牡丹皮藥材5.0g，加入100mL甲醇，超聲提取3次，每次30min后過濾合并提取液，濃縮定容至10mL，分析前用0.22μm有機(jī)濾膜過濾。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡丹皮提取物分析

以0.1%甲酸－水與乙腈溶液為流動性進(jìn)行線性梯度洗脫得到了較好的分離結(jié)果（圖1）。由于牡丹皮中化合物均有較多的羥基［3］，容易形成穩(wěn)定的氧負(fù)離子，故負(fù)離子模式下檢測到12個色譜峰，正離子模式下僅得到2個色譜峰，負(fù)離子模式更適合牡丹皮中化合物的質(zhì)譜分析。

圖1 牡丹皮甲醇提取物總離子流圖Fig.1 TIC chromatogram of the methanol extract of Moutan Cortex

2.2 化合物的質(zhì)譜圖解析

采用提取分子離子峰與特征碎片離子方式，結(jié)合牡丹皮已發(fā)現(xiàn)化學(xué)成分，綜合分析各化合物的色譜保留時間、相對分子質(zhì)量、碎片離子信息以及相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)推測確定了牡丹皮中沒食子酸、芍藥苷、丹皮酚等13個化合物。

峰1：圖2A中有碎片離子m／z 169、125，推測碎片［M－H］－169為分子離子峰，碎片m／z125為分子離子失掉一個羧基—COO－（44u）形成的碎片離子，與文獻(xiàn)報道的沒食子酸（gallic acid）質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致［3－4］，峰1鑒定為沒食子酸。

峰2：圖2B中有碎片離子m／z463、301、169，牡丹皮中發(fā)現(xiàn)的化合物相對分子質(zhì)量為464的化合物只有牡丹苷B（Mudanoside B），m／z 301為分子離子失掉一個葡萄糖（162u）形成，碎片m／z 169為沒食子酸（gallic acid），與文獻(xiàn)［4］報道一致，鑒定峰2為牡丹苷B。

峰3：圖2C中只有碎片離子m／z 543，目前為止，牡丹皮相關(guān)文獻(xiàn)未曾報道此條件的化合物，查閱芍藥化學(xué)成分中存在的芍藥苷亞硫酸酯（C23H27O13S，相對分子質(zhì)量544）滿足條件，離子碎片只有m／z543，與文獻(xiàn)［6］報道一致，推測峰3為芍藥苷亞硫酸酯。

圖2 各色譜峰的質(zhì)譜圖Fig.2 MS spectrum of each peak

峰4：圖2D有碎片離子m／z 495、991，推測碎片離子m／z495為分子離子峰，碎片離子m／z 991為［2M－H］－，符合已報道化合物氧化芍藥苷質(zhì)譜信息，同時其保留時間在峰5芍藥苷之前，分子極性強(qiáng)于芍藥苷，與報道文獻(xiàn)［2，5，7］一致，推測峰4為氧化芍藥苷。

峰5：圖2E質(zhì)譜圖中存在碎片離子m／z 525、479、449、327、121，推測碎片離子m／z479為分子離子峰，碎片離子m／z 525為分子離子峰加上一分子甲酸（46u），分子離子失掉葡萄糖分子上甲氧基（30u）形成碎片離子m／z 449，進(jìn)一步丟失一分子苯甲酸（121u）形成碎片離子m／z 327，m／z165碎片為碎片離子m／z327丟失一分子葡萄糖（162u）形成的芍藥苷母核結(jié)構(gòu)，結(jié)合正離子模式中出現(xiàn)的碎片m／z 503［M＋Na］＋，與文獻(xiàn)［2］報道一致，鑒定峰5為芍藥苷。

峰6：圖2F質(zhì)譜圖中存在碎片離子m／z647、479、327、165、137，推斷碎片離子m／z647為分子離子峰，碎片離子m／z 479為分子離子失去沒食子酸（169u）形成，進(jìn)一步丟失甲氧基（30u）及苯甲酸（121u）所形成碎片離子m／z 327，碎片m／z 165為碎片離子m／z327丟失一分子葡萄糖（162 u）形成的芍藥苷母核結(jié)構(gòu)［4，8］，鑒定峰6為沒食子酰氧化芍藥苷。

峰7、峰8：由圖2G、H可以判斷，分子離子峰為m／z787，同時均存在碎片離子［M－2H］2－ m／z 393，符合牡丹皮中發(fā)現(xiàn)的鞣質(zhì)類化合物質(zhì)譜特征［3］，推測峰7、8為鞣質(zhì)1，2，3，6－tetra－O－galloy－D－glucose或1，3，4，6－tetra－O－galloy－D－glucose。

峰9：圖2I中存在碎片離子m／z 939、469、769，分子離子峰為m／z 939，碎片離子m／z 469為［M－2H］2－，分子離子峰丟失一分子沒食子酸（169u）得到碎片離子m／z 769，與文獻(xiàn)報道一致［3，7］，由此推測峰9為鞣質(zhì)1，2，3，4，6－penta－O－galloyl－β－D－glucose。

峰10、11：由圖2J、K 中分子離子峰為［M－H］－ m／z599，牡丹皮中存在一對同分異構(gòu)體苯甲酰氧化芍藥苷和Mudanpioside C，兩個化合物的色譜保留時間接近，結(jié)構(gòu)上差異為苯甲酸和對羥基苯甲酸連接位置不同［1］，峰11中質(zhì)譜碎片離子m／z447可推測為化合物中葡萄糖連接的苯甲酸（121u）及甲氧基（30u）斷裂形成，參考文獻(xiàn)［3－4］中兩化合物色譜保留時間，由此可推測峰10為Mudanpioside C，峰11為化合物苯甲酰氧化芍藥苷。

峰12：由圖2L中碎片離子m／z 583為分子離子峰，m／z 553為分子離子峰丟失一分子甲氧基（30u）形成，碎片離子m／z 553進(jìn)一步丟失一分子苯甲酸（121u）得到碎片離子m／z 431［2］，正離子模式下存在碎片離子m／z 607（［M＋Na］＋）及m／z623（［M＋K］＋），與文獻(xiàn)報道［9］一致，鑒定峰12為苯甲酰芍藥苷。

峰13：正離子模式下峰13的質(zhì)譜圖存在碎片離子m／z 167、149，可推斷m／z 167為分子離子峰［M＋H］＋，碎片離子m／z 149為［M＋HH2O］＋，與文獻(xiàn)［2］報道一致，峰13推測為丹皮酚。

表1 1～12號化合物的質(zhì)譜裂解數(shù)據(jù)Tab.1 MS fragmentation ion of compounds 1－12

2.3 牡丹皮中單萜類化合物的質(zhì)譜裂解歸納

從牡丹皮的甲醇提取物中鑒定了包括芍藥苷在內(nèi)的6個單萜類化合物，分析其共性歸納總結(jié)了此類化合物在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜裂解途徑（圖3），其裂解主要存在兩種形式：第一種為首先斷裂葡萄糖6號碳上的甲氧基－R，如芍藥苷中碎片離子m／z 449，苯甲酰芍藥苷碎片離子m／z 553、431以及 Mudanpioside C m／z 447，后苯甲酸－R基團(tuán)斷裂形成m／z 327的碎片離子，芍藥苷、沒食子酰氧化芍藥苷中均含有碎片離子m／z 327；第二種為化合物分子首先丟失葡萄糖－R，后形成蒎烷基本骨架（m／z165）及苯甲酸－R基碎片離子，如芍藥苷、沒食子酰氧化芍藥苷的碎片離子均含有m／z165，同時離子碎片存在苯甲酸－R基碎片m／z121或m／z137。

圖3 牡丹皮中芍藥苷類化合物負(fù)離子模式下可能裂解途徑Fig.3 Proposed fragmentation pathways of the［M－H］－ion of Monoterpene glycosides in Moutan Cortex

3 結(jié) 論

采用UPLC／Q－TOF－MS對牡丹皮中的主要化學(xué)成分進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定，根據(jù)各個色譜峰在質(zhì)譜中的精確分子質(zhì)量、化學(xué)式和質(zhì)譜碎片結(jié)構(gòu)信息、質(zhì)譜裂解途徑和色譜保留規(guī)律，參考已有研究成果，鑒定了牡丹皮中的13種化合物，其中峰3芍藥苷亞硫酸酯在之前牡丹皮已發(fā)現(xiàn)化學(xué)成分中尚未報道，對芍藥苷等單萜類化合物的質(zhì)譜裂解途徑進(jìn)行分析歸納。實(shí)驗(yàn)表明 UPLC／Q－TOFMS能有效分析和表征牡丹皮化學(xué)成分。

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