福建省非典型O1群埃爾托型霍亂弧菌的研究

陳愛平,鄭恩惠,李曲文,徐海濱,楊勁松,王靈嵐,鄭金鳳,嚴延生

福建省自1962年發(fā)生由埃爾托型霍亂弧菌(EVC)引起的霍亂疫情，至今已50年；期間疫情起伏不定，先后發(fā)生了幾次較大流行；在福建省50年的霍亂流行過程中病原和流行特征都發(fā)生著改變[1]。近年研究表明非典型埃爾托菌株(atypical El Tor strains)在東非、亞洲以及海地等地出現(xiàn)，主要特征表現(xiàn)為在埃爾托型基因組中雜合有部分古典型的相關(guān)基因ctxB-Cl、rstR-Cl、tcpA-Cl等；陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了Matlab變種(1991-1994年)、Mozambique變種(2004年)、突變埃爾托型(2002年)以及雜交埃爾托型(1991-2004年)等引起的局部流行，此類菌株的出現(xiàn)增加了霍亂流行的復雜性[2]。本文通過PCR擴增相關(guān)的毒力基因及對部分菌株的ctxB和rstR基因的序列進行測定和比對，對1962-2005年福建省代表性霍亂菌株進行非典型EVC的研究。

1 材料與方法

1.1實驗用菌株 選擇1962-2005年福建省歷次霍亂流行分離保存的病人和帶菌者菌株，均經(jīng)過血清學重新復核鑒定為O1群霍亂弧菌。包括福建歷史上3次霍亂流行的菌株(1962-1964年、1978-1989年、1994-2000年)，以及2005年疫情菌株。

1.2引物 引物序列及相應(yīng)的擴增條件和參考文獻見表1，寡核苷酸由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 實驗用基因及其引物序列

*Cl表示古典型等位基因，El表示埃爾托型等位基因

備注：tcpA-El和tcpA-Cl基因的區(qū)別主要位于該基因開放讀碼框(ORF)的3′端，因此下游引物決定了擴增產(chǎn)物特異性。本文參考使用的tcpA-El基因的下游引物特異堿基位點較多(引物標紅部分)，且 3′端的5個堿基是特異的，所以擴增產(chǎn)物的特異性較好；相反tcpA-Cl基因的特異堿基位點較少且處于引物的中間位置(引物標紅部分)，而決定PCR擴增特異性的3′端有9個堿基(引物標綠部分)是和埃爾托型共有的序列。原先實驗發(fā)現(xiàn)部分菌株tcpA-Cl/EL基因PCR擴增同時陽性，而國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)霍亂菌株只攜帶一種tcpA基因；因此對此類部分菌株進行tcpA-Cl/El基因的序列測定比較(古典型序列參考菌株為395,埃爾托型序列參考菌株為N16961)，結(jié)果tcpA-El基因的序列是正確的，而tcpA-Cl的序列卻顯示為tcpA-El的基因序列。因此基因的PCR擴增結(jié)果必要時要結(jié)合序列測定進行分析。

1.3PCR反應(yīng)條件 PCR反應(yīng)均采用20 μL的反應(yīng)體系，各組成成分的終濃度分別為：Ex Taq DNA聚合酶 0.5 U， dNTP 200 μmol/L，上游引物0.4 μmol/L，下游引物0.4 μmol/L，DNA模板2 μL。

1.4模板的制備 分純的細菌菌落，直接刮取適量于300 μL的純水制備成菌懸液，100 ℃煮沸裂解10 min，10 000 r/min離心5 min，取上清做為PCR檢測的DNA模板。

1.5試劑儀器 Taq DNA聚合酶、dNTP購自大連寶生物工程有限公司，瓊脂糖為BioAsia分裝品，BIO-RAD公司的Basic電泳儀，讀膠儀為BIO-RAD公司的Gel Doc XR+，PCR擴增儀為G-Storm(英國GeneTech公司)。

1.5DNA序列的測定及比較 序列測定由上海生工完成。由于ctxB(El/Cl)和rstR(El/Cl)基因?qū)τ趨^(qū)分霍亂菌株的絲狀噬菌體CTXΦ基因組類型有較大意義[2]，為了進一步確認擴增基因型的準確性，挑選部分菌株ctxB(El/Cl)和rstR(El/Cl)基因的PCR產(chǎn)物直接進行雙向測序，序列用DNAStar分析軟件進行拼接，校正后的序列在NCBI網(wǎng)站上進行核苷酸的Blast比較；同時運用DNAStar分析軟件進行序列的MegAlign。

2 結(jié) 果

2.169株O1群EVC各毒力基因檢測結(jié)果 69株1962-2005年從病人中分離到的O1群霍亂弧菌(稻葉21、小川48)，采用PCR擴增技術(shù)檢測毒力基因,包括ctxA、ctxB(El/Cl)、rstR(El/Cl)、tcpA(El/Cl)、hlyA(El/Cl)。結(jié)果69株O1群霍亂弧菌ctxA基因陽性62株(89.9%),7株ctxA基因陰性的菌株均不同程度地攜帶有其它各相關(guān)毒力基因；各毒力因子的陽檢率分別為ctxB-Cl60.9%、ctxB-El72.5%,rstR-Cl37.7%、rstR-El72.5 %,tcpA-Cl4.35%、tcpA-El69.6%,hlyA-Cl65.2%、hlyA-El79.7%；各毒力因子埃爾托型基因片段的檢出率均要高于古典型；100%實驗菌株均不同程度地攜帶有不同毒力因子的古典型(Cl)及埃爾托型(El)相關(guān)基因。詳見表2和表3。

續(xù)表

序號No.年代Year血清型SerotypectxActxB-CLctxB-ElrstR-CLrstR-EltcpA-CLtcpA-ElhlyA-CLhlyA-El391995小川型+++++-+++401995小川型---++-+--411995小川型+++++-+++421996小川型+++++-+-+431998小川型++-+-----441998小川型++-+--+++451998小川型++-+--+++461998小川型++++---++471998小川型++-+-----481999小川型-------++491999小川型++-++-+++501999小川型++-++-+++511999小川型+++++-+++521999小川型++-++----531999小川型+++++-+++541999小川型+++++--++551999小川型---+-----562000小川型--------+572000小川型-------++582000小川型+-++--+++592000小川型++-++-+--602000小川型+++++-+++612000小川型++-++-+++622000小川型---+-+---632000稻葉型 --------+642005稻葉型 +++---+-+652005稻葉型 +++---+++662005稻葉型 +++-+-+++672005稻葉型 +++-+-+++682005稻葉型 ++--+-+++692005稻葉型 ++----+-+

Note:小川型——Eltor Ogaea;稻葉型——lnaba.

表3 69株O1群EVC各毒力基因檢測結(jié)果(%)

2.2福建省歷次霍亂流行各毒力基因的檢測結(jié)果 按照福建省1962年以來霍亂先后發(fā)生過3次較大流行的時間，將69株實驗菌株劃分為第1次流行(1962-1964年)、第2次流行(1978-1986年)、第3次流行(1994-2000年)和2005年疫情菌株[1]； 各毒力因子在不同流行時期菌株中的陽檢情況見圖1。rstR-Cl只在1994-2000年流行的菌株中檢出，檢出率86.7%(26/30)。

2.3部分菌株序列測定結(jié)果 部份菌株ctxB(El/Cl)和rstR(El/Cl)基因核苷酸序列Blast以及MegAlign比對結(jié)果，顯示為相應(yīng)基因的古典型或者埃爾托型基因片段。另外，通過ctxB基因序列比對，發(fā)現(xiàn)新的204位堿基突變位點(T→G)以及國內(nèi)外未曾報道過新的ctxB基因型別，命名ctxB基因型10和11。200098菌株同時攜帶有兩種新的ctxB基因型。ctxB基因型10的115位堿基為C(His)，203位堿基為C(Thr)，204位堿基為G(Thr)；ctxB基因型11的115位堿基為C(His)，203堿基為T(Met)，204位堿基為G (Met)。到目前為止報道的ctxB基因型和特異位點(相對應(yīng)位置的氨基酸)比較，見表4。

表4 霍亂弧菌ctxB基因型別的比較

本文注：*ctxB基因型10在菌株94027和200098的ctxB-Cl基因PCR擴增產(chǎn)物的序列中發(fā)現(xiàn);ctxB基因型11在菌株200098的ctxB-El基因PCR擴增產(chǎn)物的序列中發(fā)現(xiàn)。

圖1福建省歷次霍亂流行各毒力基因的陽檢情況

Fig.1DetectionofvirulencegenesinV.choleraeisolatesfromepidemicwavesinFujian

3 討 論

霍亂腸毒素是產(chǎn)生霍亂的主要的毒力因子，其編碼基因ctxAB位于溶原性絲狀噬菌體CTXΦ基因組上。傳統(tǒng)實驗根據(jù)rstR基因的開放閱讀框以及兩側(cè)序列的不同，可以將CTXΦ前噬菌體基因組分為不同的類型,包括古典型CTXΦclass、埃爾托型CTXΦET、加爾各答型CTXΦcalc等不同的基因組類型[12-14]；ctxB基因的特征也做為區(qū)分 CTXΦ基因組類型的代表性標志[2]。檢測福建省1962-2005年O1群霍亂菌株ctxB、rstR等基因，發(fā)現(xiàn)實驗菌株均不同程度地同時攜帶有不同毒力因子的古典型和埃爾托型等位基因，即菌株基因組雜合了古典型和埃爾托型基因片段，這種現(xiàn)象較為常見。歷年菌株的表型觀察結(jié)果顯示，1962年以來福建省O1群霍亂弧菌(VC)的第IV組霍亂噬菌體(106/mL)裂解試驗、多粘菌素B敏感試驗、雞血球凝集試驗和VP試驗均符合埃爾托型霍亂弧菌(EVC)的診斷結(jié)果(溶血試驗1962-1963年為陽性，1978年開始由陽性轉(zhuǎn)換為陰性)；同時本研究實驗菌株各毒力因子埃爾托型等位基因的檢出率均要高于古典型；結(jié)合以上結(jié)果，我們認為福建省的霍亂菌株是在埃爾托型的結(jié)構(gòu)基因基礎(chǔ)上雜合了古典型的基因片段，即文獻中稱為的非典型埃爾托型霍亂弧菌[2]。對福建省不產(chǎn)毒的O1群VC的病人株和外環(huán)境株進行研究，也發(fā)現(xiàn)此類雜合型的菌株較為廣泛存在[15]。

通常，菌細胞內(nèi)的噬菌體基因組會對同類型噬菌體的超感染具有免疫作用，霍亂溶原性絲狀噬菌體CTXΦ免疫性是由rstR基因介導的[16]。實驗表明所檢測霍亂菌株的rstR-El基因的檢出率比rstR-Cl基因要高，分別為72.5%和37.7%；由此推斷福建省O1群的霍亂弧菌大部分攜帶埃爾托型CTXΦ前噬菌體，由于菌株對古典型的CTXΦ噬菌體缺乏免疫性，造成古典型CTXΦ基因組成份較為頻繁地在菌株上插入或者丟失，可能是產(chǎn)生非典型EVC菌株的重要原因。本研究同時發(fā)現(xiàn)有部分表現(xiàn)為ctxA(+)、rstR-Cl(-)、rstR-El(-)的菌株，分布年代分別為1978、1979和2005年，推測這類菌株可能包含有未發(fā)現(xiàn)的新CTXΦ基因組類型。我們將進一步分析這類菌株的rstR基因序列。

福建省1962年的霍亂菌株在基因水平就表現(xiàn)為非典型EVC菌株特征；是迄今為止報道出現(xiàn)非典型EVC菌株最早的年代；此前報道出現(xiàn)非典型EVC最早的年代是美國Gulf Coast 埃爾托型菌株[2]。另外，福建省于1994年以后出現(xiàn)整合有rstR-Cl的非典型EVC菌株；值得注意的是，福建省rstR-Cl基因出現(xiàn)的年代同國際上報道的大部分非典型EVC菌株出現(xiàn)的時間相近[2]；需要進一步研究rstR-Cl基因出現(xiàn)在福建省霍亂菌株的意義。同時，根據(jù)已知的霍亂弧菌遺傳特征，古典型菌株與埃爾托菌株不僅存在上述單基因的差異，其它基因簇如VSP-I、VSP-II和RTX基因簇(rtxA-rtxD)等[17]，也有助于區(qū)分兩種生物型。因此，結(jié)合這些基因進行分析，能夠全面揭示福建省這類非典型埃爾托型霍亂菌株的分子特征。

在霍亂弧菌的不同血清型和生物型中存在ctxB特異堿基位點的差異[2],已發(fā)現(xiàn)的ctxB基因型別見表4。本文根據(jù)部分菌株的ctxB基因序列測定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外未曾報道的ctxB基因型別(10和11)，兩種基因型別均存在204位堿基的位點突變(T→G)。菌株200098同時存在兩種新的ctxB基因型別,說明在同一菌株中存在不同的ctxB基因型別雜合形式。ctxB基因型11的115位堿基為C，表現(xiàn)為古典型ctxB位點特征，203位堿基為T，表現(xiàn)為埃爾托型ctxB位點特征，提示在ctxB序列上存在不同生物型別的特異位點組合形式;到目前為止只在O139群的ctxB基因型別4和型別6中存在類似的情況(見表4)。結(jié)果表明福建省O1群霍亂弧菌在ctxB基因型別上表現(xiàn)出獨特的地方分子特征。我們將選擇更多的霍亂菌株，進一步對ctxB基因進行序列測定，并與不同國家、地區(qū)及年代菌株的相關(guān)序列進行綜合比較，分析不同的ctxB基因型對于這類菌株在福建省霍亂流行過程及病原演變中的意義。

參考文獻：

[1]Chen KC, Chen GL, Zheng GK, et al. Changes on epidemic bacterial type of cholera in Fujian Province in the past 40 years[J]. Chin J Prev Med, 2003, Suppl: 179-183. (in Chinese)

陳亢川，陳拱立，鄭國魁, 等. 福建省40年來霍亂流行菌型的變遷[J]. 中華預防醫(yī)學雜志，2003(增刊)：179-183.

[2]Safa A, Nair GB, Kong RY. Evolution of new variants ofVibriocholeraeO1[J]. Trends Microbiol, 2010, 18(1): 46-54. DOI: 10.1016/j.tim.2009.10.003

[3]Keasler SP, Hall RH. Detecting and biotyping Vibrio cholerae O1 with multiplex polymerase chain reaction[J]. Lancet, 1993, 341: 1661.

[4]Alam M, Nusrin S, Islam A, et al. Cholera between 1991 and 1997 in Mexico was associated with infection by classical, El Tor, and El Tor variants ofVibriocholerae[J]. J Clin Microbiol, 2010, 48: 3666-3674. DOI: 10.1128/JCM.00866-10

[5]Chatterjee S, Ghosh K, Raychoudhuri A, et al. Incidence, virulence factors, and clonality among clinical strains of non-O1, non-O139Vibriocholeraeisolates from hospitalized diarrheal patients in Kolkata, India[J]. J Clin Microbiol, 2009, 47: 1087-1095. DOI: 10.1128/JCM.02026-08

[6]Bhowmick TS, Das M, Ruppitsch W, et al. Detection of virulence-associated and regulatory protein genes in association with phage typing of humanVibriocholeraefrom several geographical regions of the world[J]. J Med Microbiol, 2009, 58: 1160-1167. DOI: 10.1099/jmm.0.008466-0

[7]Olsvik O, Wahlberg J, Petterson B, et al. Use of automated sequencing of polymerase chain reaction-generated amplicons to identify three types of cholera toxin subunit B inVibriocholeraeO1 strains[J]. J Clin Microbiol, 1993, 31(1): 22-25.

[8]Goel AK, Jain M, Kumar P, et al. A new variant ofVibriocholeraeO1 El Tor causing cholera in India[J]. J Infect, 2008, 57(3): 280-281. DOI: 10.1016/j.jinf.2008.06.015

[9]Bhuiyan NA, Nusrin S, Alam M, et al. Changing genotypes of cholera toxin (CT) ofVibriocholeraeO139 in Bangladesh and description of three new CT genotypes[J]. FEMS Immunol Med Microbiol, 2009, 57(2): 136-141. DOI: 10.1111/j.1574-695X.2009.00590.x

[10]Li M, Shimada T, Morris JG Jr, et al. Evidence for the emergence of non-O1 and non-O139Vibriocholeraestrains with pathogenic potential by exchange of Oantigen biosynthesis regions[J]. Infect Immun, 2002, 70(5): 2441-2453.

[11]Yamamoto K, Do Valle GR, Xu M, et al. Amino acids of the cholera toxin fromVibriocholeraeO37 strain S7 which differ from those of strain O1[J]. Gene, 1995, 163(1): 155-156.

[12]Waldor MK, Mekalanos JJ. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin[J]. Science, 1996, 272(5270): 1910-1914.

[13]Waldor MK, Rubin EJ, Pearson GD, et al. Regulation, replication, and integration functions of the vibrion cholerae CTXΦ are encoded by region RS2[J]. Mol Microbiol, 1997, 35: 2299-2306.

[14]Davis BM, Kimsey HH, Chang W, et al. TheVibriocholeraeO139 Calcutta bacteriophage CTXΦ is infectious and encodes a novel repressor[J]. J Bacteriol, 1999, 181(21): 6779-6789.

[15]Chen AP, Li QW, Ni ER, et al. Molecular characterization of non-toxigenic O1-groupVibriocholeraestrains from Fujian Province[J]. Chin J Zoonoses, 2013, 29(5): 482-485. (in Chinese)

陳愛平,李曲文,倪二茹, 等. 福建省不產(chǎn)毒O1群霍亂弧菌分子特征分析[J]. 中國人獸共患病學報, 2013, 29(5): 482-485.

[16]Kinsey HH, Waldor MK. CTXΦimmunity: application in the development of cholera vaccines[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, 95(12): 7035-7039.

[17]Kaper JB, Morris JG Jr, Levine MM. Cholera[J]. Clin Microbiol Rev, 1995, 8(1): 48-86.