弓形蟲棒狀體分泌毒性因子－假激酶的研究進展

趙桂華，郝萬東，尹 昆

2.山東省金鄉(xiāng)第一中學，金鄉(xiāng) 272299

弓形蟲為專性胞內寄生致病原蟲，屬頂復門，呈世界分布，中間宿主廣泛，可感染包括人類在內的所有有核細胞。全世界約有三分之一的人感染，多數(shù)呈隱性感染，但對于免疫功能低下及受損人群危害重大，可引起死亡。因其復雜的生活史及致病機制，目前尚無高效的藥物能夠徹底清除隱性感染者及病人體內的蟲體及包囊，也無安全有效地疫苗可用。弓形蟲棒狀體蛋白（ROPs）是蟲體分泌于宿主細胞的效應因子，在蟲體的入侵、納蟲泡形成、增殖、出胞和逃避宿主細胞效應分子的攻擊中發(fā)揮重要作用。ROPs屬蛋白激酶家族，被稱為棒狀體蛋白激酶（ROPKs），決定弓形蟲毒力，是研制弓形蟲藥物潛在靶點和疫苗的理想對象。隨著對弓形蟲ROPKs研究的深入，發(fā)現(xiàn)決定蟲體毒力的許多基因編碼一種無催化活性的蛋白激酶，稱為假激酶（Pseudokinase）。這種酶雖無激酶活性，但它們可通過非磷酸化的方式發(fā)揮作用，成為弓形蟲不可或缺的毒性因子。假激酶與ROPKs其它成員一樣具有調控宿主細胞信號通路，協(xié)助蟲體逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊的功能，成為弓形蟲病免疫診斷、疫苗研制和抗弓形蟲藥物篩選的潛在靶點[1]。假激酶的研究是目前研究的熱點，對弓形蟲病防治意義重大。本綜述就近年來弓形蟲棒狀體分泌的假激酶的研究進展做一概述，認識它們的結構特點，揭示它們的作用機制，完善弓形蟲的致病機理。

1 弓形蟲棒狀體假激酶的結構特點及命名

假激酶于2002年由Gerard Manning等在研究人類基因組草圖中編碼蛋白激酶的基因時發(fā)現(xiàn)并正式命名。人類蛋白激酶大約有10%屬于假激酶，它們至少缺失一種激酶催化活性所必需的3個關鍵氨基酸（賴氨酸、天冬氨酸、天冬氨酸），導致喪失激酶活性[2]。隨后的研究證明假激酶在生物界普遍存在，幾乎遍布所有蛋白激酶家族，其中弓形蟲的含量最高，占總蛋白激酶的30%（160余個）[3]。目前關于假激酶的來源有兩種不同的觀點，一是認為假激酶是由活性激酶基因突變而成[4]；另一種觀點則認為活性激酶來自假激酶，最初這些假激酶主要行使其非催化功能，隨著基因的復制、突變，其中某些基因逐漸具備催化活性，形成真正的激酶[5]。從假激酶來源可看出與激酶聯(lián)系緊密。弓形蟲假激酶的研究主要集中于棒狀體分泌的假激酶，其結構由N端結構域（NTE）和核心結構域組成。N端結構域保守性低、柔性強，由數(shù)個富含堿性氨基酸的α螺旋構成，稱為N端延伸序列（NTE）。在某些假激酶（如ROP2）的晶體結構中，NTE纏繞在激酶折疊結構域的表面，充當假激酶行使非磷酸化功能的作用亞基[6]。激酶的核心結構域由12個亞結構域（分別命名為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵa，Ⅵb，Ⅶ，Ⅷ，Ⅸ，Ⅹ，Ⅺ ）組成，包括ATP結合結構域、γ磷酸基轉移結構域、Mg2＋離子結合結構域等。假激酶與激酶的核心結構域序列比對分析（圖1）揭示弓形蟲棒狀體假激酶成員在某些關鍵位點發(fā)生了不同程度的突變，如ROP2缺少結合ATPαβ磷酸基的富G環(huán)，Ⅱ亞結構域內賴氨酸（K72）突變?yōu)榻M氨酸（H），Ⅶ亞結構域中參與結合Mg2＋的3個催化殘基DFG中的天冬氨酸（D184）突變?yōu)楦拾彼幔℅），這些關鍵位點的突變，使ROP2不能與ATP結合（如圖2），喪失了蛋白激酶活性。同樣屬于假激酶的ROP4，ROP5，ROP7和ROP8的關鍵催化位點的突變情況與之相似，其亞結構域（富G環(huán)、Ⅱ、Ⅶ）內缺少一個或多個關鍵氨基酸殘基[7－9]，導致不能或錯誤的與 ATP結合（如圖2），不具備激酶活性。這種結構改變本質上是一種趨利進化方式，利于充分發(fā)揮假激酶的功能[10－11]。這些核心結構域內氨基酸序列結構特點及不能使底物磷酸化的功能特性是目前區(qū)分及定義假激酶的唯一標準。

圖1 假激酶與活性激酶核心結構域關鍵氨基酸殘基的比較分析Fig.1 Comparison of key amino acid residues of kinases and pseudokinases core domain

2 假激酶的作用機制

圖2 假激酶與PKA激酶結合ATP結構示意圖（Kornev AP，Tavlor SS.Structure，2009）Fig.2 Binding ATP structure of pseudokinases and PKA kinase（Kornev AP，Tavlor SS.Structure，2009）

假激酶雖無激酶活性，但在生物進化中，其基因一直保持編碼活性，且序列高度保守，說明其編碼產(chǎn)物－假激酶具備重要的生理功能。目前已知假激酶的作用方式有3種：（1）通過構象變化調控激酶活性；（2）作為支架蛋白為其它蛋白間的互相作用提供平臺；（3）與受體共同發(fā)揮作用，促進細胞間的交流，或起到“保鏢”的作用，幫助其它蛋白準確到達作用位點等。為揭示假激酶的作用機制，Elton Zeqiraj[12]等 研 究 了 三 元 復 合 物 LKB1－STRADMO25的晶體結構，其中LKB1是調控腺苷酸激酶（AMPK）活性的腫瘤抑制蛋白激酶，STRADα是假激酶，MO25α為支架蛋白。STRADα采用一種類似于典型的蛋白激酶構象（假的活性位點）結合LKB1為假底物，改變LKB1的構象，促進其活性構象形成，同時MO25α通過與LKB1催化活性環(huán)的互作穩(wěn)定其活性構象，使LKB1一直處于活性狀態(tài)。該研究揭示了假激酶STRADα通過自身構象變化調控激酶LKB1活性的作用機制。Freeman[13]等研究表明假激酶iRhom可作為一種調控蛋白發(fā)揮作用，其成員iRhom2與內質網(wǎng)中的TACE結合，使其離開內質網(wǎng)到達細胞膜，促進抗炎因子TNFα的釋放，參與調控抗病原體的免疫保護反應。Ras激酶抑制劑（KSR）是一種假激酶，其成員包括KRS1和KRS2，是 MAP激酶信號通路中Ras誘導RAFMEK－ERK組件活性的必需成員。Raf，MEK，ERK蛋白形成一個重要的信號傳導通路，該通路與癌癥發(fā)生有關，在癌癥患者體內被異常激活，KSR作為一種分子支架將RAF、MEK和ERK三成員綁定在一起。在芽殖酵母內采用替換的方式研究了KSR1的作用機制。KSR1的假激酶結構域結合MEK和RAF形成信號復合物，ERK通過一個保守結構域的N端與假激酶結構域結合形成三元信號轉導復合物。KSR2在MAP激酶信號通路中的支架功能與KSR1相似，并且被Ca2＋水平影響的去磷酸化作用調控[14－15]。假激酶無論哪種作用機制均與活性激酶的催化功能存在密切的聯(lián)系，為活性激酶的功能伴侶。

3 弓形蟲棒狀體假激酶的功能

ROPKs家族中大量假激酶的存在，預示它們具有重要的功能，但目前多數(shù)假激酶的功能未知。ROP5由于缺少一個關鍵的催化殘基（天冬氨酸）導致其錯誤的綁定ATP，不具備催化活性，屬于假激酶[16]。目前有關它的研究比較深入，具多態(tài)性，決定弓形蟲不同基因型的致病力[17]。ROP5被分泌后通過膜結合結構域（RAH）定位于PVM。在小鼠體內，ROP5通過阻止免疫相關GTP酶（IRGs）在PVM的積累維持PVM的完整性，逃避宿主細胞經(jīng)干擾素γ（IFNγ）調控的蟲體清除機制。目前關于ROP5的作用機制有2種觀點，一是ROP5直接與IRGs互作，使IRGs的構象發(fā)生變化，易于ROP18對其進行磷酸化，導致IRGs失活，不能形成二聚體，影響它們在PVM上的積累。Boothroyd等的研究揭示，在小鼠體內，ROP5能夠綁定IRGs家族的3個成員（IRGa6，IRGb6，IRGb10）。ROP5與IRGa6的互作占據(jù)掩蓋了IRGa6的活性位點，使IRGa6處于GDP－lock構象狀態(tài)，該構象不適于IRGa6在PVM聚集；且IRGa6核苷酸轉換環(huán)loopⅠ內的兩個關鍵蘇氨酸（T102，T108）暴露在易被ROP18磷酸化的位置，有利于ROP18對ROP5－IRGa6復合物磷酸化，磷酸化的IRGa6永久失活，不能與PVM結合，從而喪失了對宿主細胞的保護作用[18]。二是ROP5通過改變ROP18構象調控它的激酶活性，為ROP18的變構增活因子。弓形蟲強毒Ⅰ型遺傳圖譜顯示ROP5與ROP18可相互作用控制弓形蟲的毒性。Behnke等的研究表明ROP5通過構象變化調控ROP18的激酶活性，但不影響ROP18的表達及PVM定位。為了驗證這一功能，用體外重組ROP18及從野生型蟲株（RHDku80）和ROP5缺失株（RHDku80Drop5）中獲得ROP18，分別對人工合成的dMBP和宿主細胞內的IRGb6進行磷酸化。結果表明，在缺失ROP5的情況下，重組及內原的ROP18對dMBP及IRGb6進行磷酸化的能力顯著降低；在ROP5存在情況下，重組ROP18的活性增加12倍，內源ROP18的活性增加35倍，并且能夠使dMBP和IRGb6磷酸化。這一研究否定了這些蛋白（ROP5，ROP18，IRGb6）形成穩(wěn)定復合物、ROP5與IRGb6、ROP18與IRGb6是增強ROP18活性的原因；同時證明ROP18的催化活性受假激酶ROP5的調控[19－20]。上述 ROP5的功能均借助于ROP18的激酶活性。最近的研究表明，ROP5的作用底物除了IRGs和ROP18外，還有其它效應因子，其毒性作用亦可獨立完成，因為缺失ROP5的Ⅰ型株的毒性減弱程度大于ROP18缺失的Ⅰ型株。至于ROP5其它的互作效應因子及毒性作用機制有待進一步的探討[19]。

ROP2與ROP5一樣定位于PVM，是弓形蟲ROPKs家族中最早被發(fā)現(xiàn)的典型代表，早期研究表明ROP2是一種跨膜蛋白，參與PVM的形成，通過N端的信號序列招募宿主細胞的線粒體及高爾基體到PVM的周圍，在宿主細胞線粒體與納蟲泡膜之間形成分子連接，參與營養(yǎng)物質的運輸、代謝產(chǎn)物的排泄及蟲體與宿主細胞的相互作用[21－22]；但最近隨著對它跨膜的拓補學結構及晶體結構特點研究的深入，認識到它的上述作用是次要的，在蟲體入侵及胞內復制中可能通過其它方式擔當重要角色[25]，至于具體什么作用目前仍是未知。此外，Hooi Yee研究表明ROP2重組蛋白具有較強的免疫原性，可作為弓形蟲病免疫診斷的標志物[6]。ROP2的功能是否與ROP5一樣能夠調控其它蛋白激酶的活性、是否具有其它重要的作用底物等都有待進一步的研究。

研究表明ROP8與ROP2關系密切。ROP8基因與ROP2基因串聯(lián)存在，它們核苷酸及編碼氨基酸的同源性分別為85%、75%。在功能方面，ROP8與ROP2一起參與PV的構建及PVM與宿主細胞線粒體的連接[23]。2014年，Alaganan A 等揭示ROP8，ROP2，ROP18，GRA7在PVM 上形成一個大的蛋白復合物；但通過基因敲除技術證明，ROP8，ROP2并不參與調控ROP18的功能[24]。與ROP2一樣，ROP8的功能有待深入研究。

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