原發(fā)性低鉀型周期性麻痹患者的基因及影像學(xué)研究

賈白雪 楊旗 王涵 郭秀海

原發(fā)性低鉀型周期性麻痹(hypokalemic periodic paralysis, HypoPP )是一種以發(fā)作性的遲緩性癱瘓伴血鉀水平降低為特征的骨骼肌離子通道病[1]。在高加索人種中，多數(shù)HypoPP患者為家族性(familial periodic paralysis, FPP)，呈常染色體顯性遺傳，涉及的基因有CACNA1S基因和SCN4A基因。有近90%的HypoPP患者被發(fā)現(xiàn)在上述基因編碼骨骼肌離子通道電壓感受器S4片段的外顯子上存在導(dǎo)致精氨酸替換的點(diǎn)突變[2]。亞洲各國(guó)報(bào)道的HypoPP患者以散發(fā)性(sporadic periodic paralysis, SPP)為主，少數(shù)以家系形式存在，多數(shù)患者在上述兩個(gè)基因上未發(fā)現(xiàn)突變[3-6]。

近年來(lái)，肌肉MRI由于其無(wú)創(chuàng)、清晰及可重復(fù)等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)肌肉疾病的診斷和評(píng)估。本研究觀察了中國(guó)HypoPP患者的基因特點(diǎn)，并分析了HypoPP患者發(fā)作間期的小腿肌肉MRI表現(xiàn)及病變分布特點(diǎn)。

1 對(duì)象和方法

1.1對(duì)象收集就診于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門、急診，確診為原發(fā)性HypoPP的患者共40例，年齡15～61歲，平均(31.0±7.9)歲，包括SPP患者33例，F(xiàn)PP患者7例(其中1例來(lái)自于一個(gè)四代家系，其余6例均為僅父親有類似發(fā)作史)。選取10例年齡匹配的健康對(duì)照者。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)有發(fā)作性骨骼肌弛緩性癱瘓而無(wú)感覺(jué)障礙；(2)至少有一次發(fā)作時(shí)進(jìn)行血清鉀檢測(cè)，血鉀水平低于3.5 mmol/L；(3)補(bǔ)鉀治療有效；(4)有或無(wú)類似發(fā)作的家族史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)甲狀腺功能亢進(jìn)，不能除外甲亢性周期性麻痹者；(2)存在腎小管酸中毒、糖尿病酸中毒、糖皮質(zhì)激素使用等其他導(dǎo)致低血鉀者；(3)有MRI檢查禁忌的患者；(4)拒絕基因篩查及MRI檢查者。所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

上述一四代家系共有9例患者，其中1例已去世(圖1)。首次發(fā)病年齡10～30歲，其中6例為20歲左右發(fā)病，50歲以后逐漸停止發(fā)作；發(fā)病誘因有受涼等，部分患者發(fā)病無(wú)明確誘因；無(wú)力以雙下肢為主，重者可出現(xiàn)四肢無(wú)力，發(fā)作頻率每個(gè)月數(shù)次至每年一到兩次，部分患者發(fā)作時(shí)測(cè)血鉀降低，補(bǔ)鉀治療有效。

1.2方法

1.2.1熱點(diǎn)基因篩查：取外周血3 mL，應(yīng)用高鹽沉淀法提取基因組DNA[7]。

1.2.2PCR檢測(cè)：CACNA1S基因第4、11、21、30外顯子和SCN4A 基因第5、12、13、18、24外顯子為編碼電壓感受器的部分。利用9對(duì)引物[2]，應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增上述9個(gè)外顯子，引物由上海生工生物工程有限公司合成。(1)擴(kuò)增CACNA1S基因各外顯子的PCR：反應(yīng)體系30 μL，含DNA 200 ng，10×PCR Buffer 5 μL,10 mol/L上下游引物各2 μL，dNTPs 200 μmol/L，TaqDNA聚合酶2.5 U(日本TaKaR公司)。(2)擴(kuò)增SCN4A基因各外顯子的PCR：反應(yīng)體系50 μL ，含DNA 200 ng ，10×PCR Buffer5 μL, 10 mol/L上下游引物各1.5 μL ，dNTPs 200 μmol/L，TaqDNA聚合酶1.0 U(日本TaKaR公司)。 PCR反應(yīng)條件：采用PTC-100 PCR儀(美國(guó)BIO-RAD)，預(yù)變性95℃ 10 min×1個(gè)循環(huán)；變性95℃ 30 s，退火60℃(SCN4A基因?yàn)?8℃)30 s，延伸72℃ 30 s×30個(gè)循環(huán)；延伸7 min×1個(gè)循環(huán)。應(yīng)用2%(質(zhì)量濃度)瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的質(zhì)量，用密尼博純化版純化。

：先證者；□：健康男性；○：健康女性；■：男性患者；●：女性患者；：死亡

圖1HypoPP患者一家系遺傳圖譜

1.2.3基因測(cè)序：用美國(guó)產(chǎn)ABI 3730XL DNA測(cè)序儀對(duì)純化后PCR產(chǎn)物進(jìn)行正反向測(cè)序，明確有無(wú)突變。測(cè)序由賽諾基因公司完成。對(duì)發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性突變的家族性HypoPP患者，對(duì)其家系中其余患者及部分未發(fā)病者進(jìn)行基因篩查。

1.2.4雙下肢MRI檢查：對(duì)20例患者(FPP患者4例，SPP患者16例，于發(fā)作間期進(jìn)行)和10例健康受試者進(jìn)行雙小腿MRI檢查。采用SIMENS 3.0T MR機(jī)，分別進(jìn)行軸位及冠狀位脂肪抑制T2WI掃描，參數(shù)為T2-TSE-TRA-FS(TR=4540 ms，TE=109 ms，ST=5.0 mm)及T2-TSE-COR-FS(TR=3670 ms，TE=95 ms，ST=5.0 mm)。所有受試者在檢查前2 d避免劇烈運(yùn)動(dòng)。影像學(xué)量化方法：(A):由一名臨床醫(yī)師和一名影像科醫(yī)師進(jìn)行測(cè)量，采用盲法對(duì)每個(gè)患者及健康受試者的軸位脂肪抑制T2WI選取3個(gè)層面，在各層面上共同選取感興趣區(qū)域(region of interest，ROI)，測(cè)量信號(hào)強(qiáng)度，并以相應(yīng)區(qū)域的背景信號(hào)強(qiáng)度為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，將3個(gè)層面的平均值作為該患者的信號(hào)強(qiáng)度值，以此代表其肌肉水腫程度。(B)：由一名影像專業(yè)醫(yī)師按照下述標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所有影像的每塊肌肉進(jìn)行盲法評(píng)分[8]：0分：正常表現(xiàn)——肌肉MRI上無(wú)異常信號(hào)；1分：輕度異?！⒃诘陌咂瑺罡咝盘?hào)，異常信號(hào)小于肌肉體積的30%；2分：中度異?！瑺罡咝盘?hào)，異常信號(hào)占肌肉體積的30%～60%；3分：重度異?！∪?0%以上的區(qū)域顯示異常高信號(hào)，或肌肉與周圍肌肉間分界不清，難以辨認(rèn)。每塊肌肉以每例患者(雙側(cè))的受累次數(shù)(0～2次)作為該肌肉是否易受累的評(píng)價(jià)指標(biāo)，以每例患者(雙側(cè))的評(píng)分(0～6分)作為該肌肉受累程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距間距表示，采用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。以P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1基因型及表型基因篩查共發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性突變2例，基因突變均位于CACNA1S基因上，分別為1例SPP患者(R1239H)和前述一四代家系的患者(R900S)。余38例HypoPP患者(FPP患者6例，SPP患者32例)均未在上述基因篩查中發(fā)現(xiàn)突變。

2.1.1存在R1239H突變SPP患者：患者女，22歲，8歲起病，受涼、進(jìn)食碳水化合物及情緒緊張時(shí)易發(fā)作，表現(xiàn)為四肢無(wú)力，嚴(yán)重時(shí)平躺不能翻身，約1～2個(gè)月發(fā)作1次。19歲時(shí)因近1年發(fā)作頻繁(每周1次)首次就診，發(fā)作時(shí)測(cè)血鉀降低，補(bǔ)鉀治療有效。否認(rèn)家族史。目前患者出現(xiàn)雙下肢持續(xù)性無(wú)力、沉重感?；颊逤ACNA1S基因第30外顯子上存在c.3716 G>A雜合突變，導(dǎo)致氨基酸R1239H 改變。對(duì)其哥哥(健康人)進(jìn)行基因篩查，相應(yīng)位點(diǎn)無(wú)該突變(圖2)。

2.1.2存在R900S突變的一四代家系：對(duì)家系中存活的所有患者(8例)及3例未發(fā)病親屬(Ⅲ8、Ⅲ11、Ⅳ1)進(jìn)行了基因篩查。8例患者的CACNA1S基因第21外顯子上均發(fā)現(xiàn)c.2700 G>C雜合突變，導(dǎo)致氨基酸R900S 改變。3例未發(fā)病親屬年齡均小于15歲，其中1例(Ⅲ11，14歲)存在該突變，另外兩位家庭成員未見(jiàn)該突變(圖3)。

A：患者正向測(cè)序結(jié)果顯示CACNA1S基因CDS位點(diǎn)3716(G→A)雜合突變(↓)，導(dǎo)致CGT(Arg)→CAT(His)，引起氨基酸改變R1239H；B：患者哥哥(健康人)正向測(cè)序結(jié)果顯示3716 G(↓)無(wú)突變，CGT編碼精氨酸(Arg)

圖2某例SPP患者及其兄的CACNAIS基因第30外顯子的測(cè)序圖譜

A：患者正向測(cè)序結(jié)果顯示CACNA1S基因CDS位點(diǎn)2700(G→C)雜合突變(↓)，導(dǎo)致ACC(Arg)→AGC(Ser)，引起氨基酸改變R900S；B：正常家庭成員中Ⅲ8正向測(cè)序結(jié)果正常，為2700G(↓)，AGG編碼精氨酸(Arg)

圖3一家系HypoPP患者及其正常家系成員的CACNA1S基因第21外顯子的測(cè)序圖譜

2.2影像學(xué)表現(xiàn)

2.2.1脂肪抑制T2WI表現(xiàn)：20例患者雙小腿在脂肪抑制T2WI上均存在不同程度的高信號(hào)(標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)強(qiáng)度389.7±68.1)，10例正常受試者雙小腿肌肉在脂肪抑制T2WI上均表現(xiàn)為均勻一致等信號(hào)(標(biāo)準(zhǔn)化信號(hào)強(qiáng)度275.4±33.2)，兩者之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)(圖4)。

A：健康受試者表現(xiàn)為雙小腿肌肉均勻一致等信號(hào)；B：患者雙側(cè)腓腸肌外側(cè)頭呈顯著高信號(hào)(箭頭所示)

圖4正常受試者及HypoPP患者小腿MRI(脂肪抑制T2WI)表現(xiàn)比較

2.2.2存在R1239H基因突變患者的MRI表現(xiàn)：R900S突變家系患者未接受MRI檢查。存在R1239H突變的1例SPP患者雙小腿肌肉受累較重(圖5)，評(píng)分為54分，明顯高于另19例患者(評(píng)分1～17分，中位數(shù)5分，四分位數(shù)間距為4分)。

通過(guò)對(duì)存在R1239H突變的1例SPP患者進(jìn)行生活指導(dǎo)，囑其避免誘因，并進(jìn)行口服補(bǔ)鉀治療，3年后此例患者發(fā)作頻率明顯下降，由每周1次下降至每2～3個(gè)月1次，復(fù)查下肢MRI可見(jiàn)脂肪抑制T2WI高信號(hào)較前明顯減輕、局限(圖5)。肌肉評(píng)分由54分下降至38分。

圖5存在R1239H突變SPP患者改變生活方式后3年(B)復(fù)查MRI可見(jiàn)左下肢脂肪抑制T2WI高信號(hào)較改變生活方式前(A)明顯減輕、局限

2.2.3患者肌肉受損分布：患者肌肉受累符合一定的分布規(guī)律，最易受累的肌肉分別為腓腸肌外側(cè)頭、比目魚(yú)肌、腓腸肌內(nèi)側(cè)頭及脛骨前肌，而腓骨長(zhǎng)短肌、脛骨后肌、趾、踇長(zhǎng)伸肌及趾踇長(zhǎng)屈肌則較少受累(表1)?；颊吒骷∪馐芾鄞螖?shù)及評(píng)分間比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。

表 1 患者小腿肌肉受累次數(shù)及受累評(píng)分表

3 討論

該研究結(jié)果顯示，同其他亞洲國(guó)家相似，中國(guó)HypoPP患者以SPP為主，呈典型常染色體顯性遺傳的多代家系僅有1例；共發(fā)現(xiàn)兩例患者呈陽(yáng)性突變，分別為位于CACNA1S基因的R1239H(SPP患者)及R900S(四代家系)突變，余患者均未發(fā)現(xiàn)突變，表明多數(shù)中國(guó)HypoPP患者并非由目前已知區(qū)域的突變導(dǎo)致，推測(cè)可能是位于上述基因其他位點(diǎn)的突變或未知基因的突變引起。

HypoPP的發(fā)病機(jī)制尚不肯定，目前認(rèn)為由上述兩基因突變導(dǎo)致的精氨酸替換而產(chǎn)生的“門控漏電流”為致病的關(guān)鍵[9]。該電流的持續(xù)存在導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞膜靜息電位穩(wěn)態(tài)改變，在導(dǎo)致血鉀降低的誘因的存在下，出現(xiàn)無(wú)力的發(fā)作。此外，該電流的長(zhǎng)期作用使肌細(xì)胞內(nèi)鈉離子持續(xù)超載，產(chǎn)生細(xì)胞毒性，即使在發(fā)作間期，患者細(xì)胞也可能存在水腫和變性[10-11]。

近年來(lái)，人們開(kāi)始應(yīng)用MRI，通過(guò)對(duì)肌肉水分、鈉及脂肪的含量及分布的顯示來(lái)研究HypoPP的發(fā)病機(jī)制[10]。23Na-MRI是一項(xiàng)能顯示骨骼肌內(nèi)鈉離子分布的磁共振序列，H1-MRI能夠清晰地顯示軟組織結(jié)構(gòu)，較穩(wěn)定地反映肌肉的脂肪變性及水腫病變。Jurkat-Rott 等研究表明，H1-MRI顯示的肌肉水腫程度與23Na-MRI顯示的鈉超載呈線性相關(guān)(r2=0.63)，認(rèn)為H1-MRI可作為反映肌細(xì)胞內(nèi)鈉超載的手段[10]。

該研究對(duì)20例HypoPP患者進(jìn)行了雙下肢MRI檢查發(fā)現(xiàn)，患者發(fā)作間期小腿肌肉MRI的脂肪抑制T2WI信號(hào)強(qiáng)度與健康受試者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明患者小腿肌肉即使在發(fā)作間期存在水腫，這與HypoPP的門控孔道電流導(dǎo)致鈉超載理論一致，證實(shí)了盡管HypoPP為發(fā)作性病程，發(fā)作間期患者的表現(xiàn)可完全正常，但其膜內(nèi)外離子的異常分布持續(xù)存在。發(fā)作間期患者處于亞臨床狀態(tài)，當(dāng)有誘因存在時(shí)可導(dǎo)致患者無(wú)力發(fā)作。因此，盡管多數(shù)中國(guó)HypoPP患者不存在已知位點(diǎn)的突變，但其發(fā)病機(jī)制與漏電流及鈉超載機(jī)制存在密切聯(lián)系。

存在R1239H突變的患者小腿肌肉受累程度嚴(yán)重，即使治療好轉(zhuǎn)后，其受累評(píng)分仍明顯高于其他未發(fā)現(xiàn)突變患者。由此推測(cè)，存在相關(guān)位點(diǎn)的經(jīng)典突變的HypoPP患者其肌膜內(nèi)外離子的異常分布及鈉超載較其余患者嚴(yán)重，這與其臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度一致。

目前對(duì)各種神經(jīng)肌肉疾病的肌肉MRI表現(xiàn)研究較多[12-13]，但對(duì)HypoPP患者的研究較少，對(duì)其下肢肌肉受損的分布特點(diǎn)尚未見(jiàn)報(bào)道。該研究發(fā)現(xiàn)，HypoPP患者易受累的肌肉為小腿三頭肌(比目魚(yú)肌、腓腸肌外側(cè)頭及腓腸肌內(nèi)側(cè)頭)，均為負(fù)重的大塊肌肉，而余小肌肉群則較少受累，推測(cè)其原因可能是由于負(fù)重的肌肉較小肌肉電活動(dòng)更頻繁，肌膜上漏電流更活躍，進(jìn)而導(dǎo)致鈉超載及水腫程度更重，也可進(jìn)一步繼發(fā)肌纖維損傷。

此外，對(duì)R1239H突變的散發(fā)性患者的影像學(xué)隨訪表明，HypoPP患者下肢肌肉MRI改變具有一定可逆性，提示下肢肌肉MRI可能作為治療效果的監(jiān)測(cè)手段，但其確切結(jié)論還需進(jìn)一步證實(shí)。

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