枸骨葉中蘆丁的提取及含量測(cè)定

李艷芝 付英杰 王建安 季榮濤

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東日照276826）

枸骨葉來(lái)源于冬青科冬青屬植物枸骨（Ilex cornuta Lindl.et Paxt.）的干燥葉，具有清熱養(yǎng)陰、益腎平肝等功效[1]。枸骨葉可以做苦丁茶用，是減肥及預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的良好飲品[2]。研究表明，枸骨葉中主要含有三萜類[2－5]、黃酮類化合物[6]等，枸骨葉中蘆丁的提取及含量測(cè)定未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本文采用正交試驗(yàn)對(duì)枸骨葉中蘆丁超聲提取工藝進(jìn)行研究，并采用高效液相色譜法建立其含量測(cè)定方法，旨在為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用枸骨葉資源提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀SPD－10AVP，LC－10ATVP（島津國(guó)際貿(mào)易上海有限公司）；TU－1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；BS224S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.2 試藥

枸骨葉采于濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院日照校區(qū)本草園，烘干，粉碎過(guò)40目篩備用；蘆丁對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)F20020428）；甲醇為色譜純（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 枸骨葉中蘆丁的提取

準(zhǔn)確稱取枸骨葉粉末100g，按要求加入一定量的提取溶劑，超聲波提取一定時(shí)間，抽濾，提取液用石油醚脫色3次，棄石油醚層，萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，用甲醇定容于250ml容量瓶中，作為待測(cè)液。

2.2 枸骨葉中蘆丁含量的測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取105℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品0.0107g，置于100ml容量瓶中，加甲醇適量溶解，定容，得0.107mg／ml的蘆丁溶液，待用。

2.2.2 樣品溶液的制備 精密量取“2.1”項(xiàng)中待測(cè)液1ml于250ml容量瓶中，甲醇定容，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過(guò)，即得樣品溶液。

2.2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的確定 分別取對(duì)照品溶液和樣品溶液，于200～600nm波長(zhǎng)之間掃描，結(jié)果表明，兩者均在356nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇356nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2.4 色譜條件 Kromasil C18柱（150mm× 4.6mm，5μm）；流動(dòng)相為甲醇－0.1%冰醋酸水溶液（45∶55）；柱溫：室溫（23℃）；流速：0.8ml／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：356nm；理論塔板數(shù)按蘆丁計(jì)算＞4000；保留時(shí)間為6.215min。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取對(duì)照品溶液0.0、1.0、2.0、4.0、5.0、6.0ml置于10ml容量瓶中，用甲醇定容。分別取20μl進(jìn)樣3次，記錄峰面積，以峰面積值（Y）對(duì)蘆丁的濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝15587X＋20055，r＝0.9999，表明蘆丁對(duì)照品在10.70～64.20μg／ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.6 樣品含量測(cè)定 取“2.2.2”項(xiàng)中樣品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣20μl，記錄峰面積，根據(jù)回歸方程計(jì)算，得各樣品蘆丁含量。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液各20μl，按前述色譜條件，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定結(jié)果RSD為0.78%。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同一份樣品溶液分別隔2h進(jìn)樣1次，在10h內(nèi)測(cè)定結(jié)果RSD為0.81%（n＝5），表明供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重現(xiàn)性試驗(yàn) 稱取同一批次藥材樣品，按樣品制備方法制備5份，測(cè)定結(jié)果RSD為1.87%。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知蘆丁含量的樣品溶液，分別精密加入蘆丁對(duì)照品溶液，配成低、中、高濃度各3份，在前述色譜條件下測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

圖1 蘆丁對(duì)照品及枸骨樣品高效液相色譜圖

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3 單因素試驗(yàn)

2.3.1 提取時(shí)間對(duì)枸骨葉中蘆丁提取量的影響準(zhǔn)確稱量枸骨葉粉末100g，分別加入8倍量90%乙醇超聲提取，提取時(shí)間分別為20、30、40、50、60min，3次，分別測(cè)定蘆丁含量，50min時(shí)提取含量最大。

2.3.2 乙醇濃度對(duì)枸骨葉中蘆丁提取量的影響準(zhǔn)確稱量枸骨葉粉末100g，分別加入8倍量的60%、70%、80%、90%的乙醇，超聲提取50min，3次，分別測(cè)定蘆丁含量，70%乙醇提取的蘆丁含量最大。

2.3.3 料液比對(duì)枸骨葉中蘆丁提取量的影響 準(zhǔn)確稱量枸骨葉粉末100g，分別加入8、10、12、16倍量70%乙醇超聲提取50min，3次，分別測(cè)定蘆丁含量，12倍量的乙醇所得蘆丁含量最大。

2.3.4 提取次數(shù)對(duì)枸骨葉中蘆丁提取量的影響準(zhǔn)確稱量枸骨葉粉末100g，分別加入12倍量70%乙醇超聲提取1次，2次，3次，4次，每次50min，分別測(cè)定蘆丁含量，提取2次所得蘆丁含量最大。

2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為系統(tǒng)考察超聲提取枸骨葉中蘆丁工藝參數(shù)，根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選用提取時(shí)間、乙醇濃度、料液比、提取次數(shù)作為考察因素，進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，選用L9（34）正交表，因素水平見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

按表3所列各工藝制備樣品，加乙醇后均浸泡1h后超聲提取，計(jì)算蘆丁提取量。正交試驗(yàn)結(jié)果和直觀分析見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。由分析結(jié)果可知影響枸骨葉中蘆丁提取率的主次因素依次為：乙醇濃度＞提取時(shí)間＞提取次數(shù) ＞料液比，其中提取時(shí)間和乙醇濃度有顯著影響，最佳提取工藝為A2B3C2D3。由于料液比對(duì)提取率影響很小，提取2次和3次結(jié)果差異很小。從節(jié)約成本角度出發(fā)，確定最佳提取工藝為A2B3CD2，即用10倍量的90%乙醇，超聲提取2次，每次50min。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果和直觀分析

表4 方差分析數(shù)據(jù)表

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取3批枸骨葉藥材，按照所得最佳提取條件進(jìn)行提取，所得蘆丁含量分別為1.83、1.97、1.68 mg／g，平均含量為1.83mg／g，高于正交試驗(yàn)中任何一組，表明所得提取工藝穩(wěn)定可行。

3 結(jié)論

本文通過(guò)正交試驗(yàn)法得出了枸骨葉中蘆丁的最佳超聲提取工藝，并采用高效液相色譜法建立了其含量測(cè)定方法。所得提取工藝簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可行，為枸骨葉藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的進(jìn)一步研究提供了快捷、經(jīng)濟(jì)、高效的提取手段；所建立的含量測(cè)定方法線性關(guān)系良好，重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，為枸骨葉的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典一部[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：233.

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