肉桂不同植物部位精油成分分析及抑菌活性研究

朱羽堯，錢(qián) 驊，張琪瑤，黃曉德，陳 斌，趙伯濤

(南京野生植物綜合利用研究院, 江蘇 南京 210042)

肉桂(Cinnamomumcassia)，為樟科樟屬植物，是重要的藥用和食用材料，主要分布于我國(guó)廣西、廣東等地。肉桂主要含有肉桂油、油樹(shù)脂、多糖、黃烷醇及其多聚體、倍單萜及其糖苷、二萜及其糖苷、無(wú)機(jī)離子等多種生理活性物質(zhì)[1]。其中，肉桂油是指從干燥肉桂皮中提取得到的揮發(fā)油，為黃色澄清液體，其中主要成分為肉桂醛，另有苯甲醛、肉桂醇、鄰甲氧基肉桂醛、香豆素等[2-4]。大量研究表明, 肉桂精油具有較強(qiáng)的抗菌活性, 不但可以有效抑制沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌等多種病原性微生物，而且對(duì)食品儲(chǔ)藏過(guò)程中的霉腐微生物的生長(zhǎng)起到抑制作用，從而達(dá)到防腐保鮮的目的[5-6]。目前，以肉桂、丁香等植物精油為基礎(chǔ)而開(kāi)發(fā)的天然綠色食品防腐保鮮劑得到了廣泛關(guān)注，大力開(kāi)發(fā)此類(lèi)植物源防腐保鮮劑是控制化學(xué)防腐劑或抗生素濫用，解決食品安全問(wèn)題的重要手段[7-8]。

目前對(duì)肉桂精油抑菌活性方面的研究多以桂皮為主要研究對(duì)象，對(duì)于其枝、葉、果等其他部位的研究相對(duì)較少，使得肉桂整體的資源利用度不高[9]。因此，本研究對(duì)肉桂不同植物部位所含精油進(jìn)行提取，并采用氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)測(cè)定各部位精油的化學(xué)組成。并在此基礎(chǔ)上，從抑菌圈、最低抑菌濃度和最低殺菌濃度這幾方面對(duì)各部位精油的抑菌效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，為了解肉桂各部位精油的成分差異及抑菌活性強(qiáng)弱提供依據(jù)，從而為肉桂資源的可持續(xù)利用提供科學(xué)途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

桂皮、桂枝、桂葉、果實(shí)、花萼均于2014年3月采自廣西省桂林市中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所，經(jīng)韋昆華副研究員鑒定為Cinnamomumcassia。采后晾曬24 h，裝袋，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)由中國(guó)藥科大學(xué)張劍教授提供。

1.2 儀器與試劑

Agilent 7820A氣相色譜串聯(lián)5975質(zhì)譜檢測(cè)儀，Agilent公司；DW-2型調(diào)溫電熱套，通州市張芝山鎮(zhèn)決心化工電器廠(chǎng)；UTP-313千分之一電子天平，上海花潮電器有限公司；752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司 752；BH2型顯微鏡，OLYMPUS公司；HZQ-F160振蕩培養(yǎng)箱，太倉(cāng)市華美生化儀器廠(chǎng)；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；紫外無(wú)菌操作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備廠(chǎng)；圓底燒瓶、量筒等玻璃儀器。

高純氦氣(99.999%)，南京上元工業(yè)氣體廠(chǎng)；二甲苯，南京化學(xué)試劑有限公司；二甲基亞砜，中國(guó)醫(yī)藥公司北京公司；營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 水分含量的測(cè)定

根據(jù)GB/T12729.6-2008(香辛料和調(diào)味品 水分含量的測(cè)定)中相關(guān)規(guī)定，采用二甲苯蒸餾法對(duì)各實(shí)驗(yàn)樣品中的水分含量進(jìn)行測(cè)定。水分含量的計(jì)算公式如下：

其中：W(%)—試樣的水分含量，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示(%)；m—試樣質(zhì)量，g；V—接收器中水的體積，mL；ρ—水的密度，1 g/mL。

1.3.2 肉桂各部位精油的提取

根據(jù)GB/T 30385-2013(香辛料和調(diào)味品揮發(fā)油含量測(cè)定)中相關(guān)規(guī)定，采用水蒸氣蒸餾法提取肉桂各部位的精油。分別稱(chēng)取一定量干燥桂皮、桂枝、桂葉、果實(shí)、花萼置于1 000 mL圓底燒瓶中，加入400 mL蒸餾水，在精油提取裝置中水相液面滴加1 mL二甲苯，恒溫蒸餾4 h后收集提取所得揮發(fā)油并保存，計(jì)算肉桂油得率并將各精油樣品進(jìn)行GC-MS分析。

其中：V0—測(cè)得的二甲苯體積，mL；V1—測(cè)得的二甲苯和揮發(fā)油的總體積，mL；M—試樣質(zhì)量，g；W(%)—試樣水分百分含量。

1.3.3 GC-MS檢測(cè)肉桂各部位精油化學(xué)成分組成

取1 μL精油直接進(jìn)行GC/MS 分析，色譜、質(zhì)譜條件[4]如下：

色譜柱：HP-5MS(30 m ×0.25 mm ×0.125 μm)，載氣為高純氦氣(99.999%)。進(jìn)樣口溫度：250 ℃；程序升溫:初始溫度50 ℃，先以5 ℃/min升至200 ℃后，保持1 min，再以10 ℃/min升至260 ℃，保持1 min。各組分的相對(duì)含量采用峰面積歸一化法進(jìn)行定量。

電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；接口溫度：280 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，質(zhì)量掃描范圍：33～600 m/z。獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過(guò)NIST 11質(zhì)譜圖庫(kù)進(jìn)行檢索。

1.3.4 抑菌圈測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用濾紙片法[8]測(cè)定肉桂不同部位精油的抑菌圈。取6 mm圓形濾紙片若干，置于潔凈干燥的培養(yǎng)皿內(nèi)，干熱滅菌后分別浸泡與各精油中。將配制好的107～108cfu/mL菌懸液震蕩均勻，用無(wú)菌移液槍吸取0.15 mL于平板表面，并涂布均勻，制成含菌平板。將浸泡過(guò)精油的濾紙片貼在含菌平板中央，每組各做3個(gè)平行樣，置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃下培養(yǎng)24 h。觀(guān)察抑菌情況，并測(cè)量抑菌圈直徑評(píng)價(jià)其抑菌效果。

1.3.5 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)測(cè)定[10]

配置精油濃度1.6%，二甲基亞砜(DMSO)濃度為2.0%的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。取無(wú)菌試管9支，并采用空白營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基倍比稀釋?zhuān)苽浜蜐舛确謩e為1.6%，0.8%，0.4%，0.2%，0.1%，0.05%，0.025%和0.0125%的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，同時(shí)以含2.0% DMSO的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。各檢測(cè)試管中加入200 μL 微生物濃度為106～107 cfu/mL的對(duì)數(shù)期菌液，并置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后取出觀(guān)察，未見(jiàn)明顯微生物生長(zhǎng)的最低精油濃度濃度即為該精油的MIC。確定了MIC后，將各試管中含精油的菌液采用空白培養(yǎng)基稀釋100倍，放入培養(yǎng)箱于37 °C培養(yǎng)48 h，未能觀(guān)察到微生物生長(zhǎng)的最低精油濃度即為MBC。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 肉桂不同部位中精油含量

表1 肉桂不同部位精油的得率

由表1可知,肉桂的不同植物部位中，桂皮的精油含量(1.74%±0.22%)，遠(yuǎn)高于其他部位?；ㄝ嗥浯?，其精油含量為0.88%±0.08%，桂枝和桂葉相對(duì)較低，而果實(shí)中幾乎不含精油。

2.2 肉桂不同部位精油化學(xué)成分組成分析

桂皮、桂枝、桂葉、花萼精油的總離子流圖見(jiàn)圖1～4。通過(guò)NIST 2011標(biāo)準(zhǔn)化合物質(zhì)譜庫(kù)進(jìn)行匹配，并結(jié)合化合物的保留時(shí)間，對(duì)揮發(fā)油中的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，并采用面積歸一法計(jì)算其相對(duì)含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 桂皮精油的總離子流量圖

圖2 桂葉精油的總離子流量圖

圖3 桂枝精油的總離子流量圖

圖4 花萼精油的總離子流量圖

由表2可知，從桂皮中共檢測(cè)出了23個(gè)組分，鑒定了匹配度在80%以上的17種化合物，占總相對(duì)含量的96.47%，主要成分是反式肉桂醛(53.71%)、鄰甲氧基肉桂醛(36.66%)占總相對(duì)含量的91.61%。從桂葉中檢測(cè)出了31個(gè)組分，鑒定了匹配度在80%以上的25種化合物，占總相對(duì)含量的95.09%，主要成分是反式肉桂醛(51.85%)、鄰甲氧基肉桂醛(22.69%)、1-苯基-2-硝基丙烯(10.24%)，占總相對(duì)含量的86.40%。從桂枝中檢測(cè)出了29個(gè)組分，鑒定了匹配度在80%以上的23種化合物，占總相對(duì)含量的98.22%，主要成分是反式肉桂醛(80.05%)、鄰甲氧基肉桂醛(6.08%)、肉桂醛(2.13%)，占總相對(duì)含量的88.26%。從桂葉中檢測(cè)出了32個(gè)組分，鑒定了匹配度在80%以上的25種化合物，占總相對(duì)含量的99.43%，主要成分是反式肉桂醛(87.68%)、鄰甲氧基肉桂醛(2.67%)、肉桂醛(2.35%)，占總相對(duì)含量的92.7%。

從化學(xué)成分組成可以看出，桂皮與桂葉的化學(xué)組成與桂枝和花萼有明顯區(qū)別，主要體現(xiàn)在其中鄰甲氧基肉桂醛的含量。萼片中鄰甲氧基肉桂醛的含量?jī)H為2.67%，而在桂皮中含量為36.66%，超過(guò)前者10倍以上。桂葉中1-苯基-2-硝基丙烯的含量為10.24%，遠(yuǎn)高于其他三種部位。此外，通過(guò)結(jié)合精油得率以及肉桂醛的相對(duì)含量可以發(fā)現(xiàn)，四種植物部位中肉桂醛絕對(duì)含量分別為0.93%(桂皮)> 0.77%(花萼)> 0.48%(桂枝)> 0.25%(桂葉)。雖然桂皮中反式肉桂醛的絕對(duì)含量最高，但若以制備高品質(zhì)反式肉桂醛的肉桂精油為目的，桂皮并不是最佳選擇材料。首先其中鄰甲氧基肉桂醛含量偏高，將影響產(chǎn)品的品質(zhì)；其次，桂皮的采收對(duì)資源的可持續(xù)利用帶來(lái)的負(fù)面影響遠(yuǎn)高于桂枝等材料部位；此外從產(chǎn)量的角度來(lái)看，桂皮的產(chǎn)量也遠(yuǎn)低于桂枝。因此，綜合產(chǎn)品質(zhì)量以及資源的可持續(xù)利用角度的分析，桂枝是大規(guī)模生產(chǎn)高品質(zhì)肉桂精油的最佳材料。

表2 肉桂各部位精油化學(xué)成分組成

2.3 抑菌圈法檢測(cè)肉桂各部位精油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌抑菌效果

表3 肉桂各部位精油對(duì)大腸桿菌抑菌圈直徑(mm)

精油抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)是：抑菌圈直徑>20 mm 為極度敏感、15～20 mm 為高度敏感，10～15 mm 時(shí)為中度敏感，7～9 mm 時(shí)為低度敏感，<7 mm為不敏感[10]。

抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示，并參照以上標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)價(jià)后發(fā)現(xiàn)，肉桂各部位精油精油對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑均大于20 mm，屬于極度敏感。大腸桿菌對(duì)桂皮、桂枝以及花萼精油極其敏感，抑菌圈直徑均為30 mm左右。以金黃色葡萄球菌為研究對(duì)象發(fā)現(xiàn)，桂枝與花萼所提取的精油抑制效果最好，抑菌圈直徑分別達(dá)到33.7 mm±1.2 mm和32.3 mm±1.5 mm。而桂皮精油的抑菌圈直徑為26.3 mm±0.6 mm，雖然同樣顯示出顯著抑菌活性，但相對(duì)于桂枝精油而言其抑菌效果僅為78.1%。

圖5 桂枝精油對(duì)大腸桿菌(1)和金黃色葡萄球菌(2)的抑菌圈

2.4 肉桂精油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)

肉桂各植物部位精油均能在較低濃度范圍內(nèi)對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌起到良好的抑制作用。桂皮、桂枝和花萼對(duì)于大腸桿菌的MIC為0.05%，花萼中提取的精油擁有最低的MBC為0.05%。對(duì)金黃色葡萄球菌而言，桂枝及花萼中提取所得精油的MIC和MBC均為0.025%，低于桂皮和桂葉。

表4 肉桂各部位精油對(duì)E.coli和S.aureus的MIC和MBC(%)

結(jié)合反映肉桂精油抑菌效果的抑菌圈、MIC和MBC實(shí)驗(yàn)結(jié)果與各部位精油化學(xué)成分組成共同分析可以發(fā)現(xiàn)，抑菌效果的強(qiáng)弱與精油中肉桂醛的含量具有相關(guān)性。在肉桂醛含量上，桂皮和桂葉中明顯低于桂枝和花萼；而相應(yīng)的桂皮和桂葉的抑菌圈大小、MIC和MBC均弱于桂枝和花萼。

3 結(jié) 論

本研究對(duì)肉桂的桂皮、桂枝、桂葉、花萼以及果實(shí)這幾個(gè)部位中精油的含量及化學(xué)組成進(jìn)行檢測(cè)分析，并進(jìn)一步通過(guò)抑菌圈、MIC和MBC實(shí)驗(yàn)對(duì)各部位精油抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，五種植物部位中，除果實(shí)外均富含精油，其中以桂皮中精油含量最高為1.74%。值得注意的是，各部位精油的化學(xué)組成存在顯著差別。桂枝和花萼提取所得精油中，反式肉桂醛的含量達(dá)80%以上，而桂皮和桂葉中僅為50%左右。抑菌結(jié)果表明，這些成分組成上的差異與相應(yīng)精油的抑菌活性存在直接相關(guān)性。反式肉桂醛含量較高的桂枝和花萼提取所得精油體現(xiàn)出的抑菌效果明顯優(yōu)于桂皮和桂葉提取所得精油。由此可見(jiàn)，反式肉桂醛是肉桂精油中發(fā)揮最主要抑菌活性的成分，其含量的高低與精油的抑菌效果直接相關(guān)。因此，若以生產(chǎn)制備高含量反式肉桂醛的肉桂精油為目的，相比之下桂枝由于其所含精油中反式肉桂醛含量高，并且綜合考慮充足材料來(lái)源和資源的可持續(xù)利用，將成為最佳生產(chǎn)原料。

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