天然抗癌藥物紫杉醇的研究進展

吳秀蘭，賈 艷，朱 波，周 杰

(正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，江蘇 南京 210023)

1 紫杉醇介紹

紫杉醇(Paclitaxel，商品名Taxol) 被用于治療卵巢癌、乳腺癌、肺癌以及Kaposi’s 肉瘤的治療，同時也在研究與其他抗癌藥物聯(lián)用的治療方法，是獲得FDA批準的第一個來自天然植物的化學藥物[1]。最初，紫杉醇是從短葉紫杉(Taxusbrevifolia)的樹皮中分離獲得，這種紫杉主要分布在北美西北太平洋區(qū)域從北加拿大到阿拉斯加的原生森林中。

短葉紫杉生長極其緩慢且不易繁殖，一棵直徑22 cm、高度9 m的樹大約有125年樹齡，其樹皮極薄，只有大約0.3～0.6 cm厚，這樣的一棵樹可以得到大約2 kg樹皮。紫杉醇必須從新鮮砍伐剝?nèi)〉臉淦ぶ刑崛?。從砍伐樹木，收集紫杉樹皮到分離萃取出紫杉醇，消耗極大的人力物力財力。30噸干樹皮可以得到大約100 g紫杉醇，花費大約150萬美元。因為紫杉醇極難得到，所以在研究初期對紫杉醇的研究進度也極其緩慢。因此從植物中提取紫杉醇代價太高，而且會對生態(tài)環(huán)境造成破壞。迄今為止已經(jīng)探索出化學半合成法、化學全合成法、植物細胞培養(yǎng)或內(nèi)生菌培養(yǎng)等多種方法獲得紫杉醇[1-3]。

2 紫杉醇的理化性質(zhì)

紫杉醇為白色結晶性粉末，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮等有機溶劑。紫杉醇(C47H51NO14)(圖1)基本骨架為三環(huán)二萜，具有高度官能團化的6-8-6-4四環(huán)結構和一個異絲氨酸側鏈[4]。紫杉醇具有11個手性中心，其合成方法往往被化學家們公認為最具挑戰(zhàn)性的任務之一。

圖1 紫杉醇結構式

3 紫杉醇的來源

3.1 從植物中提取

紫杉醇最早在1966年被提取出來，當時主管北卡“研究三角學院”(research triangle institute，RTI)分餾實驗室的化學家華爾(Monroe Wall)的研究小組采用400 根試管的逆流分配色譜法，從12 kg太平洋短葉紅豆杉樹皮中提取0.5 g紫杉醇，共歷時2年，這種工藝十分繁瑣，而且效率極低[5]。隨著研究的不斷深入，提取分離方法也在不斷改進。目前比較成熟的方法為有機溶劑萃取法、固相萃取法和超臨界流體萃取法。有機溶劑主要采用乙醇、甲醇或甲醇和二氯甲烷混合溶劑提取，提取效率高，方法簡單，能耗少。Mattina等人[6]利用Empore固相萃取盤對甲醇粗提物進行提取，紫杉醇回收率為115.8%。近年來，超臨界流體技術也被應用到紫杉醇的分離純化過程中。Jennings等人[7]發(fā)現(xiàn)以乙醇為修飾劑的超臨界CO2流體可以快速地從太平洋紅豆杉樹皮中提取出紫杉醇，收率較高。

3.2 化學全合成

由于紫杉醇具有復雜的手性中心，化學全合成方法的尋找成為了化學家們所面臨的一個挑戰(zhàn)。迄今為止已經(jīng)有6個比較成熟的全合成方法。1997年，美國斯坦福大學Wender教授領導的研究小組完成了紫杉醇的第4條合成路線。Wender以馬鞭烯酮為起始物，并采用直線法的合成戰(zhàn)略。馬鞭烯酮是大量存在于松樹中的蒎烯在空氣中的氧化產(chǎn)物，該化合物包括了紫杉醇20個骨架碳中的10個[8]。具體地說，包括了A環(huán)的6個骨架碳和B環(huán)關鍵的骨架碳。路線最顯著的特點在于通過分子內(nèi)的aldol反應完成了C環(huán)的構建，另外值得一提的是，Wender的路線是目前公開報道的較短的紫杉醇全合成路線。

1998年，日本的Kuwajima教授領導的研究小組公布了他們完成的紫杉醇合成路線。隨后2000年他們又發(fā)布了在原合成路線上進行改進的路線，Kuwajima小組[9,10]采用的是匯聚式合成策略，分別合成A環(huán)片段和C環(huán)片段，隨后，A環(huán)片段與C環(huán)片段連接構建關鍵中間體，并在此基礎上完成環(huán)系上手性中心及官能團的構建，其中19位甲基立體選擇性引入以及C3位手性中心的構建頗具特色。

同樣在1998年，日本東京大學的Mukaiyama教授領導的研究小組完成了一條采用直線-匯聚聯(lián)合策略的全合成路線，依次合成B環(huán)、BC環(huán)、ABC環(huán)、ABCD環(huán)[11]。路線中，通過不對稱的aldol反應合成線性前體，再通過分子內(nèi)的aldol環(huán)合構建八元環(huán)的反應很有特點。

3.3 半合成

所謂半合成，就是從可以再生的植物枝葉中提取本身并無活性的紫衫烷二萜類成分，并以之作為前體半合成紫杉醇，這也是緩解紫杉醇供應危機的可行手段之一。研究最多的是以巴卡亭III漿果赤霉素(baccatinIII)(圖2)和10-去乙?；涂ㄍII(10-脫乙?；鶟{果赤霉素III,10-deacetybaccatinIII)為原料，通過選擇性保護部分羥基，然后在C13羥基上接上合成側鏈，再去掉保護基團得到紫杉醇[12]。從目前看來，半合成是最具有實用價值的制備方法，并且通過半合成研究可以獲得有關紫杉醇類似物構效關系的信息，對紫杉醇進行結構改性以尋找活性更大、毒副作用小、抗癌譜有所不同或更廣的抗癌藥物。

圖2 巴卡亭III

3.4 離體培養(yǎng)法

利用離體培養(yǎng)的紅豆杉細胞或發(fā)根生產(chǎn)紫杉醇及其合成前體是紫杉醇來源的又一重要途徑，它具有無污染、不破壞自然資源及不受自然條件的限制等優(yōu)點。1989年，美國Christen等通過對太平洋紅豆杉細胞培養(yǎng)生產(chǎn)出紫衫醇[13-14]。隨后，日本、德國和韓國等也先后報道可以用細胞培養(yǎng)的方法產(chǎn)生高含量的紫杉醇。華東理工大學生物工程系對紅豆杉細胞懸浮培養(yǎng)的細胞生長、蛋白質(zhì)代謝、底物消耗及紫杉醇合成動力學進行了全面研究，在100L生物反應器中培養(yǎng)出紅豆杉細胞，生長周期為20天左右紫杉醇含量達細胞干重的0.1%，比樹皮中含量高10倍。梅興國等還研究了兩相培養(yǎng)系統(tǒng)中紅豆杉細胞的生長與代謝規(guī)律，經(jīng)過40天的培養(yǎng)，細胞生物量為17.85 g/L(干重)，紫杉醇的產(chǎn)量為30.19 mg/L[15]。這些研究為紅豆杉懸浮細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎。

離體培養(yǎng)的另一途徑是用發(fā)根土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogens)轉化紅豆杉細胞，誘導出發(fā)根，然后大量培養(yǎng)發(fā)根，再從發(fā)根中提取紫杉醇。由于發(fā)根生長速率快、遺傳穩(wěn)定以及具有正常根的分化結構穩(wěn)定的特點，發(fā)根大量培養(yǎng)很可能成為生產(chǎn)紫杉醇的有效途徑。盛長忠等利用土壤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)對東北紅豆杉(Taxuscuspidate)不同外植體和不同生長期的愈傷組織進行了感染，結果表明，20 d的愈傷組織對該菌比較敏感，感染時間為5 min時，冠癭誘導率較高(15.0%)，對在無激素B5培養(yǎng)基中得到的白色松軟的冠癭組織分析檢測發(fā)現(xiàn)，有特異的胭脂堿(nopaline)存在，并具有產(chǎn)生紫杉醇的能力[16]。

3.5 內(nèi)生菌法

Stierle等人[17]與1993年在Science上報道了通過紫杉樹上分離出來的內(nèi)生植物真菌(Taxomycesandreanae)來生產(chǎn)紫杉醇和相關的紫杉烷的研究結果，其紫杉醇的產(chǎn)量可達24～25 ng/L。研究人員通過大量的實驗證明了所產(chǎn)生的化合物為紫杉醇，并且是由真菌生成的，并不是由植物或?qū)嶒灜h(huán)境帶入的。其中一個最有力的證據(jù)是用放射性乙酸鹽進行飼喂實驗，利用二維色譜檢測產(chǎn)物的放射性斑點，與紫杉醇完全一致。隨后，他們又從西藏紅豆杉細枝中分離到一株內(nèi)生真菌—小孢擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsismicrospora)，其發(fā)酵水平又比Taxomycesandreanae略高。因此推測，這可能是真菌偶然得到了一個紫杉樹生物合成紫杉醇的基因造成的。此發(fā)現(xiàn)具有重大的科學意義和潛在的商業(yè)價值，但因表達量仍偏低，近期不可能實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)。

3.6 微生物轉化法

利用生物酶類的高度選擇性將紫杉醇結構類似的一些紫杉烷類化合物轉化成紫杉醇的半合成前體，這樣簡化了分離過程并大大地提高了資源的利用率，為解決紫杉醇來源問題提供了一個很好的方法和思路。目前，紫杉醇類似物之間基因修飾以獲得更高活性的新化合物應是一個更廣闊的應用領域，近年來以紫杉烷類化合物為底物進行生物轉化的研究獲得了不少有意義的結果。

4 紫杉醇的生物合成途徑

紫杉醇的生物合成途徑目前已基本明了，其生物合成途徑中多種酶的基因已經(jīng)成功克隆。因此，隨著生物技術的不斷發(fā)展，通過微生物及酶法實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)紫杉醇及其類似物終將實現(xiàn)。

紫杉醇的生物合成途徑大致分為3個主要階段：①紫杉醇骨架的生物合成；②苯基異絲氨酸側鏈的生物合成；③紫杉烷骨架和側鏈的酯化反應，最終形成完整的紫杉醇分子。

4.1 紫杉醇骨架的生物合成

紫杉醇是萜類物質(zhì)，根據(jù)生物次生代謝中酸類化合物的生源途徑，紫杉醇的三環(huán)二萜骨架應由乙酰CoA開始，經(jīng)某種代謝路徑合成牻牛兒焦磷酸酯(geranyl geranyl diphosphate，GGPP)，再由GGPP環(huán)化形成碳環(huán)骨架，然后經(jīng)一系列官能團化反應，最終形成紫杉醇[18]。

⑴ GGPP的生物合成。GGPP(圖3)是二萜類化合物生物合成的共同前體，它是經(jīng)焦磷酸異戊烯酯(isopentenyl dilphosphate，IPP)(圖4)轉變而來。關于GGPP的合成途徑目前存在兩種爭論。

圖3 GGPP 圖4 IPP

①甲羥戊酸途徑。由3個乙酰輔酶A(乙酰CoA)縮合生成3-羥基-3-甲基-戊二單酰輔酶A(HMG-CoA)，隨后，在HMG-CoA還原酶(HMGR)的作用下，產(chǎn)生甲羥戊酸(MVA)。MVA再經(jīng)焦磷酸化及脫羧脫水作用，形成C5的焦磷酸異戊烯酯(IPP)[19]，見圖5。

圖5 甲羥戊酸途徑

②3-磷酸甘油醛/丙酮酸途徑。Eisenreich等[20]利用核磁共振技術發(fā)現(xiàn)紫杉醇骨架結構的合成可能存在類似于真菌中的途徑。這一途徑與甲羥戊酸途徑最大的不同之處就是所處的亞細胞位點不同，甲羥戊酸途徑位于細胞質(zhì)中，而3-磷酸甘油醛/丙酮酸途徑位于質(zhì)體中，兩條途徑作用的酶也有著重要區(qū)別，見圖6。

圖6 3-磷酸甘油醛-丙酮酸途徑

⑵ 紫杉烷碳環(huán)骨架的生物合成。紫杉醇生物合成中第一步重要的反應是雙烯前體GGPP環(huán)化形成紫杉-4(20)，11(12)-二烯(圖7)。1995年，Ccroteau R等[21]將標記的GGPP加入到紫杉莖提取液中，進行放射化學方面的分離，通過二維NMR光譜證實，GGPP環(huán)化形成紫杉-4(5)，11(12)-二烯[taxa-4(5)，11(12)-diene](圖8)。該反應是在紫杉二烯環(huán)化酶的作用下完成的，隨后此二烯萜中間體進行不同程度的官能化，最后形成紫杉醇。

圖7 紫杉-4(20)，11(12)-二烯

圖8 紫杉-4(5)，11(12)-二烯

⑶ 紫杉烷碳環(huán)骨架的官能化反應?，F(xiàn)知的第一步官能化反應是紫杉二烯的C5在細胞色素P450介導下的羥基化，形成紫杉-4(20)，11(12)-二烯-5α-醇[taxa-4(20)，11(12)-dien-5α-ol][22]，隨后是?；又荂10位的羥基化，之后是一系列的細胞色素P450介導的羥基化和依賴于乙酰CoA的乙?；磻?，最后形成紫杉醇碳環(huán)骨架。

4.2 紫杉醇側鏈的生物合成

苯丙氨酸是紫杉醇側鏈合成的前體物質(zhì)，F(xiàn)leming等人[23-24]對苯丙氨酸的反應順序進行了系統(tǒng)的研究。他們發(fā)現(xiàn)紫杉醇的側鏈是由苯丙氨酸在氨基變位酶的作用下形成β苯丙氨酸，隨后C2位發(fā)生羥基化反應生成苯基異絲氨酸，最后經(jīng)過NH2基的?；纬傻?。其苯甲酰部分與巴卡亭III結合生成去苯甲?；仙即?，進而合成紫杉醇。

5 對紫杉醇研究的展望

由于全球環(huán)境的不斷惡化，癌癥的發(fā)病率越來越高，治療癌癥病人所消耗的紫杉醇將會越來越多?，F(xiàn)階段還無法大規(guī)模生產(chǎn)紫杉醇，導致紫杉醇價格昂貴，大多數(shù)病人無法支付其高昂的費用。如何將紫杉醇應用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)將會成為研究的重點領域，讓紫杉醇更好地造福全人類，戰(zhàn)勝腫瘤，促進人類健康事業(yè)的發(fā)展。

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