溫針灸百會穴和神門穴對癲癇大鼠細胞凋亡因子P53的影響*

何清溪，馬冰宇，蘇 欣，程為平

(1．黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱150040;2．黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江哈爾濱150040)

本研究通過溫針灸百會、神門穴對點燃癲癇大鼠模型進行治療，觀察探討溫針灸百會、神門穴對癲癇大鼠細胞凋亡因子P53含量變化的影響，從而闡明溫針灸百會、神門穴的抗癲癇作用及對腦保護的意義，進而完善溫針灸治療癲癇的方法。

1 材料和方法

1．1 實驗動物

應實驗要求采用成年健康雄性SD大鼠36只，體重(200±15)g。

1．2 實驗環(huán)境

室溫(23．00 ±4．78)℃，濕度(12．30 ±4．06)%的房間。

1．3 實驗藥品與儀器

毫針(規(guī)格32號，蘇州醫(yī)療用品廠)，艾條(由南陽市臥龍漢醫(yī)艾絨廠提供)，戊四氮(由sigma公司生產(chǎn))，多聚甲醛(北京益利精細化學品公司生產(chǎn))，BCL－2、BAX、P53免疫組化試劑(由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn))。

1．4 癲癇模型的制備

癲癇模型制備使用隨機抽取30只大鼠，腹腔注射閾下劑量 PTZ(戊四氮)35．0 mg/kg，每天1次，注射20～29天時達點燃標準，注射后觀察30～50 min，根據(jù)大鼠癲癇發(fā)作的行為表現(xiàn)，參照Racine［1］的6級評分標準:0級:無任何反應;Ⅰ級:面部抽搐及咀嚼;Ⅱ級:點頭和(或)甩頭;Ⅲ級:前肢陣攣，但無直立位;Ⅳ級:前肢陣攣伴伸直;Ⅴ級:前肢及全身陣攣，失去平衡，跌倒。Ⅰ至Ⅲ級為輕型發(fā)作，Ⅳ級以上為重型發(fā)作。點燃標準:大鼠連續(xù)5次腹腔注射PTZ，均表現(xiàn)為Ⅳ級以上發(fā)作。

其余6只按10 ml/kg腹腔注射0．9%的生理鹽水。

1．5 分組

造模成功后將大鼠隨機分為6組:溫針灸10天組6只，溫針灸20天組6只，針刺10天組6只，針刺20天組6只，模型組6只，空白組6只。

1．6 治療方法

大鼠穴位根據(jù)《實驗針灸學》中大鼠常見針灸穴位定位。百會穴定位:頂骨正中，皮下有第3、第4頸脊神經(jīng)分支、枕小神經(jīng)及頸外動脈、靜脈分支分布。神門穴定位:前肢內(nèi)側(cè)腕部橫紋尺骨邊緣皮下有腕尺側(cè)屈肌，有尺動脈、尺靜脈及尺神經(jīng)掌支分布。直刺1 mm［2］。

治療時間為大鼠處于癲癇發(fā)作間歇期時，分別將各組的大鼠捆縛于鼠板上，待大鼠固定安靜后，溫針灸組選取百會穴和雙側(cè)神門穴，毫針針刺穴位，持艾條于穴位上方2～3 cm處懸灸，采用溫和灸法，得氣為大鼠出現(xiàn)疼痛及抽搐反應，每穴每次15 min。針刺組同樣固定后，僅針刺穴位每穴留針15 min。各治療組于造模后第2天開始治療，每日1次，10天組治療連續(xù)10天后停止，20天組連續(xù)治療20天。模型組、空白組不給予任何治療。

1．7 免疫組化法測定大腦海馬回中P53的含量

治療結束后分別將空白組、針刺組及溫針灸組的大鼠麻醉，開胸暴露心臟，心尖插入灌注針頭，剪開右心耳，注入生理鹽水200 ml，沖出血液后緩慢灌注4%多聚甲醛200 ml固定，大鼠內(nèi)臟僵硬后剪下頭部取腦，制成腦切片，采用免疫組化法測定海馬回中P53的含量。

1．8 統(tǒng)計學處理

各組數(shù)據(jù)均應用SPSS17．0軟件處理，組間比較采用t檢驗，結果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。

2 結果

2．1 治療后大鼠大腦海馬回腦切片中P53水平的變化

模型組與空白組大鼠大腦海馬回腦切片中的P53相比有顯著性改變，經(jīng)檢驗有統(tǒng)計學意義(P＜0．01)，見表1，提示癲癇大鼠造模成功。

溫針灸10天組、20天組分別與模型組大鼠大腦海馬回腦切片中P53水平比較有顯著性改變，經(jīng)檢驗有統(tǒng)計學意義(P＜0．01)，見表1，提示溫針灸組對P53水平有影響，即溫針灸百會及雙側(cè)神門穴可以改善癲癇大鼠大腦海馬回腦切片中P53水平。

針刺組與模型組大鼠大腦海馬回腦切片中P53比較有顯著性改變，經(jīng)檢驗有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，見表1，提示針刺組對P53水平有影響，即針刺百會及雙側(cè)神門穴可以改善癲癇大鼠大腦海馬回腦切片中P53水平。

溫針灸組與針刺組大鼠大腦海馬回腦切片中P53水平顯著性改變，經(jīng)檢驗有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，見表1，提示溫針灸組優(yōu)于針刺組。

表1 各組大鼠海馬P53陽性細胞平均灰度值(±s)

表1 各組大鼠海馬P53陽性細胞平均灰度值(±s)

注:與模型組比較，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01。

P53空白組 6 174．00 ±7．34組別 n＊＊模型組 6 144．16 ±7．54針刺10天組 6 157．66±13．35*針刺20天組 6 158．16±14．04*溫針灸10 天組 6 165．33±6．62＊＊溫針灸20 天組 6 173．33±4．88＊＊

2．2 不同時間點各參數(shù)的變化

治療方法相同而治療時間不同的各組間比較，溫針灸10天和溫針灸20天，針刺10天和針刺20天的兩兩比較，均無顯著性差異(P＞0．05)，無統(tǒng)計學意義。提示溫針灸及針刺百會及神門穴對癲癇大鼠海馬P53含量的影響作用在治療10天后作用減弱，趨于穩(wěn)定。

2．3 實驗大鼠的行為學改變

實驗過程中大鼠行為學改變:存活大鼠中，所有空白組大鼠均無癇性發(fā)作。其余點燃成功并存活的大鼠，隨著PTZ注射次數(shù)增加而發(fā)作級別逐漸升高，最后出現(xiàn)全身強直－陣攣發(fā)作。模型點燃成功后停止刺激5～7天，再次給予PTZ刺激，仍可出現(xiàn)4級以上發(fā)作，此即是為模型點燃成功的表現(xiàn)。在給予溫針灸及針刺治療后，溫針灸組大鼠的發(fā)作次數(shù)均較模型組減少，發(fā)作級別也較治療前有所下降，模型組幾乎每日仍可見3級以上發(fā)作。提示溫針灸對PTZ致癇大鼠行為改善有顯著影響。

3 討論

癲癇發(fā)作后神經(jīng)細胞凋亡受多種基因的調(diào)控。野生型P53基因是其存在于細胞內(nèi)的正常狀態(tài)，具有轉(zhuǎn)錄因子的功能;作為某些抑制細胞增殖基因的反式激活因子對細胞分裂進行負調(diào)控;同時它監(jiān)視著細胞基因的完整性，抑制細胞周期推進或誘導細胞凋亡［3］。當DNA損傷時表達產(chǎn)物增加，抑制細胞周期運轉(zhuǎn)，導致凋亡細胞解體［4］。P53基因連接于BAX啟動子上，導致 Bax/Bcl－2比例增大，加強凋亡［5］。KA(Kainic acid，紅藻氨酸)致癇大鼠海馬細胞中BCL－2在癲癇發(fā)作6 h以內(nèi)明顯升高，這種變化可能對損傷和凋亡細胞有保護作用。隨著P53表達的升高，BCL－2呈現(xiàn)下降趨勢。

中醫(yī)學認為癲癇為腦神被擾、神明失司的發(fā)作性疾病，間歇期酌情選用針灸治神之方，即督脈的神庭，心經(jīng)的神門，督脈的神道、至陽，揚刺百會從而腦神得安，神明有司，而癇去體安［6］?！夺樉募滓医?jīng)》中則提出了“治之，補其不足，瀉其有余，調(diào)其虛實，以通其道，而去其邪”，調(diào)補臟腑陰陽的虛實，平衡陰陽，以使神志正常［7］。

百會穴居巔頂部，為百脈之宗，具有益氣升陽、填髓充腦、開竅醒腦的作用。神門穴位于掌后銳骨端凹陷中，可輸布“原氣”，濡養(yǎng)心神。百會穴與神門穴配伍可有提達陽氣、開竅醒腦、益智寧神之效。

本研究表明溫針灸組癲癇樣發(fā)作等級明顯降低。空白組與模型組、模型組與溫針灸組相比較大腦海馬回腦切片P53含量均有顯著改變，溫針灸組與針刺組相比P53水平顯著改變。證明戊四氮致癇大鼠的機制與P53有相關性，溫針灸百會及雙側(cè)神門穴可以改善癲癇大鼠細胞凋亡因子P53水平，溫針灸百會及雙側(cè)神門穴對治療癲癇大鼠有意義。其機制可能與細胞凋亡因子P53改變有關。但是細胞因子機制十分復雜，細胞凋亡因子對癲癇的影響是多方面的，同時不排除實驗誤差導致的改變，值得進一步研究。

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［2］ 李忠仁．實驗針灸學［M］．北京:中國中醫(yī)藥出版社，2003:327－329

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［4］ Erster S，Mihara M，Kim RH，et al．In vivo mitochondrial p53 translocation triggers a rapid first wave of cell death in response to DNA damage that can precede p53 target gene activation［J］．Molecular and cellular biology，2004，24(15):6728 －6741

［5］ Sloviter RS．Possible functional consequences of synaptic reorganization in the dentate gyrus of kainate － treated rats［J］．Neuroscience letters，1992，137(1):91 －96

［6］ 程光宇．《內(nèi)經(jīng)》針灸治癇心悟［J］．針灸臨床雜志，2012，28(5):6－7

［7］ 馬艷春，周波，宋立群，等．《針灸甲乙經(jīng)》學術思想及針灸治療癲癇的探究［J］．針灸臨床雜志，2011，27(12):42 －44