益心舒膠囊對(duì)阿霉素致心力衰竭大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

沈啟明，馬麗紅，王少霞，李 楊，張瑞華

心力衰竭（HF）是各種心臟疾患的終末狀態(tài)，也是心臟病患者死亡的主要原因。僅2008年在美國(guó)，HF的直接或間接治療費(fèi)用大約為350億美元［1］。抑制心肌細(xì)胞凋亡能減輕心臟重構(gòu)和衰竭的程度［2，3］。益心舒膠囊具有益氣復(fù)脈、活血化瘀、養(yǎng)陰生津的功效，臨床研究表明［4］，益心舒膠囊不僅能擴(kuò)血管，改善心肌血液供應(yīng)和心肌代謝的作用，而且還有增強(qiáng)心肌收縮力和改善左心功能的療效。為進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)對(duì)阿霉素（ADR）致HF大鼠模型進(jìn)行藥物干預(yù)，探討益心舒膠囊對(duì)HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 健康雄性SD大鼠48只，清潔級(jí)，體重（200±20）g，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK-（軍2007-004）。用隨機(jī)數(shù)表法將48只大鼠隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組、模型組、益心舒組及厄貝沙坦組，每組12只。

1.2 藥物及試劑 ADR：深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司（產(chǎn)品批號(hào)：1103E2，10 mg／瓶）。益心舒膠囊：貴州信邦制藥股份有限公司提供（產(chǎn)品批號(hào)：20120107）。厄貝沙坦（irbesartan，Irb）：杭州賽諾菲安萬(wàn)特民生制藥有限公司（批號(hào)：1A255，規(guī)格：0.15 g）。原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記（TUNEL）試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司；DAB顯色劑：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；鼠抗Bcl-2 IgG及鼠抗Bax IgG：美國(guó)Santa Cruz公司生產(chǎn)。其他化學(xué)分析試劑均為分析純。

1.3 儀器設(shè)備 RM2135病理切片機(jī)（德國(guó)Leica）；CMIAS-Ⅱ圖像分析儀（北京航空航天大學(xué)圖像中心）；80-2電動(dòng)離心機(jī)（金壇高科儀器廠）。

1.4 方法

1.4.1 模型建立 將注射用ADR用生理鹽水配成2 mg／m L溶液，參照周巖等［5］方法建立，36只造模大鼠均腹腔注射ADR 2.5 mg／kg，每周一次，持續(xù)6周，復(fù)制大鼠HF模型；另12只正常組大鼠腹腔注射等量的生理鹽水。模型成功判定標(biāo)準(zhǔn)：病理學(xué)觀察，6周時(shí)造模各組隨機(jī)選取其中1只做病理檢測(cè)以確定模型是否成功。光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織。超聲心動(dòng)圖檢查，于第6周末對(duì)模型組及正常對(duì)照組大鼠用水合氯醛麻醉后行超聲心動(dòng)圖檢查，記錄大鼠左室舒張期末徑（LVEDD）、收縮期末徑（LVESD）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）及左室短軸縮短率（FS），正常組與模型組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合病理學(xué)觀察和超聲心動(dòng)圖檢查結(jié)果，判定模型取得了成功。

1.4.2 給藥 從大鼠注射ADR第6周開(kāi)始灌胃給藥。益心舒組：將益心舒除去外層膠囊用蒸餾水配成混懸液，按人與大鼠體表面積折算為大鼠灌胃劑量，相當(dāng)于臨床成人的正常劑量，為320 mg／（kg·d）；厄貝沙坦組劑量也折算為相應(yīng)的成人正常劑量，為50 mg／（kg·d）；正常組和模型組大鼠予以與益心舒組等量生理鹽水，每天上午灌胃一次，連續(xù)給藥28 d。

1.4.3 指標(biāo)檢測(cè) 末次給藥后禁食水12 h，以5%水合氯醛按4 ml／kg麻醉后稱重，取左室心肌部分綠豆大小組織浸泡于10%甲醛溶液中留待做病理檢查。光鏡下（10×20）進(jìn)行病理學(xué)觀察。心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)。心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白檢測(cè)，采用免疫組化法結(jié)合圖像分析半定量測(cè)定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，組間比較采用單因素方差分析法，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)法。以P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 造模過(guò)程中正常組大鼠毛色有光澤，行動(dòng)敏捷，對(duì)周圍變化反應(yīng)靈敏；其余組大鼠逐漸出現(xiàn)毛色枯槁、散亂豎起，脫毛，懶動(dòng)，少食，腹瀉，口唇紫紺等癥狀體征，體重逐漸下降，第4周開(kāi)始部分大鼠出現(xiàn)腹水和死亡，其中模型組死亡1只，益心舒組死亡1只，到第8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，正常組全部存活，模型組死亡3只，益心舒組死亡2只，厄貝沙坦組死亡2只。死亡大鼠解剖發(fā)現(xiàn)：腹水量較大，呈粉紅色渾濁樣，肝脾明顯增大，邊緣圓鈍，質(zhì)地變硬，臟器粘連明顯；心臟增大，雙肺明顯淤血，其中1只有胸水。

2.2 病理學(xué)觀察 光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織，正常組心肌細(xì)胞形態(tài)正常，紋理清晰，無(wú)纖維增生；模型組可見(jiàn)心肌纖維改變，嗜酸性變性，壞死，間質(zhì)纖維化等，程度上多為中度以下；益心舒組雖然可見(jiàn)心肌空泡變性和心肌纖維化等改變，但均為輕微改變。厄貝沙坦組心肌改變也主要表現(xiàn)心肌空泡變性和嗜酸性變性，個(gè)別動(dòng)物空泡變性較重，與益心舒組無(wú)明顯差別。提示經(jīng)益心舒治療后，大鼠心肌細(xì)胞損傷狀況得到明顯改善。

2.3 各組心肌細(xì)胞凋亡情況及凋亡率比較（見(jiàn)表1） 正常組大鼠心肌切片偶爾可見(jiàn)凋亡細(xì)胞；模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡嚴(yán)重，呈孤立、散在分布，棕褐色胞核數(shù)量明顯增多。與正常組相比，模型組的細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，益心舒組及厄貝沙坦組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少，凋亡率明顯下降（P＜0.01）；益心舒組與厄貝沙坦組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率±s） %

表1 各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率±s） %

組別 n 細(xì)胞總數(shù) 凋亡率正常組5 500 3.50±0.46模型組 5 500 17.12±1.991）益心舒組 5 500 11.41±2.052）厄貝沙坦組 5 500 10.54±2.072）與正常組比較，1）P＜0．01；與模型組比較，2）P＜0.01

2.4 各組Bcl-2、Bax表達(dá)水平及Bcl-2／Bax比較（見(jiàn)表2） 與正常組比較，模型組Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)水平及Bcl-2／Bax顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，益心舒組及厄貝沙坦組Bcl-2蛋白表達(dá)水平均明顯升高，Bax蛋白表達(dá)水平均明顯降低（P＜0.01）。

表2 各組大鼠Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)及Bcl-2／Bax比較±s）

表2 各組大鼠Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)及Bcl-2／Bax比較±s）

組別 Bcl-2（%） Bax（%） Bcl-2／Bax正常組 0.182±0.015 0.044±0.011 4.383±1.210模型組 0.072±0.0161） 0.188±0.0111） 0.383±0.0861）益心舒組 0.106±0.0152） 0.124±0.0112） 0.854±0.092厄貝沙坦組 0.110±0.0192） 0.102±0.0222） 1.121±0.325與正常組比較，1）P＜0．01；與模型組比較，2）P＜0.01

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)采用近年來(lái)比較成熟的ADR腹腔注射方法來(lái)制造大鼠HF模型，ADR是一種常用的抗腫瘤藥物，對(duì)心肌有著特殊的親和力，可引起類似擴(kuò)張型心肌病樣改變以及在此基礎(chǔ)上發(fā)生的HF。其機(jī)制主要是通過(guò)心肌脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，抑制心肌肌漿網(wǎng)Ca2＋-ATP酶活性，并激活心肌局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)，使血管緊張素Ⅱ生成增多，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載來(lái)實(shí)現(xiàn)的［6，7］。近年來(lái)有研究表明［8，9］，在 ADR 致 HF的過(guò)程中，細(xì)胞凋亡起到了重要作用，即使暴露在低于微摩爾濃度ADR中的心肌細(xì)胞也會(huì)發(fā)生細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)表明：采用ADR2.5 mg／kg腹腔注射每周一次持續(xù)6周的造模方法是成功的，這與文獻(xiàn)［10］結(jié)果一致。20世紀(jì)90年代以來(lái)，人們逐漸明確心室重塑是HF發(fā)生發(fā)展的分子細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，1996年Narula等［11］率先證實(shí)，在HF晚期心肌中存在著細(xì)胞凋亡。而心肌細(xì)胞凋亡與心室重塑密切相關(guān)，是引起心肌細(xì)胞缺失的重要機(jī)制，在HF由代償向失代償轉(zhuǎn)變的過(guò)程中起著關(guān)鍵作用［12，13］。HF發(fā)生時(shí)左室功能的不斷惡化是心肌細(xì)胞凋亡或（和）剩余的心肌細(xì)胞收縮功能代償不足的結(jié)果，隨著心肌細(xì)胞凋亡使心肌細(xì)胞大量喪失，進(jìn)而細(xì)胞肥大、纖維化增生，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量減少到一定程度必然會(huì)導(dǎo)致HF進(jìn)行性惡化［14］。Abdelwahid等［15］研究指出，心肌細(xì)胞凋亡在心室重構(gòu)以及HF的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，是HF發(fā)生的重要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)各組均可見(jiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)，但檢測(cè)各組大鼠的細(xì)胞凋亡指數(shù)后發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，模型組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，益心舒組和厄貝沙坦組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯下降（P＜0.01）。提示在ADR致大鼠HF過(guò)程中伴隨有大量心肌細(xì)胞凋亡，中西醫(yī)治療均能明顯抑制大鼠心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而延緩HF發(fā)展，兩者的作用接近。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，其調(diào)控涉及許多基因，其中Bcl-2基因家族是目前最受重視也是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)參與凋亡調(diào)控的基因家族，屬于一類新的癌基因家族［16］。Bcl-2和Bax同屬Bcl-2基因家族成員，在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起著十分重要的作用，是兩種作用相反的基因表達(dá)產(chǎn)物：Bc1-2具有抑制心肌細(xì)胞凋亡作用，而B(niǎo)ax促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，兩種蛋白表達(dá)比率（Bc1-2／Bax）常用以表示心肌細(xì)胞凋亡的程度［17］。細(xì)胞凋亡時(shí)促凋亡基因Bax上調(diào)，Bcl-2／Bax比值下降。本實(shí)驗(yàn)免疫組化及蛋白半定量測(cè)定表明：模型組Bax蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Bcl-2表達(dá)下降，而治療組Bax蛋白表達(dá)下降，Bcl-2表達(dá)升高。由此提示：益心舒能明顯抑制大鼠心肌細(xì)胞凋亡，改善心功能，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Bcl-2、Bax的蛋白表達(dá)有關(guān)。但值得指出的是：與模型組相比，益心舒組與厄貝沙坦組的Bcl-2／Bax比值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），推測(cè)這可能是藥物對(duì)Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)不平行導(dǎo)致的。

HF屬中醫(yī)學(xué)“心悸”“怔忡”“喘證”“水腫”等范疇，屬本虛標(biāo)實(shí)、虛實(shí)夾雜之證，本虛為氣虛、陽(yáng)虛，標(biāo)實(shí)為血瘀，水濕。臨床上多采用益氣養(yǎng)陰、活血化瘀之法。益心舒膠囊源于著名古方生脈散，在人參、麥冬、五味子的基礎(chǔ)上，添加了丹參、黃芪、川芎及山楂，具有益氣復(fù)脈、活血化瘀、養(yǎng)陰生津的功效，臨床常用于HF和冠心病心肌梗死的治療。本實(shí)驗(yàn)表明，益心舒膠囊能明顯降低HF大鼠心肌細(xì)胞凋亡率，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)。推測(cè)益心舒膠囊可能是通過(guò)調(diào)控Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)而發(fā)揮其抑制HF心肌細(xì)胞凋亡、改善心功能的作用。而且益心舒膠囊益氣活血，臨床改善患者心肌供血作用明顯，是否還通過(guò)其他途徑抑制心室重塑，有待于進(jìn)一步研究探討。

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