體外培養(yǎng)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧模型的建立1）

馬培澤，宋憲波，劉 寧，姜月華，戴國(guó)華

缺血性心臟病已成為威脅人類生命健康的主要?dú)⑹?，而心肌微血管?nèi)皮細(xì)胞（CMECs）功能障礙一直是缺血性心臟病病因、發(fā)病機(jī)制及其防治研究領(lǐng)域中的熱點(diǎn)［1］。在體CMECs的功能受多種因素的影響，而體外培養(yǎng)的CMECs能否耐受缺氧，以及缺氧對(duì)CMECs活力及凋亡的影響還未明確。本研究通過(guò)大鼠CMECs培養(yǎng)，建立體外缺氧CMECs模型，觀察了缺氧對(duì)大鼠CMECs活力及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康SPF級(jí)雄性SD大鼠，山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SCXK（魯）2011 0003，體重220 g～280 g，普通基礎(chǔ)飼料飼喂。

1.2 主要儀器 倒置相差顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司），CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Heraeus公司），三氣培養(yǎng)箱（美國(guó)an eppendorf公司），流式細(xì)胞儀（德國(guó)BECKMAN公司），低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Scientific公司），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)BIO-TEK公司）。

1.3 主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司），0.25%胰蛋白酶（北京Solarbio公司），胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），PBS平衡液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），噻唑藍(lán)（MTT，北京Solarbio公司），二甲基亞楓（DMSO，美國(guó)Amresco公司），Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（杭州聯(lián)科生物有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 大鼠CMECs培養(yǎng)和鑒定 組織植塊法［2］。選用雄性SD大鼠，10%水合氯醛0.3 m L／100 g腹腔注射麻醉，75%乙醇浸泡消毒5 min。開胸、無(wú)菌剪下心臟，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，去除大血管、左右心房、右心室、室間隔，眼科剪剪碎約2 mm3，滴加1 mL胎牛血清，均勻接種于2個(gè)培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞孵育箱培養(yǎng)4 h讓組織塊貼牢，追加2 m L含20%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，24 h后換液一次，培養(yǎng)72 h左右組織塊周圍有大量細(xì)胞長(zhǎng)出，去除組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)，3 d換液一次。免疫細(xì)胞化學(xué)SABC法檢測(cè)Ⅷ因子相關(guān)抗原、CD31抗體免疫染色。胞漿中呈棕色著色，胞膜呈現(xiàn)黃褐色顆粒，表明培養(yǎng)的細(xì)胞為 CMECs［3］。

1.4.2 體外缺氧CMECs模型建立 將原代培養(yǎng)的CMECs進(jìn)行無(wú)血清處理12 h以使細(xì)胞同步化，然后繼續(xù)置于無(wú)血清培養(yǎng)液中，在1%O2-94%N2-5%CO2低氧氣體環(huán)境中培養(yǎng)24 h制備低氧損傷模型。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)分組 低氧氣體環(huán)境中培養(yǎng)24 h的CMECs作為缺氧組（L組），以無(wú)血清常氧培養(yǎng)CMECs作為對(duì)照組（N組）。

1.4.4 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 倒置相差顯微鏡100倍視野下觀察缺氧前后CMECs形態(tài)變化及貼壁情況。

1.4.5 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活力 兩組CMECs分別用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液重懸，制成單細(xì)胞懸液，按每孔4 000個(gè)接種于2個(gè)96孔板中，每孔體積200 L，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置對(duì)照孔，加同等體積培養(yǎng)液，向每孔加入 MTT溶液（5 g／L）20 L，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 L DMSO，振蕩10 min，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。

1.4.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 0.25%胰酶分別消化收集兩組細(xì)胞，將每個(gè)樣本細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1～5×106個(gè)，1 000／min離心5 min，棄上清，PBS洗滌2次，1 000／min離心5 min，棄上清，每個(gè)樣本用約500μL的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞；每個(gè)樣本中分別加入5μL的Annexin V-FITC和10μL的PI；避光搖均后黑暗中室溫孵育5 min；1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析結(jié)果，總凋亡率為早期凋亡與晚期凋亡之和。

1.4.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠CMECs的形態(tài)觀察 倒置相差顯微鏡下，細(xì)胞剛從組織塊游離出密度較低時(shí)呈星形或多邊形（見圖1A），當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至亞融合狀態(tài)，接近鋪滿培養(yǎng)瓶底壁時(shí)，呈短梭形并呈鋪路石狀生長(zhǎng)（見圖1B），在部分區(qū)域可見管腔樣（見圖1C）或血管網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)（見圖1D）。表明培養(yǎng)的細(xì)胞具備微血管內(nèi)皮細(xì)胞特征。

圖1 CMECs形態(tài)學(xué)特征

2.2 Ⅷ因子、CD31相關(guān)抗原免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定 免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，第Ⅷ因子相關(guān)抗原染色后，胞漿中呈棕色著色，核周染色最強(qiáng)（見圖2A）。CD31相關(guān)抗原免疫染色后，顯微鏡下可見內(nèi)皮細(xì)胞胞膜呈現(xiàn)黃褐色顆粒（見圖2B），陰性對(duì)照組未顯色（見圖2C）。證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為微血管內(nèi)皮細(xì)胞。

圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

2.3 倒置相差顯微鏡觀察缺氧前后細(xì)胞形態(tài) 與缺氧前相比，缺氧后細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變，細(xì)胞貼壁良好，很少有漂浮細(xì)胞。

2.4 缺氧對(duì)CMECs活力的影響 L組CMECs活力（0.53±0.025），N組CMECs活力（0.46±0.055），與 N 組比較，L組CMECs活力明顯增加（P＜0.05）。詳見表1。

2.5 缺氧對(duì)CMECs凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)主要將每組測(cè)試細(xì)胞群區(qū)分為四個(gè)細(xì)胞亞群：左下象限Annexin V-FITC和PI染色均為陰性（即FITC-／PI-），代表正常細(xì)胞；左上象限PI單染（即FITC-／PI＋）代表壞死細(xì)胞；晚期凋亡壞死的細(xì)胞表現(xiàn)為右上象限Annexin V-FITC和PI染色均陽(yáng)性（即FITC＋／PI＋）；右下象限 Annexin V-FITC單染陽(yáng)性（即FITC＋／PI-），為早期凋亡的細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)分析的是早期凋亡、晚期凋亡和總凋亡率。與N組相比，L組總凋亡率降低（P＜0．05），其中早期凋亡降低最明顯（P＜0.01）。詳見表1，見圖3。

表1 大鼠CMECs活力、細(xì)胞凋亡率（x±s） %

圖3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

3 討 論

隨著缺血性心臟病發(fā)病率的升高，CMECs缺氧模型的體外培養(yǎng)也越來(lái)越受到學(xué)者的關(guān)注，但是以往的研究大多圍繞CMECs缺氧復(fù)氧模型展開，單純?nèi)毖鯇?duì)CMECs的影響未見報(bào)道。本研究采用無(wú)血清培養(yǎng)液處理CMECs，置于三氣培養(yǎng)箱中，制作1%O2-94%N2-5%CO2低氧氣體環(huán)境，培養(yǎng)24 h成功制備了CMECs缺氧模型。三氣培養(yǎng)箱能夠通過(guò)控制氧氣和氮?dú)獾妮斎肓?，用傳感器?lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)氧含量的控制，進(jìn)行O2、N2和CO2三氣控制，達(dá)到供氧減少的目的。該模型控制精確，可以設(shè)定不同的缺氧程度，而且由于進(jìn)氣裝置有過(guò)濾膜，不易污染，是目前國(guó)際公認(rèn)的制作細(xì)胞缺氧模型設(shè)備［4］。

在形態(tài)學(xué)上細(xì)胞核的形態(tài)變化為凋亡最典型的特征，也是判斷凋亡的最基本、最直接的指標(biāo)之一［5］。對(duì)CMECs而言，形態(tài)學(xué)變化包括胞膜回縮、漂浮等表現(xiàn)。本研究鏡下觀察缺氧24 h對(duì)細(xì)胞形態(tài)沒(méi)有明顯影響，但是通過(guò)MTT測(cè)定細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)缺氧24 h CMECs活力明顯高于常氧組，表明CMECs能夠耐受短時(shí)間缺氧，這與劉健等［6］的研究結(jié)果一致，其研究發(fā)現(xiàn)缺氧24 h使肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞活力增加，并認(rèn)為其機(jī)制可能是缺氧通過(guò)代償引起線粒體增多，線粒體脫氫酶類活性增加所致。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺氧組細(xì)胞凋亡率較常氧組細(xì)胞明顯降低，并且以早期凋亡減少為主。這與缺氧復(fù)氧CMECs活力及凋亡檢測(cè)的研究結(jié)果相反，CMECs缺氧復(fù)氧后細(xì)胞活力降低，凋亡增加［7］。本研究結(jié)果的原因可能是缺氧后改變了CMECs增殖相關(guān)蛋白激酶和細(xì)胞凋亡相關(guān)分子的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)其細(xì)胞活力和凋亡，而缺氧復(fù)氧對(duì)細(xì)胞的損傷較單純?nèi)毖醺鼮閲?yán)重。雖然本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺氧后CMECs活力增加，凋亡減少，但是反映其血管生成功能的增殖、遷移、成管的能力還未明確，有待進(jìn)一步觀察。

此外，本實(shí)驗(yàn)僅觀察了缺氧24 h對(duì)CMECs的影響，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，CMECs活力及凋亡會(huì)發(fā)生怎樣的變化，目前還未明確；單純?nèi)毖跖c缺氧復(fù)氧對(duì)CMECs活力及凋亡影響的區(qū)別也有待進(jìn)一步研究；不同缺氧時(shí)間對(duì)CMECs增殖與凋亡相關(guān)基因和蛋白表達(dá)的影響將進(jìn)一步揭示缺氧狀態(tài)下CMECs增殖與凋亡的分子機(jī)制，隨著一系列相關(guān)研究的開展，CMECs在缺血性心臟病中的作用將會(huì)逐漸明確，并最終為缺血性心臟病的治療提供新的思路與方法。

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