LC-MS/MS 法測(cè)定前列地爾注射液中前列腺素A1

曹晴+劉志東+代文兵+張強(qiáng)

[摘 要] 目的：建立高效液相色譜-四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法 （ LC-MS/MS 法） 測(cè)定前列地爾注射液中前列腺素A₁的含量。方法：前列地爾注射液經(jīng)稀釋后，采用Agilent.poroshell 120 SBC18色譜柱 （ 2.1×50 mm， 2.7 μm ） 進(jìn)行分析，流動(dòng)相為乙腈-0.5%甲酸水溶液，流速0.2 mL/ min；質(zhì)譜采用電噴霧離子化 （ ESI ） 源，負(fù)離子-多反應(yīng)監(jiān)測(cè) （ MRM ） 模式，內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果：前列腺素A₁的線(xiàn)性范圍為0.3～10 ng/mL ；平均回收率為100.2%，RSD為1.69%。3批樣品每 1 mL中含前列腺素A₁均未過(guò) 3.0 μg。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、快速，可用于前列地爾注射液中前列腺素A₁的測(cè)定。

[關(guān)鍵詞] 前列地爾注射液；前列腺素A₁；液質(zhì)聯(lián)用

中圖分類(lèi)號(hào)：o657 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2055-5200（2014）01-060-04

Doi：10.11876/mimt201401016

Determination of Prostaglandin A₁ in Alprostadil injection by LC-MS/MS CAO Qing1， LIU Zhi-dong1， DAI Wen-bing2， ZHANG Qiang2. （1.Research Center of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193； 2.School of Pharmaceutical Sciences，Peking University， Beijing 100191）

[Abstract] Objective： To establish a liquid chromatography-tandem mass spectrometric method（LCMS /MS） for the determination of Prostaglandin A₁ in Alprostadil injection. Methods： After being diluted，the sample was separated on an Agilent.poroshell 120 SB-C18 column（2.1×50 mm 2.7 μm） for isocratic elution with a mobile phase of acetonitrile-0.5% formic acid water- solution at a flow rate of 0.2 mL/min.Then the processed sample was analyzed by tandem mass spectrometer with negativeelectrospray ionization（ESI） source，monitored under a multiple reaction monitoring（MRM） mode. Results： The calibration curve showed a good linearity in the range of 0.3 -10 ng/mL.The average recovery was 100.2% with RSD of 1.69%.The content of Prostaglandin A₁ in batches of Alprostadil injection samples was not more than 3.0 μg/mL. Conclusion： The developed method can be used for the quantitative determination of for Prostaglandin A₁ in Alprostadil injection.

[Key words] Alprostadil injection；compound；Prostaglandin A₁；LC-MS /MS

前列地爾是一種活性極強(qiáng)的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)，具有明顯的擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集，從而抑制血栓素A2的釋放，它能特異性的作用于缺血局部，明顯擴(kuò)張病變狹窄的血管。在動(dòng)物和臨床研究中發(fā)現(xiàn)，該藥可以降低血液粘度紅細(xì)胞聚集性，改善血液流變學(xué)作用[1-2]。前列地爾在水溶液中化學(xué)穩(wěn)定性差，對(duì)光、熱、pH值敏感，前列地爾注射液在制備和儲(chǔ)存過(guò)程中主要降解雜質(zhì)為前列腺素A₁[3-4]。在前列地爾注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[5] 中前列腺素A₁的含量測(cè)定方法為固相萃取、柱后衍生化高效液相色譜法，方法較復(fù)雜。關(guān)于前列腺素A₁的 LC-MS/MS測(cè)定方法目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究首次建立了 LC-MS/MS 法測(cè)定前列地爾注射液中前列腺素A₁含量的方法，注射液經(jīng)稀釋后直接測(cè)定，操作簡(jiǎn)便。測(cè)定了3批前列地爾注射液中前列腺素A₁的含量，結(jié)果準(zhǔn)確。該方法可為今后簡(jiǎn)單、方便地控制前列地爾注射液中前列腺素A₁的含量提供參考。

1 儀器與試藥

LC-20AD 型高效液相色譜儀（日本 Shimadzu 公司） ；API 4000 三重四極桿質(zhì)譜儀（美國(guó) AB Sciex公司） ，配有電噴霧離子源；BT25S 電子天平（Sartorius）。

乙腈、甲醇均為色譜純（德國(guó) Merck 公司）；甲酸為色譜級(jí)（Formic Acid 99% HPLC，ROE scientific IAIC ，USA）；水為 Millipore 純化水。

前列腺素A₁ 標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)051M1421V，純度≥98%，美國(guó) Sigma 公司）、地塞米松標(biāo)準(zhǔn)品（純度>99%，美國(guó) Sigma 公司）。前列地爾注射液（凱時(shí)，北京泰德制藥股份有限公司，規(guī)格：2 mL ： 10 μg）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 精密稱(chēng)取前列腺素A₁標(biāo)準(zhǔn)品4 mg和內(nèi)標(biāo)地塞米松標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，分別置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，配制成0.4 mg /mL的前列腺素A₁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和1 mg /mL的內(nèi)標(biāo)地塞米松標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

2.1.2 供試品溶液 精密量取前列地爾注射液50 μL和內(nèi)標(biāo)溶液 （5 μg /mL的地塞米松溶液） 200 μL置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按“2. 1. 2”項(xiàng)下方法制備不含前列地爾的陰性樣品。

2. 2 色譜-質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent.poroshell 120 SBC18（2.1×50 mm ，2.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.5%甲酸水溶液（B）（50：50，V/V）[6]；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：26 ℃。

2.2.2 質(zhì)譜條件 ESI 源：負(fù)離子掃描； MRM 模式，定量分析的離子反應(yīng)分別：m/z 335.0 → m/z 317.1（前列腺素A₁）和m/z 391.0 → m/z 361.2（地塞米松，內(nèi)標(biāo)）；碰撞氣壓力（CAD）： 6.0 psi； 氣簾氣壓力（CUR）：20 psi；霧化氣壓力（GS1） ： 40 psi； 去溶劑氣壓力（GS2） ： 50 psi； 去溶劑溫度（TEM） ： 500 ℃； 噴霧電壓（IS） ： -4500 V； 前列腺素A₁去簇電（DP） ： -34 V； 碰撞能（CE） ： -15 V；射入電壓（EP） ： -10 V； 碰撞室出口電壓（CXP） ： -6 V。地塞米松去簇電（DP） ： -90 V；碰撞能 （CE） ： - 14 V；射入電壓（EP） ： -10 V； 碰撞室出口電壓（CXP） ： -8 V。離子對(duì)駐留時(shí)間（Dwell） ： 100 ms。前列腺素A₁ 、地塞米松產(chǎn)物離子掃描質(zhì)譜圖，見(jiàn)圖1。

在上述色譜-質(zhì)譜條件下，流動(dòng)相、對(duì)照品、陰性樣品與樣品圖譜見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，前列地爾、輔料不干擾前列腺素A₁的測(cè)定，說(shuō)明本LC-MS/MS條件下專(zhuān)屬性良好，見(jiàn)圖2。

2.3 線(xiàn)性關(guān)系

精密量取適量前列腺素A₁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)溶液（5μg /mL的地塞米松溶液） 200μL，分別置于10mL容量瓶中，以甲醇-水（50：50，v/v）稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度分別為 0.3，0.5，1，2，5，10ng/mL的前列腺素A₁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取 5μL進(jìn)行LC-MS/MS分析，并記錄色譜圖和數(shù)據(jù)；以前列腺素A₁濃度值為橫坐標(biāo)，以前列腺素A₁與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，用加權(quán)（W=1/x2）最小二乘法[7]回歸運(yùn)算得到直線(xiàn)回歸方程，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：y=0.336x+0.00353 （r=0.9987）。前列腺素A₁在 0.3～10 ng/mL范圍內(nèi)濃度與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn)

配制前列腺素A₁ 0.5、2、10 ng/mL 3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度平行3份，進(jìn)樣分析，得相應(yīng)峰面積，結(jié)果前列腺素A₁低、中、高3個(gè)濃度峰面積的RSD分別為1.63%、1.10%、1.61%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)2222M），依法制備供試品溶液，于制備好后 0、1、2、3、6 h 進(jìn)樣分析，并隨行測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算前列腺素A₁的含量及其RSD，結(jié)果 RSD 為 3. 2%，表明供試品溶液在 0-6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品 （批號(hào)2222M），一式 6 份，依法制備溶液并進(jìn)樣測(cè)定，隨行測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算前列腺素A₁的含量及其RSD，結(jié)果平均含量為0.68μg/mL，RSD 為2.3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取陰性樣品（缺前列地爾） 50μL共9份，分別置10mL容量瓶中，分別加入適量前列腺素A₁標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液（5μg/mL的地塞米松溶液）200μL，然后用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制前列腺素A₁ 0.5、2、10ng/mL3個(gè)濃度的溶液，每個(gè)濃度平行3份，進(jìn)樣分析，得相應(yīng)峰面積，結(jié)果平均回收率為100.2%，RSD為1.69%（見(jiàn)表1）。

2. 8 基質(zhì)效應(yīng)

取陰性樣品 50μL，置10mL容量瓶中，分別精密加入適量前列腺素A₁ 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液和內(nèi)標(biāo)溶液（5 μg/mL的地塞米松溶液） 200μL，然后用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度分別為 0.5、2、10ng/mL的前列腺素A₁溶液，進(jìn)樣分析，得相應(yīng)峰面積； 取相應(yīng)3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液與內(nèi)標(biāo)混合后直接進(jìn)樣分析，獲得待測(cè)物無(wú)基質(zhì)影響的峰面積，用待測(cè)物每一濃度經(jīng)過(guò)兩種處理方法所得的峰面積的比值計(jì)算本方法的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果均在 90%～110%之間。表明在本方法下陰性樣品基質(zhì)對(duì)前列腺素A₁的測(cè)定無(wú)影響。

2.9 樣品測(cè)定

取3批樣品，依法制備供試品溶液，每批樣品制備 3 份溶液，每份溶液進(jìn)樣測(cè)定 1 次，并隨行測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法計(jì)算樣品中前列腺素A₁的含量，并計(jì)算每批樣品的平均含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

前列腺素A₁為前列地爾注射液在制備和儲(chǔ)存過(guò)程中主要降解雜質(zhì)，已有文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定前列腺素A₁的方法多為高效液相色譜法[8-11]， 樣品處理較為繁瑣， 測(cè)定較為費(fèi)時(shí)。本文采用靈敏度高，專(zhuān)屬性強(qiáng)的高效液相色譜-四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用方法 （ LCMS/MS ） 測(cè)定，方法前處理簡(jiǎn)單快速，樣品測(cè)定用時(shí)較短，靈敏度較高，檢測(cè)限低，并且重現(xiàn)性較好，結(jié)果可靠準(zhǔn)確，適合于前列地爾注射液的前列腺素A₁控制。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Kerins， D.M.， Murray， R.， FitzGerald， G.A. Prostacyclin and prostaglandinE1： m-olecular mechanisms and therapeutic utility[J]. Prog. Hemost. Thromb. 1991，10，307-337.

[2] Michael G，Priscilla Z，Masayoshi M，et al.Metabolism of Prgstaglandis A₁ and E1 in man[J].The Journal of Clinical In vestigation，1975，56：1404-1410.

[3] Kirtland SJ. Prostaglandin E1：a review[J]. Prostaglandins Leukot Essent Fat ty Acids，1988，32（3）：165- 174.

[4] Katori M et al：Exp Med 1970，91，67.

[5] WS1-（X-041）-2002Z-2008.前列地爾注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[S].北京：國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局，2008.

[6] 李國(guó)慶.前列地爾定量分析方法及注射用前列地爾膠束動(dòng)物比較藥代動(dòng)力學(xué)研究[D].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)，2011.

[7] 鐘大放.以加權(quán)最小二乘法建立生物分析標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的若干問(wèn)題[J].藥物分析雜志，1996，16（5）：343-346.

[8] 趙曉玲， 曲建國(guó).RP-HPLC 測(cè)定前列地爾尿道栓中前列腺素 A₁ 及其有關(guān)物質(zhì)[J].藥物分析雜志，2006，26（6）：836-839.

[9] 丁銳，紀(jì)宏，陳思，等HPLC法測(cè)定注射用前列地爾中有關(guān)物質(zhì)的含量[J].中國(guó)藥房雜志，2010，21（29）：2765-2767.

[10] 李萍、劉宏大.柱后衍生化法測(cè)定前列地爾乳劑的有關(guān)物質(zhì)[J].藥品鑒定雜志，2010 ，7 （34）：47-49.

[11] 吳秀榮，林煥澤，李桃，等. RP-HPLC法檢測(cè)注射用前列地爾的有關(guān)物質(zhì)[J].中國(guó)臨床藥學(xué)雜志，2011，20（4）：234-236.