牛凝乳酶基因在畢赤酵母中的表達(dá)

冷歡，張幸，劉家書，趙勇，李谞，江正兵，宋慧婷

（1.湖北省工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖北大學(xué)），湖北武漢430062；2.湖北大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，湖北武漢430062）

0 引言

凝乳酶是從未斷奶的小牛第四胃中提取的一種天冬氨酸蛋白酶，它可以切斷牛乳κ－酪蛋白的Phe－Met肽鍵，導(dǎo)致牛乳凝結(jié)［1］.在小牛皺胃中，凝乳酶通常合成為一個含有381個氨基酸的前體聚肽—凝乳酶原前體，凝乳酶原前體在分泌過程中去掉16個信號肽形成含有365個氨基酸的凝乳酶原［2］.凝乳酶原無活性，它在酸性pH下通過多步的自動催化過程，去掉N末端42個氨基酸形成有活性的含有323個氨基酸的蛋白－凝乳酶［3］.目前，凝乳酶年均需求量為2.5×107L，約占全世界酶制劑總量的15%，居第二位［4］.傳統(tǒng)的凝乳酶來源于小牛皺胃.但是隨著世界奶酪產(chǎn)業(yè)的不斷壯大，單純靠宰殺大量的小牛獲取凝乳酶顯然與現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展不相符，植物凝乳酶雖然來源廣泛，但是其蛋白水解力強(qiáng)，并且受時間、地點(diǎn)等的限制難以發(fā)展.微生物凝乳酶從1965年起開始取代小牛皺胃酶生產(chǎn)干酪以來，成功地彌補(bǔ)了小牛凝乳酶短缺的問題，并在奶酪制造業(yè)與酪素產(chǎn)業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用.目前利用微生物凝乳酶生產(chǎn)的干酪已占世界干酪總產(chǎn)量的1／3［5］.目前，在我國利用畢赤酵母表達(dá)牛凝乳酶的報道較少，在畢赤酵母宿主菌中分泌表達(dá)的凝乳酶的結(jié)構(gòu)以及酶學(xué)性質(zhì)在相應(yīng)的報道中研究的并不全面，并且微生物中表達(dá)得到凝乳酶代替屠殺小牛來提取小牛凝乳酶更具有現(xiàn)實(shí)意義.因此，凝乳酶基因在畢赤酵母中表達(dá)這一研究值得我們進(jìn)一步考究.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料 菌種和質(zhì)粒：Escherichia.coli XL10－Gold，畢赤酵母GS115由本實(shí)驗(yàn)保存.

1.2 試劑與培養(yǎng)基 限制性內(nèi)切酶：SfiⅠ、MunⅠ、NotⅠ、XbaⅠ、EcoRⅠ，T4DNA連接酶，EX TaqDNA聚合酶，DNA markers購自TaKaRa公司.

實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基主要有：LB、YPD、MD、BMGY、BMMY培養(yǎng)基的組成和配制參見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊.

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 TaKaRa梯度PCR儀購自TaKaRa公司；冰凍離心機(jī)購自Sigma公司低溫冰箱合肥美菱股份有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；UV－2550分光光度計上海棱光技術(shù)有限公司.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 載體pPIC9K－prochy構(gòu)建 GenBank中找到凝乳酶的基因編號為：NM＿180994.1.由上海捷瑞生物工程有限公司基因合成，合成基因克隆于質(zhì)粒pUC19.將pUC19－prochy用EcoRⅠ和NotⅠ酶切，得到prochy基因片段.用質(zhì)粒pPIC9k分別EcoRⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切，分別回收載體和目的基因的雙酶切產(chǎn)物，用T4DNA連接酶在16度下連接，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K－prochy.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL10－Gold，用LB瓊脂平板（Amp 25mg／mL）篩選，抽提質(zhì)粒DNA.SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切驗(yàn)證.

1.4.2 構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K－prochyQ（去掉凝乳酶基因中的信號肽序列） 根據(jù)對酵母表達(dá)載體pPIC9K的限制性酶切位點(diǎn)分析，并參考本實(shí)驗(yàn)室已克隆的凝乳酶基因序列（GenBank Accession No.NM＿180994.1），在基因上下游設(shè)計特異引物，序列見表1，引物由上海英駿生物工程有限公司完成.這對引物主要用于去掉凝乳酶原前端信號肽序列，凝乳酶原的氨基酸序列中前16個氨基酸為信號肽.Prochymosin－EcoR1－F這段引物從49位堿基開始.將得到的PCR產(chǎn)物膠回收后用EcoRⅠ和NotⅠ酶切，即得到prochy－Q（去掉凝乳酶原基因前端的48個信號肽的堿基序列）［6］.用質(zhì)粒pPIC9K分別EcoRⅠ和NotⅠ進(jìn)行雙酶切.將分別回收載體和目的基因的雙酶切產(chǎn)物用T4DNA連接酶在16度下連接，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K－prochyQ.將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)中，用LB瓊脂平板（Amp25mg／mL）篩選，抽提質(zhì)粒DNA.SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切驗(yàn)證.

表1 本實(shí)驗(yàn)中使用的引物

1.4.3 電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115 使用SalⅠ酶切重組質(zhì)粒pPIC9K－prochy以及pPIC9K－prochyQ使其線性化.通過電脈沖法將線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中，MD平板篩選轉(zhuǎn)化子［7］.

1.4.4 陽性克隆的功能鑒定 將篩選得到的陽性克隆分別接種于含50mL BMGY液體培養(yǎng)基的500mL的三角瓶中，于28℃搖床上培養(yǎng)待OD值達(dá)到2～6時，再分別將其接種于含50mL BMMY液體培養(yǎng)基的1 000mL的三角瓶中.每24h加一次甲醇使其終體積參數(shù)為0.5%，培養(yǎng)4d后，收集培養(yǎng)液上清.采用Arima K的方法對上清進(jìn)行凝乳活力（milk clotting activity，MCA）的測定［8］.

用0.01mol／L的CaCl2溶液配制10%脫脂乳，此溶液配制后在室溫下放置40min后使用，取5mL10%脫脂乳于35℃保溫10min，加入適量稀釋的酶液，震蕩均勻并開始計時，觀察管壁上開始出現(xiàn)凝乳顆粒為終點(diǎn)，記錄凝乳時間（t／min），在上述條件下，40min凝結(jié)1mL10%脫脂乳的酶量定義為一個Soxhlet單位（SU）.

1.4.5 重組凝乳酶的酶學(xué)特性的研究 收集BMMY培養(yǎng)基上清，將其保存在4℃冰箱，隨后我們對重組凝乳酶進(jìn)行一系列的酶學(xué)特性的分析.如凝乳酶反應(yīng)的最適pH，凝乳酶的pH值穩(wěn)定性，凝乳酶的熱穩(wěn)定性，反應(yīng)的最適溫度［9］.

1.4.5.1 凝乳酶反應(yīng)的最適pH值 用1mol／L的H2SO4和2mol／L的NaOH將脫脂奶粉的pH值調(diào)到5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在37℃下測定重組凝乳酶的活性.將最高活力定義為100%，分別計算不同pH值條件下凝乳酶的相對酶活力.

1.4.5.2 凝乳酶的pH值穩(wěn)定性 用1mol／L的H2SO4和2mol／L的NaOH將酶液的pH值調(diào)到2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，在4℃下放置l h后，再用1mol／L的H2SO4和2mol／L的NaOH將酶液的pH值調(diào)到6.0，在37℃下測定重組凝乳酶的殘余酶活，將最高活力定義為100%，分別計算不同pH值條件下凝乳酶的相對酶活力.

1.4.5.3 凝乳酶的熱穩(wěn)定性 將酶液分裝于試管中，分別在40、50、55℃水浴中溫育，每隔10min取樣，迅速冷卻，在37℃下測定殘余重組凝乳酶的活性.將未處理酶液的酶活力定義為100%，分別計算不同溫度條件下凝乳酶的相對酶活力.

1.4.5.4 重組凝乳酶的最適反應(yīng)溫度 將酶反應(yīng)體系在20、25、30、35、40、45、50℃等溫度下檢測重組凝乳酶的活性，將最高的酶活力定義為100%，分別計算不同溫度條件下凝乳酶的相對酶活力.

2 結(jié)果部分

2.1 載體pPIC9K－prochy和載體pPIC9K－prochyQ構(gòu)建圖譜與酶切鑒定 根據(jù)以上的構(gòu)建方法，得到重組載體質(zhì)粒pPIC9K－prochy、pPIC9K－prochyQ.其構(gòu)建圖譜和酶切鑒定如圖1～3所示.pPIC9K、pPIC9K－prochy、pPIC9K－prochyQ經(jīng)過SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切后理論上會分別得到大小為1 900bp，3 100bp，3 100bp小片段，這與我們實(shí)際得到的（如圖3所示）片段相符.

圖1 載體pPIC9K－prochy構(gòu)建過程

圖2 載體pPIC9K－prochyQ構(gòu)建過程

圖3 pPIC9k和pPIC9k－prochy pPIC9k－prochyQ的酶切檢測結(jié)果M為λ－EcoT14Ⅰdigest DNA marker；9K、Y、Q分別對應(yīng)為pPIC9K、pPIC9K－prochy、pPIC9K－prochyQ質(zhì)粒經(jīng)過SalⅠ和EcoRⅠ雙酶切后的電泳圖.

2.2 陽性克隆的功能鑒定 通過構(gòu)建成功的表達(dá)載體pPIC9K－prochy，pPIC9K－prochyQ線性化后使用電脈沖法將線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中，MD平板篩選轉(zhuǎn)化子.我們使用搖瓶誘導(dǎo)的方法共篩選了120株重組菌，得到3株菌株表達(dá)的凝乳酶有明顯的凝乳活性，分別命名為GS115／pPIC9K－chy1（表達(dá)載體為pPIC9K－prochy，保留凝乳酶基因中的信號肽），GS115／pPIC9K－chy20（表達(dá)載體為pPIC9K－prochy，保留凝乳酶基因中的信號肽），GS115／pPIC9K－chy8Q（表達(dá)載體為pPIC9K－prochyQ，去掉凝乳酶基因中的信號肽）.如圖4，將這3株菌株搖瓶誘導(dǎo)得到的上清粗酶液進(jìn)行功能鑒定，從左至右分別是GS115／pPIC9K－chy1，GS115／pPIC9K－chy20，GS115／pPIC9K－chy8Q，GS115／pPIC9K（對照）.

2.3 重組凝乳酶的活力曲線 將篩選得到的3株酵母重組菌株分別接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY中，每24 h加一次甲醇至終濃度為0.5%并取1mL培養(yǎng)液測其凝乳酶的活力以繪出凝乳酶的活力曲線.重組凝乳酶（來自于GS115／pPIC9K－chy1菌株）的活力曲線如圖5，144h時有較大幅度的增長，在168h時有最大酶活，另外兩種菌株表達(dá)的凝乳酶的酶活也在144h后有較大幅度的增長.

2.4 重組凝乳酶的最適反應(yīng)pH值 將篩選得到的3株酵母重組菌株分別接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY中，每24h加一次甲醇至終濃度為0.5%并取1mL培養(yǎng)液測其凝乳酶的活力以繪出凝乳酶的相對酶活.重組凝乳酶（來自于GS115／pPIC9K－chy1菌株）的相對酶活曲線如圖6.圖中可以看到重組凝乳酶在pH值為6.0時酶活最高.

圖4 陽性克隆的功能鑒定

圖5 重組凝乳酶的酶活特性

圖6 重組凝乳酶的最適反應(yīng)pH

2.5 重組凝乳酶的pH穩(wěn)定性 將酶在不同pH梯度下處理1h后，結(jié)果如圖7所示.隨著pH值的增加，重組凝乳酶的活性隨著增加，當(dāng)pH為4～7時，凝乳酶有較好的穩(wěn)定性.在pH為7.0時，重組凝乳酶有最大酶活，當(dāng)pH大于7.0時，隨著酶的變性導(dǎo)致酶活力迅速下降.在pH等于9.0時，凝乳酶幾乎沒有活性，推測是由于酶發(fā)生不可逆變性導(dǎo)致，可認(rèn)為酶活為0.

2.6 凝乳酶的熱穩(wěn)定性 如圖8所示，重組凝乳酶在50℃以下可以保持相對穩(wěn)定的活性，當(dāng)溫度超過55℃時，凝乳酶的活性迅速下降.

圖7 重組凝乳酶的pH穩(wěn)定性

圖8 凝乳酶的熱穩(wěn)定性

2.7 重組凝乳酶的最適反應(yīng)溫度 如圖9所示，當(dāng)溫度低于30℃時，由于溫度太低，凝乳反應(yīng)幾乎不能發(fā)生，隨著溫度的升高，凝乳酶的活性逐漸增加，達(dá)到45℃時有最大反應(yīng)活性，隨著溫度繼續(xù)升高，酶的活性迅速下降.

圖9 溫度對重組凝乳酶活性的影響

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)篩選到了3株重組菌株——GS115／pPIC9K－chy1、GS115／pPIC9K－chy20、GS115／pPIC9K－chy8Q.通過Arima K酶活測試方法，確定了這3種菌株表達(dá)的凝乳酶都具 有一定的凝乳特性，其中GS115／pPIC9K－chy1的活性最高為1.905SU／mL，GS115／pPIC9K－chy20其次，GS115／pPIC9K－chy8Q表達(dá)得到的凝乳酶的酶活相對最小.前兩株重組菌為沒有去掉凝乳酶基因中的信號肽，GS115／pPIC9K－chy8Q為去掉了凝乳酶基因中的信號肽.據(jù)此我們有兩種推測，一是凝乳酶本身含有的前導(dǎo)肽可能對凝乳活性產(chǎn)生有利影響；二是由于GS115－pPIC9K－chy1和GS115－pPIC9K－chy20這兩種菌株中所含的目的基因的拷貝數(shù)多于GS115－pPIC9K－chy8Q，推測二可以通過Southern－blot來檢測這3種菌株中所含的目的基因的拷貝數(shù)，從而證實(shí)其正確與否.

重組凝乳酶的最適反應(yīng)溫度為45℃，在50℃以下可以保持相對穩(wěn)定的活力，當(dāng)溫度高于55℃時酶的活力迅速下降，重組凝乳酶的最適pH值為6.0.當(dāng)酶液的pH為4～7時，凝乳酶有較好的穩(wěn)定性，在pH為7.0時，重組凝乳酶最穩(wěn)定，當(dāng)pH大于7.0時，隨著酶的變性導(dǎo)致酶活力迅速下降.通過重組凝乳酶的活力曲線得出，144h后凝乳酶的酶活有明顯的提高.通過酶學(xué)特性的研究，證明了重組凝乳酶與商品凝乳酶的酶學(xué)特性相近，至于將其應(yīng)用到工業(yè)化食品奶酪的加工［10］生產(chǎn)還需要我們進(jìn)一步研究.

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