梔子藍色素的制備及其抗氧化活性研究

尹 燕，黃相中，關小麗，李艷春，倪 崛，李云龍

(1.云南瑞寶生物科技有限公司，云南 昆明 650217; 2. 云南民族大學 民族藥資源化學國家民委-教育部重點實驗室，云南 昆明 650500)

梔子是茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果實，為臨床常用中藥，屬衛(wèi)生部頒布的第一批藥食兩用資源，其性寒、味苦，歸心、肺、三焦經(jīng)[1].在我國主要分布于江蘇、安徽、江西、廣東、廣西、云南、河南、貴州、四川、湖北、福建、臺灣等地[2].梔子苷是梔子的主要成分之一，梔子藍色素是以梔子苷為底物，經(jīng)過β-葡萄糖苷酶的作用或微生物發(fā)酵所制得的天然色素[3-5]，梔子藍色素的穩(wěn)定性已有文獻報道[6-8]，抗氧化活性未見報道.本研究用米曲霉發(fā)酵產物水解梔子苷，水解產物與味精反應制備梔子藍色素，旨在提高梔子藍色素粗品的色價，并用大孔樹脂DM-2對制得的梔子藍色素進行精制，同時以DPPH自由基捕獲分光光度法測定梔子藍色素的抗氧化活性，為提高梔子藍色素工業(yè)化生產中粗品的色價提供科學依據(jù)，為食用天然色素的應用進一步拓寬渠道.

1 材料與方法

1.1 材料

1) 原料與試劑.梔子苷(液態(tài)，含量42.30%)，云南瑞寶生物科技有限公司；米曲霉(編號：ym3 051)，云南省微生物研究所；1,1-二苯-2-苦肼基(DPPH·)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，Sigma 公司；DM-2大孔吸附樹脂，山東魯抗立科藥物化學有限公司；味精(含量≥99%)，河南蓮花味精股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)，生物試劑，北京三藥科技開發(fā)公司；水為蒸餾水；其它試劑均為國產分析純.

2) 儀器與設備.KY-隔水式培養(yǎng)箱， BS-2F恒溫震蕩培養(yǎng)搖床，金壇市華城開元實驗儀器廠；LDZX-BOA立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1F型超凈工作臺，中日合資蘇州安泰空氣技術有限公司；FA1604 型電子天平，上海天平儀器廠； ZK-82A真空干燥箱，上海實驗儀器總廠；RE-52旋轉蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市華富儀器有限公司；UV 1810分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 PDA培養(yǎng)基的配制

取3.7 g培養(yǎng)基粉末，加水100 mL，加熱溶解，分裝于15 mm×150 mm的試管中，加塞、包扎，121 ℃滅菌20 min后取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆?

1.2.2 發(fā)酵液的制備

1) 菌懸液的制備.在無菌的條件下，把米曲霉接入PDA培養(yǎng)基，在29 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)73 h，然后用無菌生理鹽水配制成107～108cfu·mL-1的菌懸液.

2) DNS試劑的配制.準確稱取無水的3,5 -二硝基水楊酸3.25 g，氫氧化鈉1.6 g溶解于20 mL蒸餾水中，加入22.5 mL丙三醇溶解定容至500 mL，貯存于棕色試劑瓶中.

3) 培養(yǎng)基的優(yōu)化.選擇麥麩(A)、(NH4)2SO4(B)、CaCl2(C)、ZnSO4·7H2O(D)、MgSO4·7H2O(E)、KH2PO4(F)因素，4水平對液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，因素水平變化(見表1).固定菌懸液的接入量為3%，發(fā)酵溫度為30 ℃，搖床的震蕩速率為130～150 r/min，發(fā)酵時間為84 h.參照文獻[9-10]，分別取1 mL 發(fā)酵液于10 mL比色管中，加入1 mL 0.5%水楊素(溶于pH 4.6, 0. mol/L HAc 緩沖溶液)，在50 ℃下水浴保溫30 min后，加入 1.5 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻至室溫后用蒸餾水定容，在540 nm處測定吸光值.

4) 發(fā)酵條件的優(yōu)化.通過正交試驗，選擇溫度(A)、搖床的震蕩速率(B)、裝液量(E)、接種量(D)及發(fā)酵時間(C)5因素，4水平進行發(fā)酵條件的優(yōu)化，因素水平變化(見表2).

表1 液體發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗因素水平變化 %

表2 液體發(fā)酵條件正交試驗因素水平變化

1.2.3 梔子藍色素制備條件的優(yōu)化

選擇梔子苷的質量濃度(D)、裝液量(B)、震蕩速率(A)、加味精前的反應時間(C)4因素3水平進行正交試驗對梔子藍色素的制備條件進行優(yōu)化，因素變化見表3.參照文獻[5,11-12]，反應溫度為 50 ℃，味精的添加量為梔子苷質量的0.7倍，加發(fā)酵液水解時間為6 h，發(fā)酵液的添加量 ∶梔子苷的質量為2(V∶m).通過反應液中梔子藍的色價與反應所需梔子苷的濃度比值對正交實驗進行分析.

表3 梔子藍制備條件正交試驗因素水平變化

1.2.4 梔子藍色素的精制

稱取16份10.64 g梔子苷于4個500 mL三角瓶中，分別加水稀釋到140 g，每瓶中加入1.2.2中的發(fā)酵液9.8 mL，在50 ℃的恒溫搖床內，160～180 r/min的震蕩速率下反應6 h,各加入3.15 g味精，繼續(xù)反應40 h，取出放入80 ℃的恒溫水浴中30 min，反應液合并過濾，得 2 321.5 g濾液，取其中220.00 g在60 ℃和60～70 kPa真空度下濃縮，60～70 ℃和60～70 kPa真空度下干燥得到10.72 g梔子藍色素A(精品).向32 mm×400 mm的層析柱中加入處理好的200 mL DM-2大孔樹脂，加入350.0 g梔子藍濾液，先用400 mL水洗脫，然后用300 mL 65%的乙醇溶液進行脫液.65%的乙醇洗脫液減壓濃縮、干燥得精制梔子藍色素8.10 g，在594.0 nm處測定梔子藍色素的吸光度.

(1)

1.2.5 梔子藍色素清除DPPH·能力的測試

參照文獻[13]，分別取3.0 mL不同質量濃度的梔子藍色素的30%乙醇溶液，與5.0 mL 0.065 mmol/L DPPH·的50%乙醇溶液均勻混合，避光放置20 min，在517 nm處測定其吸光度的變化，以BHT為陽性對照，DPPH·清除率(Kp) 計算方法如下：

Kp=[1-(As-Ar)/A0]×100% .

As為加樣品溶液時的吸光度，A0為用30%乙醇替代樣品溶液時的吸光度,Ar為用50%乙醇替代DPPH·溶液時的吸光度，重復測定3次，取其算術平均值.

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵液制備條件的優(yōu)化

2.1.1 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

液體發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗分析結果見表4～5.由表4～5可以得出，極差值R的大小為麥麩(A)> (NH4)2SO4(B)和KH2PO4(F)>MgSO4·7H2O(E)>CaCl2(C)>ZnSO4·7H2O(D)，最佳配方為3%麥麩，0.3%(NH4)2SO4，0.02% CaCl2，0.6%KH2PO4，0.01 %MgSO4·7H2O，0.01 %ZnSO4·7H2O.以此條件做驗證實驗，測得吸光值為0.476，進一步證實該配方為最優(yōu)配方.

表4 液體發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗L16(46)設計方案及結果

表5 液體發(fā)酵培養(yǎng)基正交試驗L16(46)極差分析

2.1.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

發(fā)酵條件正交試驗分析結果見表6～7.由表6～7可知，極差值R的大小為裝液量(E)>震蕩速度(B)>溫度(A)>發(fā)酵時間(C)>接種量(D).最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度30℃，震蕩速率130～150 r/min，裝液量為30 mL，接種量3%，發(fā)酵時間96 h.以此條件做驗證實驗，測得吸光值為0.511，進一步證實該發(fā)酵條件為最優(yōu)條件.

2.2 梔子藍色素制備條件的優(yōu)化

梔子藍制備條件正交試驗分析結果見表8～9.由表8～9可知，極差值R的大小為震蕩速率(A)>加液量(B)>味精的反應時間(C)>梔子苷的質量濃度(D).最佳條件為震蕩速率160～180 r/min，加液量為30%，味精反應時間40 h，梔子苷濃度3%，以此條件做驗證實驗，梔子藍的色價與反應所需梔子苷的濃度的比值為150.10，進一步證實該制備條件為最優(yōu)條件.

表6 液體發(fā)酵條件正交試驗L16(45)分析結果

表7 液體發(fā)酵條件正交試驗L16(45)極差分析

表8 梔子藍色制備條件正交試驗L9(34)分析結果

表9 梔子藍色制備條件正交試驗L9(34)極差分析

2.3 發(fā)酵液添加量對梔子藍色素生成的影響

按上述制備條件對發(fā)酵液的添加量進行優(yōu)化，發(fā)酵液添加量對梔子藍色素生成的影響(見圖1).由圖1可知，發(fā)酵液的最優(yōu)添加量為0.07mL/g.

2.4 梔子藍色素的精制

采用DM-2大孔樹脂層析柱對梔子藍色素粗品進行精制.精制前梔子藍色素粗品的色價為90.56，經(jīng)過大孔樹脂精制后，梔子藍色素的色價提高到180.01，得率為90.96%.

2.5 梔子藍色素清除DPPH·能力

DPPH·是一種人工合成的穩(wěn)定自由基，分子結構中含有3個苯環(huán)，1個N原子上有1個孤對電子，其乙醇溶液呈紫色，經(jīng)波長掃描，體系的最大吸收波長在517 nm處，因此，實驗選擇517 nm為測定波長.按照1.2.5的測定方法，測得在波長517 nm 處的吸光度越小，樣品清除DPPH·能力越強，樣品的抗氧化能力越強.因而測定試樣對DPPH·清除率可用于簡便、準確地評價其抗氧化能力.圖2是DPPH·法測定梔子藍色素的抗氧化能力實驗結果.圖2表明，梔子藍色素粗品A及精制品B對DPPH·具有較好的清除能力，清除率隨樣品濃度的增加而增大，且梔子藍色素精制品B的DPPH·清除能力比梔子藍色素粗品A的強(梔子藍色素A和B的EC50分別為43.5 μg·mL-1和37.5 μg·mL-1).

3 結語

參考文獻:

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