落花生莖葉生物堿的輻照提取及其定性定量分析

鉏曉艷 李 新 谷 峰 廖 濤 江洪有 耿勝榮

（湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心/湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所/湖北省農(nóng)產(chǎn)品輻照工程技術(shù)中心 武漢 430064）

落花生莖葉為豆科植物落花生屬落花生(Arachis hypogaeaL.)的莖葉，落花生莖葉莖高30?70 cm，匍匐或直立；雙數(shù)羽狀復(fù)葉互生，長圓形至倒卵圓形，長2.5?5.5 cm，寬1.4?3 cm[1]。一直以來，落花生莖葉被丟棄或曬干焚燒，造成相當(dāng)嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境負(fù)擔(dān)。2011年中國落花生播種面積為470萬公頃，總產(chǎn)量約為1620萬噸。大面積的落花生種植為我們提供優(yōu)質(zhì)落花生產(chǎn)品的同時(shí)，也亟需我們?yōu)槁浠ㄉo葉等秸稈農(nóng)副產(chǎn)物找到高值轉(zhuǎn)化的出口。多項(xiàng)研究表明落花生莖葉具有寧神降壓、促進(jìn)睡眠的功效[2-4]，是具有高值轉(zhuǎn)化潛力的農(nóng)副產(chǎn)品。

在落花生莖葉有效物質(zhì)提取技術(shù)方面，傳統(tǒng)用的浸漬法、滲漉法、煎煮法、熱回流提取法等，對植物的天然活性成分破壞很大[5-6]。利用60Co γ-射線輻照技術(shù)輔助提取植物中活性物質(zhì)的文獻(xiàn)報(bào)道很少，相關(guān)專利如公開號(hào) CN101961357A[7]和CN103275136A[8]，發(fā)明人都是采取輻照預(yù)處理植物原料后，再進(jìn)行溶劑提取，該方法不僅操作繁瑣耗時(shí)，且工藝過程需要較高能耗（即較高輻射劑量）。

本研究以落花生莖葉為研究對象，通過用60Co γ-射線輻照源進(jìn)行低劑量常溫輻照與溶劑萃取相結(jié)合的方法促進(jìn)落花生莖葉功能成分的溶出，選擇性地提取目標(biāo)化合物，并通過大孔樹脂進(jìn)行分離純化，獲得落花生莖葉生物堿，并對其進(jìn)行定性定量分析。為落花生莖葉中總生物堿的提取、分離和純化提供了新穎高效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

落花生莖葉，采收于武漢市野芷湖周圍，采收后清洗、晾干、粉碎過40目備用。大孔吸附樹脂HPD100、D-101、AB-8、HPD722、NKA-9、HPD600，鄭州勤實(shí)科技有限公司提供。鹽酸小檗堿（含量≥98%），上海源葉生物科技有限公司提供。膽堿，東京化成工業(yè)株式會(huì)社提供。其他試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

60Co γ-射線輻照源（活度1.11×1016Bq），湖北省輻照實(shí)驗(yàn)中心；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用）；MB99-1液相色譜分離層析儀（上海滬西）；RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮）；KQ3200DB型超聲清洗儀（昆山市超聲儀器）；LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津）。

1.3 方法

1.3.160Co γ-射線輻照源常溫輻照

稱取2 g落花生莖葉粉末置于包裝袋中，加入三氯甲烷80 mL，封口，60Co γ-射線常溫輻照，劑量1?18 kGy（10組劑量），對照組為超聲波法，功率100 W，25 ℃超聲提取2 h。然后抽濾，上清液用三氯甲烷定容至100 mL，取1 mL于25 mL容量瓶中，用三氯甲烷定容，備用。

1.3.2 總生物堿的測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取20 mg鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品，加少量水超聲溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，加水定容至刻度，取1 mL置于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，即得0.04 mg·mL?1標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，加三氯甲烷至5 mL，加入溴甲酚綠緩沖液和0.2 mol·L?1NaOH溶液各1 mL，振搖1min，靜置30 min，取澄清的三氯甲烷液在415 nm波長處進(jìn)行測定。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品的測定：取待測液1.0 mL，加三氯甲烷至5 mL，加溴甲酚綠緩沖液和0.2 mol·mL?1NaOH溶液各1 mL，振搖1 min，靜置30 min，取澄清的三氯甲烷液，以空白做參比，415 nm處測其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算其濃度?？偵飰A含量(%)按公式(1)計(jì)算。

公式1中，c為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的生物堿濃度(mg·mL?1)；b為稀釋倍數(shù)；v為待測液總體積；m為樣品質(zhì)量。

1.3.3 樹脂靜態(tài)吸附率測定

稱取預(yù)處理過的6種樹脂各4.0 g裝入100 mL容量瓶中，按40（大孔吸附樹脂，g）:1（生物堿，g）加入生物堿0.1 g，用50 mL甲醇溶解后置于振蕩器上振蕩，加快樹脂吸附。振蕩1 h放置48 h后，測定溶液中生物堿在最大吸收波長處的吸光度變化，靜態(tài)吸附率(%)計(jì)算見公式2。

公式2中，A0為吸附前溶液中生物堿吸光度；A為吸附后溶液中生物堿吸光度。

1.3.4 洗脫劑的篩選

輻照后的樣品，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除氯仿，分別加入60%、70%、80%甲醇和60%、70%、80%、95%乙醇于離心管中，置于超聲儀中，25 ℃下超聲2 h后離心(3000 r·min?1，10 min)。取樣品上清液各0.5 mL于離心管中，稀釋20倍至10 mL，取1 mL稀釋液加三氯甲烷至5 mL，加入溴甲酚綠緩沖液和0.2 mol·L?1NaOH溶液各1 mL，搖勻后進(jìn)紫外分光光度計(jì)進(jìn)行200?800 nm的全波長掃描（參比液為各分離劑稀釋液），以吸光值來選擇洗脫劑。

1.3.5 大孔樹脂純化

裝柱、上樣和洗脫：取潔凈層析柱（規(guī)格：40 cm× 1.6 cm)，用玻璃棒將AB-8與95%乙醇（超聲除氣泡）混合物分多次導(dǎo)流入層析柱，避免出現(xiàn)氣泡。樹脂預(yù)處理：裝柱后靜置2 h，用蒸餾水淋洗過夜，至洗出液無乙醇味，且洗出液與乙醇混合后無渾濁。取生物堿粗分離物，用0.5 mol·L?1HCL溶解后定容至100 mL，再用NaOH調(diào)pH為10.5后上樣，上樣后靜置2 h。考慮到蒸餾水與60%甲醇(pH=2.7)之間的過渡，我們采用20% 甲醇(pH=7.0)、40% 甲醇(pH=7.0)、60% 甲醇(pH=4.0)、60% 甲醇(pH=3.5)、60%甲醇(pH=2.7)各100 mL進(jìn)行梯度洗脫。

接樣及檢測：在恒流泵流速600，自動(dòng)接收器接收間隔2 min 35 s/試管的情況下進(jìn)行洗脫，洗脫液用小管收集后加入溴甲酚綠緩沖液和0.2 mol·L?1NaOH溶液，進(jìn)行全波長掃描檢測。合并峰值較高的檢測液，即為純化后的生物堿，凍干備用。

1.3.6 落花生莖葉生物堿定性定量分析

對照品溶液制備：取膽堿對照品適量，精密稱定，配制成濃度為1.5、3、6、12、24 mg·mL?1的溶液，0.45 μm微孔過濾膜濾過。

供試品溶液制備：取200 mg凍干后的落花生莖葉生物堿粉末，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入1%鹽酸甲醇10 mL，超聲處理（功率100 W，溫度25 ℃）60 min，放冷，用1%鹽酸甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，0.45 μm微孔過濾膜濾過，取續(xù)濾液。

色譜條件：色譜柱：C18柱(250 mm×4.60 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈：0.05 mol·L?1磷酸二氫鉀（用磷酸調(diào)節(jié)pH=2.8）=1:1（內(nèi)含0.015 mol·L?1己烷基磺酸鈉）；流速：1 mL·min?1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；檢驗(yàn)波長：304 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同吸收劑量對生物堿提取效果的影響

根據(jù)總生物堿標(biāo)準(zhǔn)曲線y=17.834x+0.0006，(R2=0.9999)計(jì)算樣品中生物堿含量。由圖1可知，總生物堿的含量隨著吸收劑量的增加，先上升后下降；在吸收劑量為 5 kGy時(shí)達(dá)到最高(7.970±0.117)%，與超聲波法提取結(jié)果(1.485±0.061)%相比，統(tǒng)計(jì)差異非常顯著（t檢驗(yàn)，p＜0.001）；吸收劑量高于5 kGy后，總生物堿含量有所下降。這可能因?yàn)?，高能射線作用于溶劑三氯甲烷和體系中的水，產(chǎn)生Cl·、OH·和H·等自由基,與物質(zhì)作用發(fā)生降解、聚合或氧化等反應(yīng)。吸收劑量較小時(shí)以降解反應(yīng)為主，自由基與植物細(xì)胞壁中的纖維素和半纖維素反應(yīng)，使之解離，促進(jìn)植物細(xì)胞中生物堿的溶出，因此總生物堿含量上升。吸收劑量增大后，以聚合反應(yīng)為主，堿基間相互結(jié)合形成新的物質(zhì)，同時(shí)自由基與溶出的生物堿反應(yīng)形成醛、酮類物質(zhì)的氧化作用也存在，從而總生物堿含量下降；輻射劑量進(jìn)一步加大，聚合反應(yīng)和氧化反應(yīng)程度增加，生物堿含量則進(jìn)一步降低[9-10]。該結(jié)果表明常溫低劑量輻照，可促進(jìn)落花生莖葉溶液中功能物質(zhì)的溶出。

圖1 超聲波法與吸收劑量對生物堿提取效果的影響Fig.1 Effect of ultrasonic method and absorbed dose on total alkaloid yield(***, p＜0.001)

2.2 大孔樹脂種類對生物堿靜態(tài)吸附率的影響

大孔吸附樹脂是一種不含交換基團(tuán)的高分子吸附劑，由于所選用的單體分子結(jié)構(gòu)不同，大孔樹脂的極性也不同[11-13]。在本研究中我們選擇了極性、非極性、弱極性共6種大孔樹脂進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，樹脂的物理結(jié)構(gòu)參數(shù)及其吸附結(jié)果見表1。由表1可知，NKA-9的靜態(tài)吸附率較低，其它各種樹脂的差別不大。靜態(tài)吸附1 h，AB-8吸附后溶液在323 nm處靜態(tài)吸附率最高，生物堿吸附效果最好；靜態(tài)吸附48 h，波長323 nm處吸收峰消失，波長415 nm處，AB-8靜態(tài)吸附后溶液的吸附率依然最高，效果最好。結(jié)果表明，AB-8適合于分離純化生物堿類物質(zhì)，故選擇AB-8樹脂為下一步層析用樹脂。

表1 不同大孔樹脂對應(yīng)的生物堿靜態(tài)吸附率Table 1 Static adsorption rate of alkaloids by using different macroporous resin

2.3 不同洗脫液對生物堿紫外吸收峰的影響

根據(jù)圖2(A)和圖2(B)的結(jié)果，以甲醇和乙醇為洗脫液，最大吸收峰的波長集中在303?336 nm。60%甲醇或者70%乙醇為洗脫液時(shí)獲得落花生莖葉總生物堿的吸光值較高，說明其洗脫效果較好，我們采用60%甲醇進(jìn)行下一步提純。此外從圖2B可以看出，生物堿的吸收波長除了在303?336 nm外，在415 nm處也有吸收峰，雖然氯仿作為提取劑其吸收波長也為415 nm，但氯仿的毒性較大，所以在生物堿的洗脫純化時(shí)不采用。

2.4 生物堿洗脫曲線及吸收峰

通過結(jié)晶法純化生物堿，將含落花生莖葉生物堿的的甲醇溶液定量取出并減壓蒸干后，殘留物用0.5 mol·L?1的HCl溶解后，轉(zhuǎn)至分液漏斗，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至10.5，將溶液移入裝有樹脂的層析柱，然后洗脫。由圖3結(jié)果可知，在15 min和30 min處分別有2個(gè)洗脫峰，表明含有兩種生物堿或一種生物堿的兩種異構(gòu)體。60 min后的洗脫產(chǎn)物曲線峰值很小，即生物堿含量很少，所以忽略不計(jì)。根據(jù)圖4結(jié)果，落花生莖葉生物堿的最大吸收峰分別集中在330 nm和304 nm處。

圖4 落花生莖葉生物堿在不同洗脫時(shí)間段的吸收峰Fig.4 Absorption peaks of AHSL alkaloids eluted in different time periods

2.5 落花生莖葉中生物堿的HPLC檢測結(jié)果

生物堿種類龐多，但鮮有關(guān)于落花生莖葉生物堿的研究報(bào)道，因此課題組在實(shí)驗(yàn)初期選擇了鹽酸小檗堿、花生堿、甜菜堿及膽堿進(jìn)行高效液相色譜比對分析。結(jié)果顯示，純化后的樣品中鹽酸小檗堿、花生堿、甜菜堿等成分的含量甚微，但含有膽堿。圖5為膽堿標(biāo)品、落花生莖葉生物堿HPLC色譜圖及膽堿純度視圖。

由圖5A，膽堿標(biāo)品在色譜上呈現(xiàn)兩個(gè)峰，可能為膽堿的異構(gòu)體。出峰保留時(shí)間為2.152 min和2.987 min。由圖5B，落花生莖葉生物堿出峰保留時(shí)間為2.095 min和2.980 min，與圖3中兩個(gè)洗脫峰的結(jié)果相符；且與膽堿標(biāo)品HPLC色譜峰峰形及保留時(shí)間一致（允許變化5%），可判定為膽堿類物質(zhì)。

圖5 膽堿標(biāo)品(A)、落花生莖葉生物堿(B)HPLC色譜圖及膽堿純度視圖(C)Fig.5 Choline standard (A), Arachis hypogaea L.stem and leaf alkaloids (B) and HPLC chromatogram purity view (C)

根據(jù)膽堿標(biāo)準(zhǔn)曲線y=6923.5x+17059，R2=0.9995（線性范圍：0.75?24 mg·mL?1)可知，通過結(jié)晶法和大孔樹脂法純化的落花生莖葉膽堿的純度可達(dá)99.99%，得率約為2.61 g·kg?1花生莖葉。由圖5C可知膽堿在波長304 nm處，峰純度最高，樣品檢測波長進(jìn)一步確定。

3 結(jié)論

60Co γ-射線輻照法比超聲波法提取的落花生莖葉生物堿含量高，在吸收劑量為5 kGy時(shí)總生物堿含量可達(dá)(7.970±0.117)%。在生物堿純化方面，大孔樹脂AB-8的純化效果較好，洗脫溶媒為60%甲醇時(shí)洗脫效果較好，通過結(jié)晶法和大孔樹脂法純化，可使生物堿純度達(dá)99.99%以上。落花生莖葉生物堿中鹽酸小檗堿、花生堿、甜菜堿等成分含量甚微，主要為膽堿，其含量約為2.61 g·kg?1花生莖葉。該方法提取制備純化落花生莖葉生物堿效果好，工藝新穎高效，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。

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