硼中子俘獲技術(shù)對(duì)普通小球藻生長(zhǎng)的影響

郝 昕 譚志新 童永彭 張永夏 羅 奇 李西妮 陳琳琳 張 瑤（深圳大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 深圳 58060）

2（深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 深圳 518060）

硼中子俘獲技術(shù)對(duì)普通小球藻生長(zhǎng)的影響

郝 昕1譚志新1童永彭1張永夏2羅 奇1李西妮2陳琳琳2張 瑤21（深圳大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 深圳 518060）

2（深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 深圳 518060）

利用硼中子俘獲技術(shù)對(duì)普通小球藻進(jìn)行輻照，研究輻照中子通量和時(shí)間對(duì)小球藻生長(zhǎng)效應(yīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)闹凶油?7.5×108-7.5×109cm-2·s-1)和時(shí)間(30-60 s)的輻照，小球藻在多代以后的生長(zhǎng)速率、葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)Fv/Fm、產(chǎn)量、葉綠素含量和脂肪酸含量均顯著提高，但是蛋白質(zhì)含量顯著降低。由此表明硼中子俘獲技術(shù)對(duì)小球藻可遺傳物質(zhì)產(chǎn)生了影響，對(duì)于選育高產(chǎn)藻株具有促進(jìn)作用。

硼中子俘獲，普通小球藻，輻照效應(yīng)

隨著人們不斷地開(kāi)采利用，化石能源逐漸面臨枯竭，各國(guó)研究者開(kāi)始在世界范圍內(nèi)尋找可替代能源，能源植物以其安全、環(huán)保、可再生和低成本等特點(diǎn)吸引了人類(lèi)的注意[1]。小球藻在自然界分布廣泛，具有廣闊的開(kāi)發(fā)利用前景，是一種有重要意義的藻類(lèi)，它既能利用光能自養(yǎng)，也可在異養(yǎng)條件下利用有機(jī)碳源進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖[2-5]。小球藻因其比表面積大且光合效率高，生物量大，含有多糖、蛋白質(zhì)、細(xì)胞色素、不飽和脂肪酸和生長(zhǎng)因子等多種豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且具有生長(zhǎng)速度快，易于培養(yǎng)等特點(diǎn)，受到各國(guó)研究者的青睞[6-7]。小球藻作為能源植物的價(jià)值很高，但因品系、培養(yǎng)方式不同而有所差異。

中子輻照能夠改變生物的生理性狀[8-10]。當(dāng)中子與生物體內(nèi)的原子核撞擊后，使原子核激發(fā)并放出β和γ-射線(xiàn)，這些次級(jí)射線(xiàn)的輻射作用產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，可能會(huì)使生物體出現(xiàn)有利的性狀改變。硼化物材料的中子吸收截面高，吸收中子的能量范圍寬，且資源豐富、價(jià)格低，是核反應(yīng)堆常用的中子吸收材料[11]；硼中子俘獲治療也是目前治療惡性腫瘤對(duì)人體傷害較小的方法[12]，而且硼中子俘獲能有效的提高中子對(duì)生物的輻射效應(yīng)。由于本文選用淡水藻種庫(kù)提供的普通小球藻中生長(zhǎng)速度快（每代6-7 h）、蛋白質(zhì)含量高的株系作為出發(fā)株，通過(guò)硼中子俘獲技術(shù)就可能快速篩選出生長(zhǎng)速度快的小球藻株，成為優(yōu)勢(shì)株，多代以后就成為穩(wěn)定的新品種，而其他株逐步被淘汰，本文通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得生長(zhǎng)速度較快、產(chǎn)油量高、且其他生理性狀得到相對(duì)改善的藻株。

1 材料與方法

1.1 試劑

小球藻由中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所淡水藻種庫(kù)提供，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基制成的瓊脂斜面保存。選用的培養(yǎng)基為BG-11培養(yǎng)基[13]，其成分為：檸檬酸 0.3 g、檸檬酸鐵胺 0.3 g、EDTANa20.05 g、NaNO330 g、K2HPO40.78 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、CaCl2·2H2O 1.9 g、Na2CO32 g、H3BO32.86 g、MnCl2·4H2O 1.81 g、 ZnSO4·7H2O 0.222 g、Na2MnO4·2H2O 0.391 g、CuSO4·5H2O 0.079 g、Co(NO3)2·6H2O 0.049 g。各種試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 硼中子俘獲處理

選取藻種中生長(zhǎng)速度快、蛋白質(zhì)含量高的株系作為出發(fā)株，取200 mL藻液，4000 r·min-1離心20 min，棄上清后取藻，置于20 mL濃度為0.1%四硼酸鈉溶液中稀釋、搖勻，然后取1.5 mL于離心管中封裝并輻照。實(shí)驗(yàn)應(yīng)用微型中子源核反應(yīng)堆（深圳大學(xué)核技術(shù)應(yīng)用研究所）進(jìn)行輻照，平均中子能量2 MeV，為提高中子輻照效率，利用硼化物材料中子吸收截面高、吸收中子的能量范圍寬的特點(diǎn)，加入硼酸鹽以俘獲更多中子。實(shí)驗(yàn)選用5種輻射中子通量，分別為7.5×108、1.5×109、7.5×109、1.5×1010和7.5×1010cm-2·s-1，每種中子通量對(duì)應(yīng)5種輻照時(shí)間，依次為30、60、120、300和600 s，共產(chǎn)生25種輻照后樣本，各樣本均為3次平行試驗(yàn)組。

1.2.2 輻照后樣品培養(yǎng)及篩選

輻照后把所有小球藻種植于黑暗處5 h以防光修復(fù)[14]。在無(wú)菌條件下把輻照后的小球藻涂抹到固體培養(yǎng)基上置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h光/暗循環(huán)，溫度25 ℃。以未輻照小球藻作平行對(duì)照。

培養(yǎng)7 d后，通過(guò)觀察篩選幾個(gè)樣品生長(zhǎng)狀況較好的樣品，光譜分析發(fā)現(xiàn)其生長(zhǎng)速率顯著高于其他樣品。將篩選的這幾個(gè)樣品與對(duì)照組樣品從培養(yǎng)基上完全轉(zhuǎn)移到200 mL錐形瓶中（100 mL培養(yǎng)液）繼續(xù)培養(yǎng)，用以測(cè)定下列各項(xiàng)指標(biāo)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)組。

1.2.3 小球藻生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

培養(yǎng)期間，每天檢測(cè)其細(xì)胞密度，制作生長(zhǎng)曲線(xiàn)。細(xì)胞密度的測(cè)定：在一定范圍內(nèi)，藻細(xì)胞密度Cx與波長(zhǎng)540 nm下的光密度值（OD540）呈線(xiàn)性關(guān)系[15-16]，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算細(xì)胞密度：Cx=0.5205OD540（R2=0.9987）。光密度值測(cè)定采用754NPC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海奧譜勒儀器有限公司）測(cè)定。

1.2.4 小球藻葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)Fv/Fm、量子產(chǎn)量的測(cè)定

培養(yǎng)10 d后，測(cè)定以下各參數(shù)。在暗處分別取小球藻培養(yǎng)液1 mL，10 000 r·min-1離心20 min，取上清液并加蒸餾水稀釋100倍后用FMS-2熒光儀（Hansatech公司 英國(guó)）測(cè)定葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)Fv/Fm和量子產(chǎn)量，每組3次重復(fù)，取平均值，測(cè)定溫度25 ℃。

1.2.5 小球藻葉綠素含量的測(cè)定

取0.5 g新鮮小球藻至研缽中，加少量石英砂和碳酸鈣粉及2-3 mL 95%乙醇，研成均漿，過(guò)濾并定容至25 mL，搖勻，得葉綠素提取液。取提取液，在分光光度計(jì)上測(cè)定665 nm和649 nm波長(zhǎng)的吸光值。每組3次重復(fù)。

將測(cè)得吸光值代入下式：Cha=13.95A665-6.88A649；Chb=24.96A649-7.32A665，計(jì)算得到葉綠素a和葉綠素b的濃度(Cha、Chb: mg·L-1)，二者之和為總?cè)~綠素的濃度，代入下式可進(jìn)一步求得小球藻的葉綠素含量：

葉綠素的含量(mg·g-1) = (葉綠素的濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù))/樣品鮮重（或干重）。

1.2.6 小球藻蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

取40 mL藻液，4000 r·min-1離心20 min，棄上清，收集藻細(xì)胞，加入 10 mL磷酸緩沖液(pH=7.0)，再用超聲波破碎10 min，然后，于4 000 r·min-1離心20 min，吸取上清液并轉(zhuǎn)移至試管，收集藻體用于葉綠素含量的測(cè)定。

另取一支具塞試管，加入 0.2 mL小球藻提取液，并加入2 mL蒸餾水和10 mL考馬斯亮藍(lán)G-250，蓋上塞子，搖勻，靜置5 min后，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在波長(zhǎng)為595 nm處的吸光度（OD595）,每組3次重復(fù)3次，取平均值。根據(jù)所測(cè)樣品提取液的吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得相應(yīng)的蛋白質(zhì)含量(μg)，按下式計(jì)算：

樣品中蛋白質(zhì)含量(mg·g-1)=(查得的蛋白質(zhì)含量(μg)×提取液總體積(mL))／(樣品重(g)×測(cè)定時(shí)所用提取液體積(mL))。

1.2.7 小球藻脂肪酸含量的測(cè)定

取50 mL藻液，離心后去上清，得到的小球藻細(xì)胞于80 ℃烘干12 h保存。每個(gè)樣品取100 mg干燥的小球藻用具塞水解管進(jìn)行水解，加入2 mL的CHCl3-CH30H混合液（體積比為 2:1），利用氮吹儀充氮?dú)? min后迅速密閉封口，再將水解管放在超聲波清洗器中超聲萃取30 min，收集上層清液，以上操作重復(fù)3次（重復(fù)時(shí)超聲作用時(shí)間可縮短為10 min)，并將4次的萃取液合并，繼續(xù)用氮?dú)鉂饪s吹干后再加入2 mol·L-1的HC1-CH3OH溶液，再接著充氮?dú)?，迅速密閉封口（為確保氣密性良好，使之與空氣中氧氣隔絕，用聚四氟乙烯材料封閉瓶口后，再擰緊螺帽）。將水解管放入 100 ℃水浴鍋中加熱40 min，使其充分反應(yīng)，待其冷卻后用2 mL正己烷分兩次提取，合并提取液于具塞離心管中，用氮?dú)獯蹈珊?，再加? mL正己烷溶解后，供色譜分析用。

先配制不同濃度的脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)樣品，在一定操作條件下進(jìn)樣，測(cè)定不同濃度脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積，繪出濃度對(duì)峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。進(jìn)行樣品分析時(shí)，在與標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸樣品嚴(yán)格相同的條件下定量進(jìn)樣，試樣經(jīng)毛細(xì)管氣相色譜分離，檢測(cè)結(jié)果由SATURN2200（瓦里安公司，美國(guó)）色譜工作站得到各脂肪酸組分的峰面積，由所得峰面積可以在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查出被測(cè)脂肪酸的含量。每組3次重復(fù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 中子輻照對(duì)小球藻生長(zhǎng)的影響

培養(yǎng)七天后，觀察發(fā)現(xiàn)1-2、2-2、3-1、3-2四個(gè)樣品生長(zhǎng)狀況較好，藻株數(shù)量明顯多于其他樣品，藻株深綠色，光譜分析發(fā)現(xiàn)其生長(zhǎng)速率顯著高于其他樣品（表1）。

未經(jīng)輻照的小球藻作為對(duì)照組，在培養(yǎng)的前3 d生長(zhǎng)較快，此后開(kāi)始變慢，而輻照后的小球藻在培養(yǎng)到第4天后迅速生長(zhǎng)，第9天達(dá)到最大值（圖1）。從圖1中可看出，輻照后的生長(zhǎng)量比出發(fā)株有了較大的提高，樣本3-1增幅最大，提高了28.0%；樣本1-2、2-2、3-2分別提高了13.3%、15.9%、13.6%。這4個(gè)樣本與對(duì)應(yīng)的對(duì)照組在培養(yǎng)第6天以后的光密度值t檢驗(yàn)中具有顯著差異(p＜0.05)。

表1 輻照中子通量和輻照時(shí)間處理樣本編號(hào)Table 1 Neutron irradiation flux and time

圖1 中子輻照對(duì)小球藻光密度值OD540的影響Fig.1 Effects of neutron radiation on OD540value of Chlorella vulgaris

2.2 中子輻照對(duì)小球藻葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

從圖2 A可以看出，出發(fā)株的葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Fv/Fm較低，說(shuō)明其潛在最大光合作用能力并不高，經(jīng)過(guò)中子輻照后，除了2-2有所降低外，其余三株均有了不同程度的提高，其中1-2增幅最大，提高了10.8%，與對(duì)應(yīng)的對(duì)照組t檢驗(yàn)中具有顯著差異(p＜0.05)。說(shuō)明中子輻照對(duì)提高小球藻的潛在光合作用能力有一定的促進(jìn)作用。

從圖2 B可以看出，經(jīng)中子輻照后，樣本3-1激發(fā)出的葉綠素?zé)晒饬孔赢a(chǎn)量較出發(fā)株有所降低，樣本3-2與出發(fā)株相比，沒(méi)有改變。其余兩株藻均有不同程度的提高，其中樣本2-2增加最高，達(dá)到0.35，提高了9.4%；其次為樣本1-2，提高了6.3%。說(shuō)明了在7.5×108和1.5×109cm-2·s-1這兩個(gè)中子通量范圍的輻照適用于藻株，以獲取實(shí)際光合效率高的藻株。

2.3 中子輻照對(duì)小球藻葉綠素含量的影響

從圖2 C中可以看出，出發(fā)株的葉綠素含量為1.1 mg·g-1，經(jīng)過(guò)中子輻照后，除了樣本2-2的葉綠素含量降低了18%，其余3株藻的葉綠素含量都有所提高。其中樣本1-2的含量最高，達(dá)到1.5 mg·g-1，增加了36.4%。樣本1-2、2-2和3-1與對(duì)應(yīng)的對(duì)照組在t檢驗(yàn)中具有顯著差異(p＜0.05)。

圖2 中子輻照對(duì)小球藻葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)Fv/Fm、量子產(chǎn)量、葉綠素含量、蛋白質(zhì)含量和脂肪酸含量的影響（*表示樣本參數(shù)與對(duì)照組有顯著差異）Fig.2 Effects of neutron radiation on chlorophyll fluorescence parameters Fv/Fm,yield, chlorophyll content, protein content asterisks have significant difference with control group) and fatty acid content in Chlorella vulgaris (Those with

2.4 中子輻照對(duì)小球藻蛋白質(zhì)含量的影響

從圖2 D上可以看出，對(duì)照組的蛋白質(zhì)含量為25 μg·g-1，而經(jīng)中子輻照后的蛋白質(zhì)含量較出發(fā)株都有所降低，其中降幅最大的是樣本 3-2，僅為20 μg·g-1，降低了 20%，其次是樣本 1-2，為21 μg·g-1，降低了16%，都與對(duì)應(yīng)的對(duì)照組在t檢驗(yàn)中具有顯著差異(p＜0.05)。

2.5 中子輻照對(duì)小球藻脂肪酸含量的影響

從圖 2 E可以看出，對(duì)照組的脂肪酸含量為10 mg·g-1，經(jīng)中子輻照后，脂肪酸含量都有所提高。樣本2-2增加最多達(dá)到19 mg·g-1，增加了90%，樣本3-1為18 mg·g-1，增加了80%，都與對(duì)應(yīng)的對(duì)照組在t檢驗(yàn)中具有顯著差異(p＜0.05)。

2.6 討論

小球藻是一種具有多方面經(jīng)濟(jì)價(jià)值的天然藻類(lèi),有著巨大的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用潛力，研究者一直致力于篩選具較好相對(duì)性狀的小球藻。硼中子俘獲是一種有效方法，輻照后通過(guò)人工選擇，可以培養(yǎng)出我們所需要的優(yōu)良性狀。本研究結(jié)果表明，中子輻照是一種有效的方法，篩選出了生長(zhǎng)狀況好的藻株為樣本1-2、2-2、3-1和3-2，其生長(zhǎng)速率比對(duì)照藻株都有顯著提高，其中3-1的生長(zhǎng)速率提高最大，達(dá)到了28.0%。我們推測(cè)中子輻照可能提高了細(xì)胞的增殖能力，或激活了與葉綠體合成有關(guān)酶的活性，從而增加葉綠體的含量，提高了藻株的光合作用能力，進(jìn)而提高生長(zhǎng)速率和生物量。而生長(zhǎng)速率得到提高的樣本，其輻照中子通量和輻照時(shí)間都限定在一定的范圍。過(guò)大的中子通量（大于7.5×109cm-2·s-1）和過(guò)長(zhǎng)的輻照時(shí)間（大于60 s）都會(huì)對(duì)細(xì)胞造成永久傷害，降低生長(zhǎng)速率，而過(guò)小的中子通量和過(guò)短的輻照時(shí)間又起不到產(chǎn)生優(yōu)良性狀的作用。有的研究組則采用近紫外光照射提高細(xì)胞增殖能力從而提高生長(zhǎng)速率[17]。

葉綠素的相關(guān)參數(shù)檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，我們對(duì)小球藻生長(zhǎng)速率提高原因的推測(cè)，并不是全部輻照后小球藻的葉綠素含量都是增加的，也就是說(shuō)小球藻生長(zhǎng)速率的提高并不是全部來(lái)自葉綠素的增加引起的光合作用的提高，同樣也不是全部來(lái)自藻細(xì)胞增殖能力的提高，而是兩者皆而有之。

而對(duì)蛋白質(zhì)和脂肪酸的檢測(cè)結(jié)果則顯示輻照后藻株（1-2、2-2、3-1、3-2）的蛋白質(zhì)含量有了不同程度的降低，同時(shí)脂肪含量有不同程度的增加。4個(gè)樣本的蛋白質(zhì)含量分別下降了16%、12%、5%和20%，而脂肪酸的增加幅度則分別為 30%、90%、80%和10%。通過(guò)數(shù)值計(jì)算對(duì)比，我們發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)降低的量并不是全部增加在油脂上，有一些是增加在了其他物質(zhì)上。所以看起來(lái)油脂的增加幅度很大，但是絕對(duì)量增加的并不是很多。我們采用中子輻照的方法對(duì)小球藻脂肪酸含量的提高還很有限，實(shí)驗(yàn)中樣本2-2提高最多達(dá)到了90%，這與異氧條件下培養(yǎng)小球藻脂肪酸含量提高的幅度還有些差距[18]，但進(jìn)一步中子輻照多次誘變將有望獲得更好的小球藻。

3 結(jié)論

我們利用硼中子俘獲技術(shù)對(duì)普通小球藻進(jìn)行輻照，確定使小球藻生長(zhǎng)速率得到提高的輻照中子通量(7.5×108-7.5×109cm-2·s-1)和輻照時(shí)間（30-60 s）的范圍。在適當(dāng)?shù)闹凶虞椪蘸笮∏蛟宥啻院蟮纳L(zhǎng)速率、葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)Fv/Fm、量子產(chǎn)量、葉綠素含量、脂肪酸含量有了不同程度的提高，但是蛋白質(zhì)含量降低。綜合分析發(fā)現(xiàn)，在適當(dāng)劑量的中子輻照下硼中子俘獲技術(shù)能使小球藻的可遺傳物質(zhì)發(fā)生變化，這對(duì)于選取高產(chǎn)藻株具有重要的意義。

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Effects of boron neutron capture on growth of Chlorella vulgaris

HAO Xin1TAN Zhixin1TONG Yongpeng1ZHANG Yongxia2LUO Qi1LI Xini2CHEN Linlin2ZHANG Yao21(College of Physics and Technology, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China)
2(College of Life Sciences, Shenzhen University, Shenzhen 518060, China)

Boron neutron capture was used to treat productive strains of Chlorella and the effects of neutron flux together with radiation time on growth of Chlorella vulgaris were studied. The results showed that the growth rates, chlorophyll fluorescence parameters Fv/Fm, yield, Chlorophyll content, and fatty acid content increased significantly with suitable neutron flux(7.5×108-7.5×109cm-2·s-1) and radiation time(30-60 s), while the protein content significantly decreased. The neutron irradiation could affect the genetic material of Chlorella, which has a positive effect on selecting productive Chlorella strains.

Boron neutron capture, Chlorella vulgaris, Irradiation effect

Q691，TL99DOI: 10.11889/j.1000-3436.2014.rrj.32.060401

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(11375117)、廣東省自然科學(xué)基金(S2012040007496)和深圳市城管局科研項(xiàng)目(201210)資助

郝昕，女，1980年5月出生，2009年在中國(guó)原子能科學(xué)研究院獲博士學(xué)位，現(xiàn)任深圳大學(xué)講師，粒子物理與原子核物理學(xué)專(zhuān)業(yè)，E-mail: haox@szu.edu.cn

童永彭，博士，研究員，E-mail: yongpeng@szu.edu.cn

收稿2014-07-04；修回2014-09-10

CLCQ691, TL99