LIG4和HSPB1基因多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌放療腫瘤退縮率的相關(guān)性

劉 丹 郭根燕 趙玉霞 白 露（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院腫瘤放射治療科 沈陽 003)

2（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤放射治療科 沈陽 110001)

肺癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，已經(jīng)成為全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤[1]。臨床工作中發(fā)現(xiàn)肺癌患者放療后腫瘤退縮程度明顯不同，主要原因在于肺癌的放射敏感性存在很大的個(gè)體差異。DNA是電離輻射的主要靶點(diǎn)，DNA損傷修復(fù)能力的強(qiáng)弱是影響放射敏感性的重要因素，與DNA修復(fù)功能相關(guān)的基因突變、多態(tài)性及表觀修飾均可使放射敏感性出現(xiàn)差異[2]。電離輻射引起的DNA損傷的修復(fù)主要由DNA雙鏈斷裂修復(fù)通路參與[3]。研究發(fā)現(xiàn) LIG4（DNA連接酶4）是DNA雙鏈斷裂修復(fù)通路中一個(gè)重要的修復(fù)因子[4-5]。熱休克蛋白B1(Heat shock protein B1, HSPB1)是熱休克蛋白(Heat shock proteins, HSPs)家族中27×103的小分子熱休克蛋白，在DNA修復(fù)方面起著重要的作用[6]。本研究擬探討HSPB1及LIG4基因單核苷酸多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌放療腫瘤退縮率的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 病例與材料

本研究所有對(duì)象為北方地區(qū)漢族人群，患者之間彼此均無血緣關(guān)系。在簽署知情同意書后，提供外周血標(biāo)本，同時(shí)完成流行病學(xué)調(diào)查。病例來自2009年12月至2011年12月期間，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院的137名原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cell lung cancer, NSCLC)患者，有明確的病理診斷（鱗癌87例，腺癌50例），所有患者行胸部病灶三維適形放射治療(Three-dimensional conformal radiotherapy, 3D-CRT)且具有肺內(nèi)可評(píng)估病灶者，放療前及放療20次后測(cè)量腫瘤大小。

紅細(xì)胞裂解液(3.85 g NH4Cl+0.42 g NaHCO3加雙蒸水至500 mL)；核懸浮液(75 mmol·L?1NaCl、24 mmol·L?1pH=8.0, EDTA)；TE 緩 沖 液(10 mmol·L?1pH=7.5 Tris-HCI、1 mmol·L?1pH=8.0 EDTA )；PCR Taqman 探針及引物（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；Taqman Master Mix（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；Eppendorf BioPhotometer核酸蛋白測(cè)定儀（德國(guó)Eppendoff公司）；低溫離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；移液器（法國(guó)Gilson公司）；96孔板及蓋膜（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；ABI 7500熒光定量PCR儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.2 調(diào)查方法

采用統(tǒng)一制定打印的調(diào)查表，由2名培訓(xùn)的調(diào)查員對(duì)病例進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，調(diào)查內(nèi)容包括每個(gè)研究對(duì)象詳細(xì)的人口學(xué)資料、吸煙史、組織類型、臨床表現(xiàn)和伴發(fā)疾病等。非吸煙者指終生吸煙少于100支的個(gè)體。所有參與研究的個(gè)體外周血標(biāo)本采集使用枸櫞酸鈉抗凝試管，每人采血2 mL，在?20 ℃到?80 ℃的冰箱中凍存。腫瘤放射治療方案采用三維適形治療，放療單次劑量2 Gy，5次/周，總劑量(Total dose,DT)達(dá)到40 Gy/20次/4周后重新CT定位，觀察腫瘤消退情況，重新制定放療計(jì)劃，單次劑量改為2.5 Gy，5次/周，共8次，使腫瘤DT達(dá)到60 Gy。腫瘤體積用放射治療計(jì)劃系統(tǒng)計(jì)算，放療前腫瘤體積(Vpre)，放療40 Gy后的腫瘤體積(Vmid)。用下面的公式計(jì)算腫瘤體積退縮率(R)。

所有調(diào)查資料、臨床資料經(jīng)反復(fù)檢查、核對(duì)和編碼后，用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

采用酚-氯仿法集中進(jìn)行基因組DNA提取，提取后測(cè)OD值確定DNA的原始濃度，再倍比稀釋到30?100 ng·μL?1的終濃度備用。采用Taqman real-time PCR方法進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性的基因分型?；蚍中驮贏BI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；92 ℃變性30 s，60 ℃退火以及延伸1 min；共47個(gè)循環(huán)。以SDS（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）軟件 Allelic Discrimination程序進(jìn)行終點(diǎn)分析，通過檢測(cè)不同等位基因所標(biāo)記的FAM和VIC熒光強(qiáng)度，判斷待測(cè)樣本的基因型。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)比較用t檢驗(yàn)和方差分析，p＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 非小細(xì)胞肺癌病例的一般特征

137例患者，平均年齡60.1±5.33歲，腫瘤平均退縮率為0.3474±0.1910，鱗癌87例，腺癌50例，男102例，女35例，Ⅰ期9例，Ⅱ期26例，Ⅲ期70例，Ⅳ期32例。吸煙95例，吸煙者放療腫瘤退縮率明顯高于非吸煙者，分別為0.3755±0.1775和0.2840±0.2068，t=2.643，p=0.009。性別、病理類型及臨床分期與放療腫瘤退縮率無關(guān)，具體見表1。

表1 非小細(xì)胞肺癌病例的一般特征與放療腫瘤退縮率關(guān)系Table 1 The relationship between general character and the ratio of tumor-decreased-size

2.2 LIG4及HSPB1基因單核苷酸多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌放療腫瘤退縮率的關(guān)系

LIG4rs1805388的CC、CT和TT基因型放療腫瘤退縮率分別是0.3395±0.1802、0.342±0.2106和0.5038±0.1892，經(jīng)方差分析，F(xiàn)=2.142，p=0.121，3種基因型腫瘤退縮率無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但經(jīng)LSD兩兩比較發(fā)現(xiàn)，TT基因型腫瘤退縮率明顯高于CC基因型，p= 0.041。HSPB1rs2868371 GG、CG和CC基因型放療腫瘤退縮率分別是0.3454±0.1932、0.3487±0.1998和0.3487±0.1652，經(jīng)方差分析和LSD兩兩比較，未發(fā)現(xiàn)3種基因型之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見表2）。

表2 LIG4和HSPB1基因單核苷酸多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌放療腫瘤退縮率的相關(guān)性Table 2 The relationship among genetic single nucleotide polymorphisms of LIG4 and HSPB1 and the ratio of tumor-decreased-size

3 討論

吸煙是肺癌的主要危險(xiǎn)因素，其中男性的歸因風(fēng)險(xiǎn)為80%，女性的歸因風(fēng)險(xiǎn)為45%[7]。非小細(xì)胞肺癌中鱗狀細(xì)胞癌與吸煙狀況密切相關(guān)[8]。放射生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)鱗狀細(xì)胞癌的放射敏感性高于腺癌細(xì)胞。我們的研究得出吸煙者放療腫瘤退縮率明顯高于非吸煙者，p=0.009，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前還未見吸煙與非小細(xì)胞肺癌放療腫瘤退縮率相關(guān)的其他報(bào)道，我們的研究結(jié)果有待大樣本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

非同源末端鏈接(Non-homologous end joining,NHEJ)修復(fù)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中DNA雙鏈斷裂(DNA double-strand breaks, DSBs)修復(fù)的主要途徑。DNA 連接酶 IV及 X-射線修復(fù)交叉互補(bǔ)基因均為NHEJ 修復(fù)通路中的重要基因[9]，影響著腫瘤細(xì)胞DNA 損傷后的修復(fù)能力及腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性[10]。NHEJ修復(fù)主要是通過DNA依賴蛋白激酶(DNA dependent proteinkinase, DNAPK)和XRCC4-LIG4連接復(fù)合體共同完成的[11]。既往的研究[12-13]顯示，XRCC4-LIG4連接復(fù)合體功能喪失嚴(yán)重影響DNA斷裂雙鏈的再連接，增強(qiáng)放射敏感性。DNA連接酶4綜合癥是一種罕見的先天性疾病，因LIG4基因突變導(dǎo)致患者對(duì)放射線極度敏感[14]。我們的研究顯示LIG4rs1805388的CC、CT和TT基因型放療腫瘤退縮率分別是0.3395±0.1802、0.342±0.2106和0.5038±0.1892，兩兩比較發(fā)現(xiàn)，TT基因型腫瘤退縮率明顯高于CC基因型。從我們的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可推論出攜帶LIG4rs1805388TT基因型非小細(xì)胞肺癌患者放療后腫瘤退縮率高，提示對(duì)放療敏感。但這仍需要大量的實(shí)驗(yàn)研究去驗(yàn)證。

熱休克蛋白B1，又稱熱休克蛋白27，是小分子熱休克蛋白(sHSP)亞家族的重要一員。Hsp27蛋白可以通過多種途徑影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，包括維持細(xì)胞骨架的正常結(jié)構(gòu)而保證細(xì)胞正常生長(zhǎng)和存活、調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)谷胱甘肽水平進(jìn)而提高細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的敏感度[15-16]、抑制內(nèi)源性和外源性細(xì)胞凋亡通路、參與DNA損傷的修復(fù)等。研究顯示HSPB1通過下調(diào)炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)放射線抵抗力[17-18]。Zhang等[19]研究顯示鼻咽癌細(xì)胞中HSPB1表達(dá)上調(diào)，增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞對(duì)放射線抵抗力。Guo等[20]研究顯示HSPB11271C 等位基因可通過下調(diào)HSP27表達(dá)降低DNA修復(fù)能力，增加肺癌細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性。我們研究結(jié)果顯示HSPB1rs2868371基因的單核苷酸多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌放療腫瘤退縮率無關(guān)。目前針對(duì)基因的單核苷酸多態(tài)性的研究中，來自不同民族、不同地區(qū)的研究對(duì)象可能得到不同、甚至矛盾的結(jié)果，這可能與遺傳因素的地域性和種族性有關(guān)，還有可能是與樣本含量較小有關(guān)，HSPB1rs2868371位點(diǎn)純合突變率較低，小樣本結(jié)果不能達(dá)到應(yīng)有的統(tǒng)計(jì)效能。所以HSPB1rs2868371單核苷酸多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌放療腫瘤退縮率的關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)吸煙者和LIG4rs180538TT基因型非小細(xì)胞肺癌患者放療腫瘤退縮率高于其他患者，為臨床提高非小細(xì)胞肺癌治療療效提供理論依據(jù)。

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