微小RNAs在乙型肝炎病毒感染中的研究進(jìn)展＊

張 技，李白雪，張傳濤，張權(quán)生，陳 建

（1．成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，成都610072；2．成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都610075）

目前，全球估計(jì)有20億人口遭受過乙型肝炎病毒（hepatitis B vir us，HBV）的感染，3．5億以上人口患有慢性肝臟感染疾病［1］。HBV感染引起的急慢性肝炎，嚴(yán)重威脅著人類的健康，并阻礙了社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及社會的和諧穩(wěn)定。但到目前為止，尚無藥物能夠達(dá)到理想的抗病毒效果或徹底清除病毒。因此，迫切需要研究和開發(fā)新的抗HBV的策略及方法。

微小RNA（micro RNAs，mi RNAs）在轉(zhuǎn)錄后對基因表達(dá)起到負(fù)性調(diào)控作用，進(jìn)而影響到相關(guān)信號通路。目前的研究已經(jīng)證實(shí)，mi RNAs作用非常廣泛，在器官增殖分化、個體發(fā)育、物質(zhì)代謝等生理過程，以及病毒感染、腫瘤發(fā)生等病理過程中均發(fā)揮了重要作用［2］?；趍i RNAs對機(jī)體能夠發(fā)揮廣泛作用，以及目前HBV感染在臨床治療中的局限性，針對mi RNAs在HBV感染中的作用機(jī)制、作用靶點(diǎn)、作用效應(yīng)等成為了目前研究的熱點(diǎn)之一。

1 mi RNAs簡介

mi RNAs是一類長度約為22個核苷酸的小分子、非編碼單鏈RNA，在動植物以及部分病毒中存在［3］。人類基因組中，用于編碼mi RNAs的序列約有2%［4］，保守估計(jì)編碼蛋白質(zhì)的基因60%以上受到mi RNAs的調(diào)控［5］。在細(xì)胞核內(nèi)，mi RNAs編碼序列轉(zhuǎn)錄生成的pri-mi RNAs，接著經(jīng)過RNaseⅢDrosha和雙鏈RNA結(jié)合蛋白Pasha的加工，形成3′端含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-mi RNAs；接著pre-mi RNAs在蛋白Exportin-5等的攜帶下進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，在Dicer酶等的加工下成為成熟的mi RNAs；成熟的mi RNAs與蛋白Argonaute等結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物（RISC），再由RISC與靶mRNA結(jié)合而發(fā)揮作用［6-7］。其作用形式主要有3種：（1）當(dāng)mi RNAs與靶mRNA完全互補(bǔ)配對時，常會引起靶mRNA的降解；（2）而當(dāng)mi RNAs與靶mRNA不完全配對時，則會抑制以mRNA為模板翻譯生成蛋白質(zhì)的過程；（3）此外，有的mi RNAs還兼具有上述2種作用形式［3］?？偟膩碚f，mi RNAs通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)水平，進(jìn)而影響到細(xì)胞分化、增殖、凋亡等過程，從而在個體的生長發(fā)育和疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

2 mi RNAs與HBV感染

HBV感染引起的急、慢性HBV嚴(yán)重威脅人類健康，而目前臨床上以重組干擾素和核苷酸類似物為主要治療手段的療效并不理想。mi RNAs能夠?qū)Π谢虮磉_(dá)發(fā)揮調(diào)控作用，這使其成為HBV感染研究領(lǐng)域的一個新熱點(diǎn)。2011年的研究顯示，在HBV感染宿主后，并沒有發(fā)現(xiàn)HBV基因組編碼的mi RNAs［8］，但發(fā)現(xiàn)宿主細(xì)胞mi RNAs及宿主的免疫應(yīng)答會發(fā)生一些改變，這些研究為揭示HBV作用于宿主的分子機(jī)制提供了新思路，并可以通過該思路來探尋治療HBV感染的新靶點(diǎn)、新方法。

2．1 HBV編碼的mi RNAs 病毒基因組自身可以編碼mi RNAs，用于對抗宿主的抗病毒反應(yīng)［9］。有研究者于2004年首次報(bào)道EB病毒組編碼了5條mi RNAs［10］。目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些人乳頭瘤病毒、皰疹病毒、多瘤病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等病毒基因組能夠編碼mi RNAs［11］。然而，在HBV感染宿主后，并未發(fā)現(xiàn)HBV基因組編碼的mi RNAs。為研究HBV基因組編碼的mi RNAs，Jin等［12］利用計(jì)算機(jī)分析軟件發(fā)現(xiàn)一種備選的pre-mi RNA，并推導(dǎo)出成熟的mi RNA，但發(fā)現(xiàn)該mi RNA對任何一個宿主細(xì)胞的翻譯過程都沒有抑制作用，但對一種病毒自身的mRNA發(fā)揮作用，從而推測HBV利用自身mi RNAs調(diào)節(jié)自身基因的表達(dá)。Lam等［13］在假設(shè)HBV傳染性的產(chǎn)生是由于病毒自身編碼的mi RNAs或影響宿主細(xì)胞的mi RNAs前提下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但在Hep G 2．2．15細(xì)胞系中并未發(fā)現(xiàn)HBV基因組編碼的mi RNAs。

2．2 宿主細(xì)胞mi RNAs與HBV感染 既然在HBV基因組編碼的mi RNAs對宿主感染的作用方面，研究并沒有太大突破，那對于宿主細(xì)胞自身編碼的mi RNAs在HBV感染后的變化情況又是如何呢？宿主細(xì)胞編碼的mi RNAs通過多條途徑發(fā)揮作用，它有可能作用于異己基因（如侵入的病毒），也有可能作用于宿主細(xì)胞自身的基因，起到抑制異己繁殖，穩(wěn)定自身內(nèi)環(huán)境的作用。因此，目前HBV感染宿主細(xì)胞后引起宿主細(xì)胞mi RNAs的變化情況是一個研究熱點(diǎn)。2011年，Wu等［14］首次報(bào)到了人類mi RNAs能夠?qū)BV的關(guān)鍵基因發(fā)揮作用，實(shí)驗(yàn)利用4種可靠的目標(biāo)預(yù)測軟件對mi RNAs進(jìn)行篩選，最終發(fā)現(xiàn)mi R-7、mi R196b、mi R433和mi R511對HBV的聚合酶或S基因起作用，mi R205對X基因發(fā)揮作用，mi R345對pre-C基因發(fā)揮作用。Wang等［15］對肝細(xì)胞中濃度最多的mi RNA——mi R-122進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)和健康人相比，HBV感染者肝細(xì)胞內(nèi)mi R-122的表達(dá)量明顯下降，并且其表達(dá)水平的高低與肝內(nèi)病毒載量和肝臟嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)；進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因在于HBV感染引起的mi R-122下調(diào)，繼而下調(diào)細(xì)胞周期蛋白G1（cyclin G1）的表達(dá)，從而阻斷了cyclin G1與p53之間的相互聯(lián)系，解除了p53對HBV復(fù)制的抑制作用，同時這一作用機(jī)理可能與HBV持續(xù)感染及癌變有關(guān)。Xu等［16］在小鼠肝細(xì)胞性肝癌（HCC）模型中發(fā)現(xiàn)，HBx可抑制mi R-148a的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。mi R-15a和mi R-16-1是2種重要的對人類腫瘤起抑制作用的mi RNAs，Wang等［17］發(fā)現(xiàn)在mi RNAs和HBV感染的相互作用中，mi R-15a／mi R-16-1起到了關(guān)鍵作用，同時意外發(fā)現(xiàn)HBx的轉(zhuǎn)錄本通過mi RNA作用于病毒RNA序列，直接引起了mi R-15a／mi R-16-1的下調(diào)，從而考慮對腫瘤有明確抑制作用的mi RNAs受到病毒RNA的調(diào)節(jié)而下調(diào)，這可能會影響HBV感染引起的HCC的轉(zhuǎn)歸。HBV感染后，宿主細(xì)胞mi RNAs變化情況的研究，以及兩者之間相互作用關(guān)系的研究，在不斷地深入進(jìn)行，以期能找到治愈HBV感染的突破口。

2．3 外源性mi RNAs與HBV感染 RNA干擾作為一種潛在的抗病毒治療途徑，已有大量的研究報(bào)道。過去的研究主要針對小干擾RNA進(jìn)行，而近年來，利用mi RNAs介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，將針對靶基因的外源性人工合成的mi RNAs導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，從而起到抑制靶基因作用的研究，也有了大量報(bào)道［18］。Gao等［19］利用Invitrogen公司的mi RNAs設(shè)計(jì)軟件，針對HBV S區(qū)設(shè)計(jì)了特異的mi RNA表達(dá)序列，并構(gòu)建了3個人工mi RNA（ami RNA）-HBV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hep G 2．2．15細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)HBV的復(fù)制和表達(dá)均受到了該ami RNAs的抑制，提示針對靶基因設(shè)計(jì)的ami RNAs有可能成為治療慢性HBV感染的一種潛在方法。Pu等［20］針對病毒保護(hù)區(qū)域，分別構(gòu)建了含 獨(dú) 立 序 列ami RNA-HBV1、ami RNA-HBV2、ami RNAHBV3、ami RNA-HBV4的4個載體，以及1個含串聯(lián)序列ami RNA-HBV3-HBV4的載體，分別轉(zhuǎn)染Hep G 2．2．15細(xì)胞株，結(jié)果顯示他們對HBV mRNA表達(dá)的抑制率分別為29．3%、14．9%、61．2%、75．6%和87．2%，也提示a mi RNAs可能成為治療慢性HBV感染的一種方法。

3 展 望

mi RNAs作為一種新近發(fā)現(xiàn)的非編碼微小RNA，拓展和豐富了非編碼RNA在基因表達(dá)中所起的作用。真核細(xì)胞中大量存在的mi RNAs，在基因表達(dá)的調(diào)控中發(fā)揮了重要作用，這是對經(jīng)典中心法則的補(bǔ)充和完善。mi RNAs通過引起靶基因沉默，進(jìn)而影響到相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路，影響個體的生理生化過程。因此，mi RNAs在個體生長發(fā)育、疾病發(fā)生發(fā)展等過程中扮演了重要的角色。HBV感染宿主細(xì)胞后，病毒基因組雖未產(chǎn)生病毒mi RNAs，但是病毒的感染引起了宿主細(xì)胞相關(guān)mi RNAs的變化，已有大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)宿主細(xì)胞mi RNAs的改變影響到了乙型肝炎的轉(zhuǎn)歸。基于此改變，研究者也將ami RNAs應(yīng)用于HBV感染的研究中，期望找到治療HBV感染的新靶點(diǎn)。

雖然，mi RNAs在HBV感染中已經(jīng)有了大量的研究成果，但mi RNAs表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，多個mi RNAs對同一靶基因的調(diào)控模式，mi RNAs在不同信號傳導(dǎo)通路的作用情況，以及ami RNAs的引入對正常宿主細(xì)胞的影響等問題，還有待進(jìn)一步研究解決。mi RNAs在HBV感染中的研究結(jié)果，已經(jīng)向人們展示出mi RNAs在治療HBV感染中有著良好的應(yīng)用前景。相信隨著對mi RNAs研究的進(jìn)一步深入，將有助于對HBV引起的急慢性肝炎的分子機(jī)制的深入認(rèn)識，并為乙型肝炎的治療提供新的治療靶點(diǎn)及治療模式，為乙型肝炎的治愈帶來新希望。

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