便攜式定量熒光免疫分析儀

謝夢圓,張 軍,谷 穩(wěn)，陳 哲，余健輝

(1.光電信息與傳感技術(shù)廣東普通高校重點實驗室(暨南大學(xué))，廣東廣州 510632；2.暨南大學(xué)光電工程系，廣東廣州 510632)

0 引言

C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)是炎癥患者血清中最常見的一種非抗體性蛋白質(zhì)，通常健康人體中CRP濃度小于10 mg/L，然而在急性創(chuàng)傷、感染或其他炎癥刺激反應(yīng)后會快速增高幾百倍[1-2]。常規(guī)CRP檢測方法可在感染時檢測出CRP>10 mg/L的濃度，若使用高敏感度分析法則可測得低濃度(0.1～10 mg/L)的CRP，稱為hs-CRP(High-sensitivity CRP)。近年來許多研究表明，hs-CRP在健康者未來發(fā)生心血管疾病風(fēng)險的評估上，是個獨立且強有力的預(yù)測指標[3-10],其危險程度一般按照hs-CRP濃度<1 mg/L，1～3 mg/L，>3 mg/L由低到高分成3個等級[11-12]。在臨床檢測中，hs-CRP的檢測精度達到0.3 mg/L即可接受，而檢測穩(wěn)定性C.V值應(yīng)小于10%[13]。文中所研制的便攜式定量熒光免疫分析儀采用熒光免疫分析技術(shù)與免疫層析技術(shù)相結(jié)合的檢測方法，可以對人體血液中的CRP濃度進行高靈敏度的熒光定量檢測，線性檢測范圍為1.00～27.00 mg/L，檢測重復(fù)性好，儀器技術(shù)指標適用于臨床免疫檢測。

1 檢測原理

該分析儀采用側(cè)向?qū)游?、熒光示蹤技術(shù)進行檢測。測試過程中，首先將檢測緩沖液(被熒光標記物標記的CRP抗體1)和血液樣本混合，檢測緩沖液中的CRP抗體1和血液中的CRP(抗原)反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物。當混合物樣本被滴入試紙條的滴樣孔內(nèi)后，會迅速通過毛細作用在試紙條上泳動，CRP抗原抗體復(fù)合物被固定在檢測帶上的CRP抗體2所捕獲，富集或截留在試紙條的檢測帶上，而游離的熒光標記物則會越過檢測帶富集在控制帶處。血液樣本中的CRP越多，檢測帶上的復(fù)合物積聚得越多，檢測帶上熒光物質(zhì)的含量與CRP濃度有一定的對應(yīng)關(guān)系。經(jīng)定量熒光免疫分析儀掃描后，如果待測樣本溶液中CRP含量低，則掃描處理后所得的熒光強度曲線如圖1(a)所示；若待測樣本溶液中CRP含量高，則掃描處理后所得的熒光強度曲線如圖1(b)所示。經(jīng)特定算法分析計算后得到一個無量綱的比值，參照標準濃度曲線就可以得到待測樣本溶液的CRP濃度。

(a)

(b)圖1 儀器檢測原理

2 系統(tǒng)設(shè)計

便攜式定量熒光免疫分析儀的總體方案是基于會聚光束掃描試紙條的檢測方式進行設(shè)計的。以MSP430 F1611微處理器為核心，外圍系統(tǒng)由光電檢測模塊、機械掃描平臺及控制電路、ID 芯片、LCD液晶顯示屏、RS232串行接口和鍵盤等組成，并可根據(jù)需要，選配微型打印機與上位機。儀器的硬件總體設(shè)計框圖如圖2所示。

圖2 儀器總體框架設(shè)計

2.1 光電檢測模塊

光電檢測模塊包括光源及其驅(qū)動電路、濾光片、分光鏡、聚焦/準直透鏡、小孔光闌、光探測器等，模塊示意圖如圖3所示。光電檢測模塊的主要功能是產(chǎn)生檢測所需要的激發(fā)光，采集待測樣本受激發(fā)出的熒光信號，并將其轉(zhuǎn)為電信號輸出。檢測時光源點亮，激發(fā)光經(jīng)準直鏡準直后由45°放置的分光鏡反射，再由聚焦/準直透鏡聚焦到試紙條表面。此時，步進電機帶動試紙條平穩(wěn)移動。激發(fā)光掃描試紙條上的檢測區(qū)域。試紙條上檢測區(qū)域內(nèi)的熒光物質(zhì)被激發(fā)出的熒光由聚焦/準直透鏡準直為平行光，經(jīng)分光鏡和截止濾波片濾除雜光，再由聚焦透鏡聚焦在共聚焦小孔光闌上。通過光闌的光由光探測器探測并轉(zhuǎn)換為電信號。該電信號經(jīng)處理和分析計算后可轉(zhuǎn)化為被測樣本的濃度。

圖3 光電檢測模塊

2.2 機械掃描模塊

儀器通過軟件控制機械掃描模塊，配合光電檢測模塊實現(xiàn)對試紙條的掃描檢測，基于特定算法對采集到的信息進行處理，計算出待測樣本的濃度。

機械掃描模塊主要包括步進電機(包含齒輪)及其驅(qū)動電路、運動平臺兩部分。運動平臺包含滑塊、尺皮帶、導(dǎo)軌、試紙條槽板、定位裝置等?；瑝K通過金屬彈片與尺皮帶相對固定，同時與試紙條槽板經(jīng)螺絲固定，試紙條槽板嵌于導(dǎo)軌中。步進電機依托于運動平臺，帶動試紙條槽板中的試紙條往返運動。

2.3 控制與信息處理模塊

分析儀的控制與信息處理模塊包括2個功能，即儀器控制與數(shù)據(jù)處理。儀器控制主要負責激發(fā)光源的點亮與光源反饋電流信息處理、機械掃描平臺的運動和數(shù)據(jù)采集等工作，以得到試紙條上熒光物質(zhì)的分布曲線。數(shù)據(jù)處理完成濾波放大、智能選定檢測帶和控制帶、計算并輸出結(jié)果等功能。

便攜式定量熒光免疫分析儀控制與信息處理模塊功能以硬件為基礎(chǔ)，通過軟件運行來實現(xiàn)。軟件系統(tǒng)包括上位機程序和下位機程序2部分。軟件系統(tǒng)有2種工作模式：

(1)聯(lián)機工作模式。這一工作模式主要運用于儀器出廠前性能調(diào)試、質(zhì)控參數(shù)和標準曲線的設(shè)定、ID芯片匹配信息的寫入以及室內(nèi)的常規(guī)作業(yè)等。儀器通過RS232串行接口與計算機相連，受計算機控制，儀器鍵盤被鎖定。此時計算機為上位機，儀器為下位機，是受上位機控制的一個子系統(tǒng)，操作指令由計算機發(fā)出。下位機能接受上位機的操作指令并反饋控制信號，實現(xiàn)數(shù)據(jù)的讀入讀出。上位機能將下位機采集的詳細數(shù)據(jù)進行進一步的精確分析。

(2)獨立工作模式。這一工作模式主要運用于儀器獨立工作狀態(tài)。該模式下儀器沒有與計算機相連，儀器通過鍵盤操作獨立工作，用戶可根據(jù)屏幕提示對日期、測試編號等參數(shù)進行設(shè)定。儀器采集的數(shù)據(jù)經(jīng)處理分析后，將相關(guān)信息通過LCD顯示屏反饋給用戶，并可連接打印機將測試結(jié)果打印輸出。

3 性能測試

3.1 線性范圍檢測

在1.00～27.00 mg/L的試劑濃度范圍內(nèi)，每隔3 mg/L選取一個濃度水平的同一熒光試劑進行測試分析(其中前2個濃度相差2 mg/L，共10種濃度)，每種濃度水平測試3次取平均值為最終結(jié)果。對測得的結(jié)果進行線性回歸分析，其線性回歸擬合曲線如圖4所示，所得的線性回歸方程為：

y=0.996x+0.119

(1)

其中相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9，以上結(jié)果表明儀器在1.00～27.00 mg/L濃度范圍內(nèi)具有良好的線性響應(yīng)特性。

圖4 線性回歸擬合曲線

3.2 重復(fù)性測試

(2)

(3)

式中S為標準差。

測試所得結(jié)果見圖5，3組數(shù)據(jù)的變異系數(shù)C.V值均< 7.00%，優(yōu)于儀器設(shè)計要求的重復(fù)性變異系數(shù)C.V值≤10.00%(2.00～20.00 mg/L)，表明儀器具有良好的測量重復(fù)性。

圖5 重復(fù)性測試結(jié)果

3.3 最低檢測濃度測試

配制0.75 mg/L、0.50 mg/L、0.35 mg/L、0.25 mg/L 4個濃度水平的樣本分別測試10次，分析計算其變異系數(shù)C.V值。由于低濃度樣品檢測時容易產(chǎn)生誤差，因此這里選取C.V值≤20%的測量值中可檢測的最低濃度作為該儀器的最低檢測濃度。

測試結(jié)果如圖6所示，由數(shù)據(jù)可以推斷，儀器的最低檢測濃度在 0.35～0.50 mg/L區(qū)間內(nèi)。由于現(xiàn)有實驗條件的限制，若配置濃度在0.35～0.50 mg/L內(nèi)的樣本，誤差較大，因此以樣本濃度理論值為X坐標，以變異系數(shù)C.V值為Y坐標，利用多項式回歸分析，找出最適合回歸方程，進而計算出最低檢測濃度。圖6中的曲線為多項式回歸結(jié)果，其中一階回歸方程、二階回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.824 2和0.918 3，而三階回歸方程可與測試數(shù)據(jù)完全擬合，即最優(yōu)擬合曲線方程為三階多項式方程。由該方程可計算得出，y不大于20時的x最小值為0.36 mg/L，即儀器的最低檢測濃度為0.36 mg/L。

圖6 樣本濃度與變異系數(shù)多項式回歸方程擬合曲線

4 結(jié)束語

文中介紹了一種便攜式定量熒光免疫分析儀，該儀器CRP濃度的線性檢測范圍為1.00～27.00 mg/L,CRP濃度的檢測重復(fù)性變異系數(shù)C.V值 < 7.00%(2.00～20.00 mg/L)，CRP的最低檢測濃度為0.36 mg/L，儀器性能穩(wěn)定，技術(shù)參數(shù)符合臨床免疫檢測的要求，可廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場定量檢測。

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