脂質(zhì)體法與電穿孔法轉(zhuǎn)染兩種細胞效率的比較＊

張禾璇，單可人，何 燕，張 婷，王嬋娟，官志忠

（1.貴州省婦幼保健院優(yōu)生遺傳科，貴陽550001；2.貴州省醫(yī)學分子生物學重點實驗室，貴陽550004）

細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)是采用一定的途徑將外源分子導入細胞、表達目的基因的過程。細胞轉(zhuǎn)染載體有病毒載體和非病毒載體兩大類。病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但由于其轉(zhuǎn)染具有免疫原性和致突變性限制了它的應用；非病毒載體系統(tǒng)具有低毒、低免疫原性、轉(zhuǎn)移的核苷酸大小范圍廣和相對靶向性等優(yōu)點。當用化學或物理方法轉(zhuǎn)染某些類型細胞效率不高或有毒性時，電穿孔可能是一種有用的方法[1-2]。目前，非病毒載體轉(zhuǎn)染法中運用最廣泛的主要有陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000[3-4]和電穿孔法。選擇合適的細胞轉(zhuǎn)染方式，高效率質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腫瘤細胞對于細胞生物學和分子生物學以及腫瘤防治等科學研究有十分重要的意義[5-6]。本研究分別采用脂質(zhì)體法和電穿孔法轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株 HepG2、SGC7901／ADM細胞，并比較轉(zhuǎn)染效率，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 HepG2、SGC7901／ADM細胞株均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫；pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒由貴州省醫(yī)學分子生物學重點實驗室周建獎教授惠贈。LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司，電穿孔儀（美國Bio-rad Gene Pulser Xcell真核系統(tǒng)），Bio-rad 0.4cm電轉(zhuǎn)杯，電轉(zhuǎn)buffer（自配含10mmol／L HEPES，150mmol／L NaCl，5mmol／L CaCl2，6mmol／L葡萄糖pH 7.2的緩沖液）；Ezgene EndoFree Plasmid ezFlow Miniprep Kit購自Biomga公司；DMEM、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司，細胞培養(yǎng)器皿購自Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) HepG2細胞培養(yǎng)液成分為高糖 DMEM（含10%FBS，1%雙抗）。SGC7901／ADM細胞培養(yǎng)液成分為RPMI 1640（含10%FBS，1%雙抗），在細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，每天換液，2～3d傳代1次。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 （1）脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法：完全培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2、SGC7901／ADM細胞，轉(zhuǎn)染時取傳代3次的對數(shù)生長期細胞，以5×104個細胞接種至6孔板，每孔設(shè)2個復孔，加入1mL無抗性培養(yǎng)基，細胞貼壁密度為50%～80%時即可進行轉(zhuǎn)染。將eGFP質(zhì)粒用相應脂質(zhì)體LipofetamineTM2000轉(zhuǎn)染細胞（詳細步驟參見LipofetamineTM2000產(chǎn)品說明書）。（2）電穿孔轉(zhuǎn)染法：傳代3次的細胞長滿70%～80%時可用于轉(zhuǎn)染，PBS沖洗3次，0.25%胰酶消化60s，完全培養(yǎng)基終止消化。收集細胞懸液后1 000r／min離心8min，棄上清液，用無血清培養(yǎng)液洗滌1次，離心后棄上清液，用電轉(zhuǎn)buffer重懸2次，以電轉(zhuǎn)buffer重懸細胞至1×107個／mL。取1×106個細胞懸液和pcDNA3.1-EGFP質(zhì)粒10μg分裝入0.4cm電轉(zhuǎn)杯中，小心混勻后4℃靜置10min，以1個電脈沖、脈沖時間20 ms、電壓270V方波電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)后培養(yǎng)于12孔板，電轉(zhuǎn)后轉(zhuǎn)移至37℃、含15%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每孔設(shè)兩個復孔。

1.2.3 細胞存活率測定 兩種轉(zhuǎn)染實驗中均設(shè)置未轉(zhuǎn)染的細胞為陰性對照，且各組細胞數(shù)量保持一致，完成轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)8 h，胰蛋白酶消化各組細胞，以流式分析細胞計數(shù)，各轉(zhuǎn)染組細胞數(shù)與陰性對照細胞數(shù)的比值即轉(zhuǎn)染8h的細胞存活率。

1.2.4 轉(zhuǎn)染效率測定 電轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48h，借助綠色熒光標志蛋白eGFP判斷轉(zhuǎn)染效率。用PBS洗滌貼壁細胞3遍后置顯微鏡下觀察，由于eGFP為綠色熒光，顯微參數(shù)為480nm激發(fā)波長，520nm發(fā)射波長。每孔共計5個高倍鏡視野觀察計算綠色熒光細胞數(shù)。轉(zhuǎn)染效率（%）＝綠色熒光細胞數(shù)／總細胞數(shù)×100%，取5個視野平均值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 細胞存活率 重復3次以上實驗，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HepG2細胞存活率為（65.7±1.8）%，電穿孔法 HepG2細胞存活率為（38.5±2.4）%，二者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染SGC7901／ADM 細胞存活率為（60.6±1.4）%，電穿孔法SGC7901／ADM 細胞存活率為（37.2±1.6）%，二者比較差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 細胞轉(zhuǎn)染率 重復3次以上實驗，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染eGFP質(zhì)粒至HepG2細胞所獲得的陽性轉(zhuǎn)染率為（20.8±2.1）%，而電穿孔法轉(zhuǎn)染效率增高至（49.6±2.5）%，二者比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染eGFP質(zhì)粒至SGC7901／ADM 細胞所獲得的陽性轉(zhuǎn)染率為（25.4±1.3）%，而電穿孔法轉(zhuǎn)染效率增高至（52.6±2.1）%，二者比較差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

脂質(zhì)體法是通過脂質(zhì)雙分子層所構(gòu)成的囊狀載體包裹外源基因與細胞膜融合內(nèi)吞而完成外源基因的導入，該方法操作簡便、細胞毒性低，但對細胞具有選擇性，轉(zhuǎn)染效率受細胞類型影響。電穿孔法是利用高強度的電場瞬時改變細胞膜的狀態(tài)和通透性，從而吸收周圍介質(zhì)中的外源分子進入細胞，具有簡單易行、可重復性強、安全性高、適用性廣等優(yōu)點[2]，但伴隨較高的細胞毒性。

本研究選取較大分子帶GFP綠色熒光蛋白的質(zhì)粒eGFP為轉(zhuǎn)染物，以常用的陽離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000和電穿孔兩種方法分別轉(zhuǎn)染HepG2、SGC7901／ADM細胞。脂質(zhì)體表面帶正電荷，與核酸中帶負電荷的磷酸根相互吸附形成脂質(zhì)體核酸復合物，該復合物能與細胞膜表面負電荷相互吸附，通過胞飲作用進入細胞內(nèi)[7-8]。利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染eGFP質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率為（20.8±2.1）%，這與朱曉瑩等[9]的結(jié)果相符，用于轉(zhuǎn)染時，脂質(zhì)體雖具有良好的膜親和性，但缺點在于其細胞毒性和低轉(zhuǎn)染效率性[10]。電穿孔法是利用外加電場產(chǎn)生一定的電脈沖，誘導活細胞產(chǎn)生跨膜電位，由于外加電場強度大于細胞膜穿孔的臨界值，引起細胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)暫時性改變，導致細胞膜形成可恢復的孔隙，細胞膜產(chǎn)生小孔，從而使外源基因進入細胞內(nèi)。相較脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，電轉(zhuǎn)技術(shù)因較大的電壓刺激使得電轉(zhuǎn)后細胞的死亡率較高。有研究發(fā)現(xiàn)，細胞存活率在50%左右時的電場參數(shù)可獲得最佳的轉(zhuǎn)染效率[11]。本研究結(jié)果顯示，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染時細胞存活率較高，電穿孔轉(zhuǎn)染時細胞存活率雖然偏低，但是電穿孔法轉(zhuǎn)染可使上述兩種細胞的轉(zhuǎn)染效率均提高至50%左右，提示使用電穿孔法能明顯改善大片段載體低轉(zhuǎn)染效率的情況，這與江雪等[12]的觀點一致。

綜上所述，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000更容易包裹吞入片段較小的轉(zhuǎn)染物，電穿孔法操作簡單，能將DNA、RNA、抗體、酶等物質(zhì)轉(zhuǎn)入細菌、動物細胞、植物細胞等，改善大片段載體低轉(zhuǎn)染效率的情況，更適合用于常規(guī)環(huán)狀質(zhì)粒轉(zhuǎn)染構(gòu)建工程細胞。

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