細(xì)菌毒力與β－內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的相關(guān)性

耿 健，李紹雪，周 維，張德顯，劉明春

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽110866）

β－內(nèi)酰胺類抗生素是一類含有β－內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素，主要包括青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類和β－內(nèi)酰胺酶抑制劑等。細(xì)菌對(duì)β－內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的機(jī)制比較復(fù)雜多樣，在革蘭陽性菌和革蘭陰性菌中表現(xiàn)不同。在革蘭陽性菌，主要通過藥物作用靶位的改變、β－內(nèi)酰胺酶對(duì)藥物的破壞作用、細(xì)菌的主動(dòng)外排系統(tǒng)、自身基因突變以及獲得性外源基因等而產(chǎn)生耐藥性；而在革蘭陰性菌，主要通過滲透屏障、β－內(nèi)酰胺酶對(duì)藥物的破壞作用、細(xì)菌主動(dòng)外排系統(tǒng)、自身基因突變以及獲得性外源基因等產(chǎn)生耐藥性。

青霉素結(jié)合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs）表達(dá)減少或者突變是革蘭陽性菌對(duì)β－內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的重要機(jī)制，而革蘭陰性菌對(duì)β－內(nèi)酰胺類抗生素耐藥則主要是由于β－內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生和細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的改變而導(dǎo)致的［1］。致病菌的定植、感染和引起疾病的能力主要取決于其自身對(duì)抗生素的耐藥性、宿主本身所產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)（膽酸、脂肪酸等）和宿主自身的免疫力［2］。據(jù)報(bào)道，細(xì)菌獲得耐藥性對(duì)其毒力的改變也有重要影響［3］。有些細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生使其致病力更強(qiáng)，更難以清除，已經(jīng)引起臨床的廣泛關(guān)注。本文綜述了細(xì)菌毒力與其對(duì)β－內(nèi)酰胺類抗生素耐藥之間的相關(guān)性，期望對(duì)深入探討細(xì)菌耐藥機(jī)制及有效防治耐藥菌引起的感染性疾病提供依據(jù)。

1 青霉素結(jié)合蛋白的改變對(duì)細(xì)菌耐藥性和毒力的影響

PBPs是β－內(nèi)酰胺類抗生素作用的主要靶位。β－內(nèi)酰胺類抗生素能專一性地與細(xì)菌細(xì)胞膜上的PBPs結(jié)合，干擾PBPs的正常酶活性，從而干擾肽聚糖的合成，使細(xì)胞壁合成受阻，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。PBPs結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變是細(xì)菌對(duì)β－內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥的重要機(jī)制之一［4］。

在PBPs家族中，金黃色葡萄球菌的PBP2、肺炎鏈球菌的PBP2b－PBPX和鮑曼不動(dòng)桿菌的PBP7－8能夠影響其細(xì)菌毒力基因的表達(dá)。Rudkin J K等［5］研究表明，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌能夠影響其生物膜的表型降低其毒力，并能夠降低蛋白酶的產(chǎn)生以及降低其對(duì)小鼠的致病力，并證明耐甲氧西林金黃色葡萄球菌通過干擾細(xì)菌群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)而降低細(xì)菌的毒力基因的表達(dá)。Pozzi C等［6］研究表明，細(xì)胞壁自溶素、纖維結(jié)合蛋白、胞間多糖黏附素（poly－saccharide intercellular adhesin，PIA）和多聚 N－乙酰氨基葡萄糖（polymeric N－acetylglucosamine，PANG）能夠促進(jìn)金黃色葡萄球菌分離株生物膜的表達(dá)，對(duì)甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌生物膜的產(chǎn)生與胞間多糖黏附素或多聚乙酰氨基葡萄糖有關(guān)，而耐甲氧西林金黃色葡萄球菌分離株能夠表達(dá)Atl／FnBP介導(dǎo)的生物膜表型，這表明甲氧西林耐藥誘導(dǎo)細(xì)胞壁的改變能夠影響細(xì)菌的群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致了細(xì)菌毒力基因表達(dá)量的減少，并且能夠降低對(duì)鼠膿毒癥模型致病力。Rieux V等［7］研究發(fā)現(xiàn)，改變了PBPX和PBP2b使青霉素敏感菌株改變成青霉素耐藥菌株在轉(zhuǎn)換之后，肺炎鏈球菌的毒力顯著降低了。有關(guān)革蘭陰性桿菌中PBPs改變對(duì)毒力的影響研究數(shù)據(jù)較少，只見有關(guān)鮑曼不動(dòng)桿菌方面的報(bào)道。Russo T A等［8］篩選了鮑曼不動(dòng)桿菌pbpG上的突變，可編碼低分子質(zhì)量的PBP7～PBP8。研究表明，這種突變體在大鼠軟組織感染模型和大鼠肺炎模型中具有較低的致病力，且有助于鮑曼不動(dòng)桿菌在體內(nèi)和體外的存活。

2 β－內(nèi)酰胺酶的表達(dá)對(duì)細(xì)菌耐藥性和毒力的影響

大腸埃希菌ST131能夠產(chǎn)生廣譜的CTX－M－15型β－內(nèi)酰胺酶而呈多重耐藥，并且該致病菌已經(jīng)在國際范圍內(nèi)廣泛傳播，CTX－M－15型β－內(nèi)酰胺酶也在多種細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，包括產(chǎn)毒志賀菌O111：H8［9］和O26：H11［10］，以及從西班牙豬場(chǎng)和雞場(chǎng)分離得到的大腸埃希菌中都發(fā)現(xiàn)了CTX－M－15型β－內(nèi)酰胺酶。從產(chǎn)生CTX－M－15型β－內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌分離株已經(jīng)檢測(cè)到多種毒力基因［11］，以及產(chǎn)生NDM－1型內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌ST131中發(fā)現(xiàn)存在多種毒力基因［12］。以上研究表明，β－內(nèi)酰胺酶和毒力基因能夠共同存在于特定的大腸埃希菌菌株體內(nèi)，是細(xì)菌共同進(jìn)化的結(jié)果。

然而，目前仍不清楚特殊β－內(nèi)酰胺酶基因的存在能否影響細(xì)菌的致病能力。至少在產(chǎn)CTX－M－15型β－內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌沒有對(duì)其毒力產(chǎn)生影響［3］。Dubois D等［13］研究表明，從新生兒腦膜炎患者中分離出的一株大腸埃希菌攜帶有3個(gè)不同的質(zhì)粒，其中一個(gè)產(chǎn)生CTX－M－1型β－內(nèi)酰胺酶，編碼β－內(nèi)酰胺的質(zhì)粒不能促進(jìn)新生小鼠腦膜炎模型的發(fā)生率。這表明CTX－M型酶在動(dòng)物模型中不能增加大腸埃希菌的毒力。另外，有學(xué)者研究表明，在攜帶有blaIMP基因（編碼β－內(nèi)酰胺酶的基因）的銅綠假單胞菌毒力基因的表達(dá)未受到影響［14］。

關(guān)于β－內(nèi)酰胺酶的產(chǎn)生對(duì)細(xì)菌活力的影響研究比較少，在抗生素存在的情況下，細(xì)菌的耐藥性及其活力對(duì)細(xì)菌的存活具有重要意義。最近有學(xué)者對(duì)含有 OXA－24、OXA－10和 SFO－1型β－內(nèi)酰胺酶的大腸埃希菌中的肽聚糖鏈的長度進(jìn)行了定量研究，結(jié)果表明，胞壁肽聚糖交聯(lián)的表達(dá)水平出現(xiàn)明顯降低，而肽聚糖鏈的長度顯著增加，這些改變能夠在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上降低細(xì)菌在體內(nèi)外的活力［15］。以上研究提示，β－內(nèi)酰胺酶和肽聚糖合成及代謝具有重要的聯(lián)系。

3 外膜孔蛋白對(duì)細(xì)菌耐藥性和毒力的影響

外膜孔蛋白是β－barrel生物膜蛋白，是位于細(xì)菌細(xì)胞膜上能夠使特定物質(zhì)通過的一類孔道。營養(yǎng)物質(zhì)、毒素和抗生素等能通過孔蛋白擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)。外膜孔蛋白的改變、修飾和外膜孔蛋白表達(dá)量的減少都與細(xì)菌耐藥程度有關(guān)［16］。外膜孔蛋白在影響細(xì)菌毒力和細(xì)菌耐藥性方面具有至關(guān)重要的作用。

Alejandro B［3］研究表明，細(xì)菌外膜蛋白具有外膜孔蛋白的功能，不僅控制抗菌藥物進(jìn)入細(xì)胞膜，也能控制病原微生物的毒力基因的表達(dá)。最新研究證實(shí)，鮑曼不動(dòng)桿菌的外膜孔蛋白OmpA與先鋒霉素的耐藥有關(guān)［17］。另外2種外膜孔蛋白CarO和Omp33～Omp36在特定情況下與碳青霉烯類耐藥有關(guān)［18］。Fernandez Cuenca F 等［19］證明鮑曼 不 動(dòng)桿菌的毒力減弱能夠?qū)е戮幋a外膜孔蛋白CarO和OprD－like的基因表達(dá)量的減少。由 Omp33～Omp36介導(dǎo)的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類耐藥與細(xì)菌的凋亡和自噬過程有關(guān)。此外，Cabral M P等［20］的研究表明，鮑曼不動(dòng)桿菌的外膜孔蛋白Caro和Omp33～Omp36參與菌毛的形成過程。OmpA和Omp33～Omp36蛋白以及TonB的轉(zhuǎn)運(yùn)體被證實(shí)為菌毛結(jié)合蛋白，可影響病原菌和宿主的相互作用。因此，這有利于探討鮑曼氏不動(dòng)桿菌對(duì)宿主細(xì)胞的黏附過程。

在大腸埃希菌中，OmpC的丟失能夠?qū)е驴股啬退幮?，并降低抗體依賴性的殺菌活性［21］。此外，OmpC蛋白與克羅恩病患者中細(xì)菌的黏附、入侵和腸道定植有關(guān)［22］。在大腸埃希菌中OmpF表達(dá)量的降低和缺失可使外膜通透性降低，從而阻礙抗生素進(jìn)入細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性［23］。Bekhit A等［24］證明OmpC和OmpF（這2個(gè)蛋白主要與細(xì)菌的耐藥性有關(guān)）對(duì)大腸埃希菌能在強(qiáng)酸性環(huán)境中生存至關(guān)重要。OmpF也參與Hep－2細(xì)胞黏附。肺炎克雷伯菌的OmpK35和OmpK36外膜蛋白參與頭孢唑啉、頭孢西丁和美羅培南的耐藥性。在△OmpK36和△OmpK35／36缺失株，能夠顯著降低抗生素對(duì)致病菌的最小抑菌濃度，△OmpK36缺失株對(duì)小鼠腹膜炎模型的毒性顯著降低；但若菌株中△OmpK35和△OmpK36共同缺失，則該缺失株的LD50出現(xiàn)最大值。上述研究表明，肺炎克雷伯菌外膜孔蛋白缺乏可能增加抗生素耐藥性，同時(shí)使致病性降低。在腸桿菌科的其他成員和腦膜炎奈瑟菌、銅綠假單胞菌也出現(xiàn)了類似的結(jié)果。

4 外排泵對(duì)細(xì)菌耐藥性和毒力的影響

細(xì)菌的多重耐藥外排泵與天然耐藥及獲得性耐藥有關(guān)，包括本身存在于黏膜表面的一些外排泵和一些遺傳元件攜帶的獲得性外排泵。外排泵能使細(xì)菌定植于宿主黏膜表面，而且多重耐藥外排泵能去除包括細(xì)菌感應(yīng)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)在內(nèi)的多種毒力因子［25］。外排泵也被證明參與胞內(nèi)代謝物的解毒和細(xì)菌毒力（包括動(dòng)植物宿主），以及細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和胞間信號(hào)的傳遞。外排泵主要包括耐藥結(jié)節(jié)細(xì)胞分化家族（resistance－nodulation－division，RND）、小多重耐藥家族（small multidrug resistance，SMR）、多藥物與毒物外排家族（multidrug and toxic compound extrusion，MATE）、主要易化超家族（major facilitator superfamily，MFS）、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體家族（ATP－blinding cassette，ABC）。其中，RND 家族在β－內(nèi)酰胺類耐藥中起到重要作用。

RND家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是導(dǎo)致革蘭陰性菌多重耐藥性的主要原因。RND家族中研究較多的是大腸埃希菌中的AcrAB－TolC，由藥物質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)子AcrB、膜融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC組成。AcrB有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，延伸入周質(zhì)或細(xì)胞質(zhì)后形成巨大的結(jié)合區(qū)域，當(dāng)藥物進(jìn)入革蘭陰性菌的周質(zhì)或細(xì)胞質(zhì)后，隨即被內(nèi)膜上的AcrB捕獲，然后與AcrA形成AcrAB復(fù)合體，再與TolC結(jié)合，導(dǎo)致其構(gòu)象變化形成內(nèi)在通道，將各種藥物排出［26］。RND家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)于細(xì)菌的致病性也起重要作用，主要影響病原微生物在宿主體內(nèi)的定植、感染和持續(xù)性存在。

AcrAB－TolC外排泵在多種細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)抗生素耐藥和毒力，包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、霍亂弧菌、銅綠假單胞菌、變形桿菌、布魯菌［27］；以及非致病的微生物，如青枯雷爾菌。據(jù)報(bào)道，由于致病基因表達(dá)量減少導(dǎo)致沙門菌AcrAB－TolC缺失株毒力明顯減弱［28］。Padilla E 等［29］研究表明，敲除acrAB的肺炎克雷伯菌菌株和野生菌株相比在引起肺炎鼠模型中表現(xiàn)出較低的致病力。顯然，外排泵的去除能夠影響毒力和抗生素耐藥。因此，外排泵可導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性同時(shí)使細(xì)菌的毒力增強(qiáng)。

目前的研究資料表明，4種對(duì)β－內(nèi)酰胺類抗生素耐藥機(jī)制之間沒有明顯聯(lián)系。細(xì)菌對(duì)β－內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性和毒力之間的關(guān)系主要表現(xiàn)為在金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌和鮑曼不動(dòng)桿菌中由PBPs結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變可導(dǎo)致的耐藥能夠使細(xì)菌的毒力降低。大腸埃希菌中β－內(nèi)酰胺酶導(dǎo)致的耐藥不能對(duì)細(xì)菌毒力產(chǎn)生影響。在腸桿菌科中由外膜孔蛋白缺失和表達(dá)量降低導(dǎo)致的耐藥對(duì)細(xì)菌毒力的降低產(chǎn)生重要影響，而在大腸埃希菌中外排泵導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥可使細(xì)菌的毒力增強(qiáng)。國內(nèi)外研究均認(rèn)為細(xì)菌耐藥性問題嚴(yán)重，細(xì)菌較易產(chǎn)生耐藥性，隨著時(shí)間的推移細(xì)菌的耐藥率大幅上升，多重耐藥菌株迅速增加，對(duì)常用抗生素產(chǎn)生廣譜耐藥。目前關(guān)于細(xì)菌毒力與耐藥的相關(guān)性的一些機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，相信隨著研究的不斷深入，必將揭示細(xì)菌毒力與耐藥的相關(guān)性，為有效防治耐藥菌引起的感染提供重要的理論支撐。

［1］ 解曉雙，趙玉軍，張德顯，等.PBPs介導(dǎo)革蘭氏陰性菌對(duì)β－內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥機(jī)制［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，35（2）：169－172.

［2］ 陳菲菲，狄紅霞，藍(lán)樂夫.金黃色葡萄球菌重要毒力因子的功能及其抑制劑研究進(jìn)展［J］.中國科學(xué)，2013，58（36）：3743－3752.

［3］ Alejandro B，Maria T，German B C.Antimicrobial resistance and virulence：a successful or deleterious association in the bacterial world［J］.Microbiol Rev，2013，26（2）：185－230.

［4］ 李 冀，楊 慧，呼延霆，等.細(xì)菌青霉素結(jié)合蛋白［J］.生命的化學(xué)，2013，33（4）：418－426.

［5］ Rudkin J K，Edwards A M，Bowden M G，et al.Methicillin resistance reduces the virulence of healthcare－associated methicillin－resistant Staphylococcus aureus by interfering with the agr quorum sensing system［J］.Infect Dis，2012，205：798－806.

［6］ Pozzi C，Waters E M，Rudkin J K，et al.Methicillin resistance alters the biofilm phenotype and attenuates virulence in Staphylococcus aureus device－associated infections［J］.PLoS Pathog，2012，8：e1002626.doi：10.1371／journal.ppat.1002626.

［7］ Rieux V，Carbon C，Azoulay－Dupuis E.Complex relationship between acquisition of beta－lactam resistance and loss of virulence in Streptococcus pneumoniae［J］.Infect Dis，2001，184：66－72.

［8］ Russo T A，MacDonald U，Beanan J M，et al.Penicillin－binding protein 7／8contributes to the survival of Acinetobacterbaumanniiinvitroand in vivo［J］.Infect Dis，2009，199：513－521.

［9］ Valat C，Haenni M，Saras E，et al.CTX－M－15extended－spectrum beta－lactamase in a Shiga toxinproducing Escherichia coli isolate of serotype O111：H8［J］.Appl Environ Microbiol，2012，78：1308－1309.

［10］ Ishii Y，Kimura S，Alba J，et al.Extended－spectrum betalactamase－producing Shiga toxin gene（Stx1）－positive Escherichia coli O26：H11：a new concern［J］.Clin Microbiol，2005，43：1072－1075.

［11］ Pitout J D，Laupland K B，Church D L，et al.Virulence factors of Escherichia coli isolates that produce CTX－M－type extended－spectrum beta－lactamases［J］.Antimicrob Agent Che－mother，2005，49：4667－4670.

［12］ Peirano G，Schreckenberger P C，Pitout J D.Characteristics of NDM－1－producing Escherichia coli isolates that belong to the successful and virulent clone ST131［J］.Antimicrob Agent Chemother，2011，55：2986－2988.

［13］ Dubois D，Prasadarao N V，Mittal R，et al.CTX－M beta－lactamase production and virulence of Escherichia coli K1［J］.Emerg Infect Dis，2009，15：1988－1990.

［14］ Aoki S，Hirakata Y，Kondoh A，et al.Virulence of metallo－betalactamse－producing Pseudomonas aeruginosa in vitro and in vivo［J］.Antimicrob Agent Chemother，2004，48：1876－1878.

［15］ Fernandez A，Perez A，Ayala J A，et al.Expression of OXA－type and SFO－1betalactamases induces changes in peptidoglycan composition and affects bacterial fitness［J］.Antimicrob Agent Chemother，2012，56：1877－1884.

［16］ Nikaido H.Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2003，67：593－656.

［17］ Sugawara E，Nikaido H.OmpA is the principal nonspecific slow porin of Acinetobacter baumannii［J］.Bacteriology，2012，194：4089－4096.

［18］ Limansky A S，Mussi M A，Viale A M.Loss of a 29－kilodalton outer membrane protein in Acinetobacter baumannii is associated with imipenem resistance［J］.Clin Microbiol，2002，40：4776－4778.

［19］ Fernandez Cuenca F，Smani Y，Gomez Sanchez M C，et al.Attenuated virulence of a slow－growing pandrug－resistant acinetobacter baumannii is associated with decreased expression of genes encoding the porins CarO and OprD－like［J］.Int Antimicrob Agent，2009，38：548－549.

［20］ Cabral M P，Soares N C，Aranda J，et al.Proteomic and functional analyses reveal a unique lifestyle for Acinetobacter baumannii biofilms and a key role for histidine metabolism［J］.Proteome Res，2011，10：3399－3417.

［21］ Liu Y F，Yan J J，Lei H Y，et al.Loss of outer membrane protein C in Escherichia coli contributes to both antibiotic resistance and escaping antibody－dependent bactericidal activity［J］.Infect Immun，2012，80：1815－1822.

［22］ Rolhion N，Carvalho F A，Darfeuille Michaud A.OmpC and the sigmaE regulatory pathway are involved in adhesion and invasion of the Crohn＇s disease－associated Escherichia coli strain LF82［J］.Mol Microbiol，2007，63：1684－1700.

［23］ 崔艷艷，高 洪，嚴(yán)玉霖，等.大腸埃希菌外膜蛋白F與細(xì)菌耐藥性研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，34（6）：164－166.

［24］ Bekhit A，F(xiàn)ukamachi T，Saito H，et al.The role of OmpC and OmpF in acidic resistance in Escherichia coli［J］.Biol Pharm Bull，2011，34：330－334.

［25］ Coudeyras S，Nakusi L，Charbonnel N，et al.A tripartite efflux pump involved in gastrointestinal colonization by Klebsiella pneumoniae confers a tolerance response to inorganic acid［J］.Infect Immun，2008，76：4633－4641.

［26］ Pages J M，Masi M，Barbe J.Inhibitors of efflux pumps in Gram－negative bacteria［J］.Trends Mol Med，2005，11（8）：382－389.

［27］ Piddock L J.Multidrug－resistance efflux pumps－not just for resistance［J］.Nat Rev Microbiol，2006，4：629－636.

［28］ Webber M A，Bailey A M，Blair J M，et al.The global consequence of disruption of the AcrAB－TolC efflux pump in Salmonella enterica includesreduced expression of SPI－1and other attributes required to infect the host［J］.Bacteriology，2009，191：4276－4285.

［29］ Padilla E，Llobet E，Domenech Sanchez A，et al.Klebsiella pneumoniae AcrAB efflux pump contributes to antimicrobial resistance and virulence［J］.Antimicrob Agent Chemother，2010，54：177－183.