紅瘰疣螈外周血細(xì)胞組織學(xué)觀察

宋紹萍，楊國(guó)輝

（大理學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

血液是動(dòng)物體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中重要的組成部分，血細(xì)胞的形態(tài)及組成具有一定的特異性，可作為反映物種特性及生理狀態(tài)的指標(biāo)，同時(shí)也為動(dòng)物的分類、生理及系統(tǒng)演化等提供重要依據(jù)。為此，許多學(xué)者對(duì)脊椎動(dòng)物血細(xì)胞進(jìn)行過研究〔1-8〕，對(duì)于兩棲類，至今已經(jīng)完成十多種動(dòng)物的血液組織學(xué)研究。紅瘰疣螈Tylototriton shanjingNussbaum，BrodieetYang 1995 屬于兩棲綱，有尾目，蠑螈科，疣螈屬的一類國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物〔9〕，目前有關(guān)紅瘰疣螈的研究主要集中在繁殖、生態(tài)、染色體、皮膚結(jié)構(gòu)及幼體形態(tài)發(fā)育等方面〔10-14〕，而有關(guān)紅瘰疣螈血細(xì)胞組織學(xué)的研究尚未見報(bào)道。本研究采用傳統(tǒng)的常規(guī)血涂片，姬姆薩（Giemsa）染色與血細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察并統(tǒng)計(jì)紅瘰疣螈全血細(xì)胞的形態(tài)特征及其數(shù)量比例，旨在為紅瘰疣螈的血液形態(tài)學(xué)、細(xì)胞免疫以及進(jìn)化等方面的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料實(shí)驗(yàn)用紅瘰疣螈6 只均采自云南大理點(diǎn)蒼山地區(qū)，海拔1 800～2 300 m 之間，經(jīng)模擬野外環(huán)境進(jìn)行人工養(yǎng)殖7～350 d不等。見表1。

表1 紅瘰疣螈標(biāo)本的測(cè)量值

1.2 方法乙醚麻醉后自心臟取血，制成血涂片，瑞氏-姬姆薩染色，奧林帕斯顯微鏡（BX51）成像系統(tǒng)觀察、拍照、測(cè)量，每個(gè)樣本統(tǒng)計(jì)5 片。細(xì)胞的大小取30 個(gè)細(xì)胞的平均值，血細(xì)胞計(jì)數(shù)用Neubauer計(jì)數(shù)板進(jìn)行。白細(xì)胞比例的計(jì)算，取不重復(fù)視野中1 000個(gè)白細(xì)胞的記數(shù)，再算出百分比。

2 結(jié)果

2.1 血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)對(duì)6個(gè)紅瘰疣螈個(gè)體，分別制作血涂片，對(duì)不同的個(gè)體進(jìn)行血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，再算出平均數(shù)，結(jié)果見表2～3。結(jié)果顯示：紅細(xì)胞數(shù)量為1.48×105個(gè)/mm3，白細(xì)胞數(shù)量為0.17×105個(gè)/mm3，其中淋巴細(xì)胞占43%，單核細(xì)胞數(shù)占14%，中性粒細(xì)胞占19%，嗜酸性粒細(xì)胞占16%，嗜堿性粒細(xì)胞占8%。

表2 紅瘰疣螈6個(gè)個(gè)體紅細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞參數(shù)

表3 紅瘰疣螈6個(gè)個(gè)體嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞參數(shù)

2.2 血細(xì)胞的形態(tài)及大小通過顯微鏡觀察，紅瘰疣螈中橢圓形的紅細(xì)胞較多，占90%以上，白細(xì)胞近圓形，常單個(gè)分散或多個(gè)聚集于紅細(xì)胞間。

2.2.1 紅細(xì)胞 對(duì)6只紅瘰疣螈外周血中的紅細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量，得出平均值，其紅細(xì)胞長(zhǎng)徑為（28.71±2.31）μm、短徑（15.92±1.22）μm、細(xì)胞核長(zhǎng)（10.17±0.89）μm、短徑（6.11±0.49）μm。成熟紅細(xì)胞表面光滑，有核，多數(shù)為橢圓形，少數(shù)梨形；除成熟紅細(xì)胞外，偶爾可見少量未成熟紅細(xì)胞、無核紅細(xì)胞和衰老的紅細(xì)胞。見圖1。與成熟紅細(xì)胞相比，未成熟紅細(xì)胞體積稍小，近圓形，核質(zhì)比較大，核圓形，染色質(zhì)結(jié)構(gòu)較疏松，著色較淺，而衰老紅細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)有顆粒狀物質(zhì)，細(xì)胞核固縮，核結(jié)構(gòu)模糊不清，染色加深；無核紅細(xì)胞的質(zhì)著色較淺。

圖1 紅瘰疣螈血細(xì)胞形態(tài)

2.2.2 白細(xì)胞 白細(xì)胞多近圓形，根據(jù)其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有無特殊顆?？煞譃橛辛０准?xì)胞和無粒白細(xì)胞。有粒白細(xì)胞根據(jù)其嗜色性可分為嗜酸性粒細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。無粒白細(xì)胞則包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，各種細(xì)胞的大小見表4。

表4 紅瘰疣螈白細(xì)胞的形態(tài)學(xué)參數(shù)（±s，μm）

表4 紅瘰疣螈白細(xì)胞的形態(tài)學(xué)參數(shù)（±s，μm）

項(xiàng)目細(xì)胞長(zhǎng)徑細(xì)胞短徑嗜中性粒細(xì)胞27.27±1.92 23.53±2.50嗜酸性粒細(xì)胞27.15±0.91 26.27±0.83嗜堿性粒細(xì)胞25.58±2.94 23.51±3.71單核細(xì)胞26.58±3.17 23.52±3.72淋巴細(xì)胞14.79±0.69 12.11±0.93

根據(jù)圖1 可看出，嗜中性粒細(xì)胞多呈近圓形或馬蹄形，也有少量呈不規(guī)則形。核質(zhì)之間明顯，細(xì)胞核較大，核有單葉核和分葉核，單葉核呈腎形、馬蹄形和半圓形，分葉核多為2～3 葉，少數(shù)為4～6 葉。嗜酸性粒細(xì)胞呈近圓形，細(xì)胞核常橢圓形，位于一側(cè)，細(xì)胞質(zhì)被染成紫紅色。嗜堿性細(xì)胞呈近圓形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顆粒較分散，被染成深紫藍(lán)色。淋巴細(xì)胞多成近圓形，細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，所占比例很大，淋巴細(xì)胞的核被染成深藍(lán)色，胞質(zhì)少且被染成淺藍(lán)色。單核細(xì)胞多呈近圓形，細(xì)胞核較大，核多馬蹄形或腎形，位于細(xì)胞中央，被染成藍(lán)紫色。細(xì)胞質(zhì)被染成淡灰藍(lán)色。血栓細(xì)胞多數(shù)呈不規(guī)則形，常數(shù)個(gè)聚在一起，也偶有單個(gè)分散或3～4個(gè)連在一起，呈帶狀。細(xì)胞核較大，被染成深藍(lán)色。細(xì)胞質(zhì)較少，呈淺藍(lán)色。

3 討論

紅瘰疣螈和其他兩棲類一樣，外周血中含有紅細(xì)胞和白細(xì)胞，但其數(shù)量和大小與其他兩棲類動(dòng)物有明顯差異，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)6 個(gè)個(gè)體間血細(xì)胞參數(shù)沒有明顯差異。見表2。人工飼養(yǎng)對(duì)其血細(xì)胞參數(shù)是否有影響還有待于進(jìn)一步的研究。

3.1 紅細(xì)胞紅細(xì)胞是脊椎動(dòng)物血液的主要有形成分，在機(jī)體內(nèi)主要運(yùn)輸O2和CO2，并對(duì)機(jī)體產(chǎn)生的酸、堿物質(zhì)起緩沖作用，維持一定的酸堿平衡。動(dòng)物紅細(xì)胞的形態(tài)、大小、數(shù)量與動(dòng)物的進(jìn)化和生態(tài)適應(yīng)有一定的關(guān)系，動(dòng)物越高等，紅細(xì)胞的數(shù)量越多，而體積越小。就兩棲綱而言，紅瘰疣螈的橢圓形紅細(xì)胞大?。?8.71±2.31）μm×（15.92±1.22）μm，介于無足目的版納魚螈Ichthyophis bannanica（32.30±5.08）μm×（18.17±2.71）μm 和無尾目中華蟾蜍Bufo gargarizans（15.48～21.94）μm×（10.32～14.19）μm 之間，在蠑螈科中紅瘰疣螈的橢圓形紅細(xì)胞又大于東方蠑螈Cynops orientalis（22.4×14.8）μm，表明紅瘰疣螈所屬的有尾目進(jìn)化地位處于無足目和無尾目之間，所屬的疣螈屬比蠑螈屬低等，符合分子研究結(jié)果〔15〕。紅瘰疣螈紅細(xì)胞數(shù)量（1.48×105個(gè)/mm3）均低于中華蟾蜍（7.67×105個(gè)/mm3）和藍(lán)尾蠑螈Cynops cyanurus（7.74×105個(gè)/mm3），這可能與紅瘰疣螈行動(dòng)緩慢、運(yùn)動(dòng)量小，代謝率較低等生活習(xí)性有關(guān)。

觀察紅瘰疣螈血涂片紅細(xì)胞時(shí)，還觀察到無核紅細(xì)胞和梨形紅細(xì)胞，無核紅細(xì)胞染色與紅細(xì)胞一致，認(rèn)為無核紅細(xì)胞屬于血液中正常有形成分，可能是其原生質(zhì)的脫水收縮，細(xì)胞核固縮，是細(xì)胞衰老的表現(xiàn)。梨形紅細(xì)胞的染色、結(jié)構(gòu)與橢圓形紅細(xì)胞一致，也屬于血液中正常有形成分，在北方山溪鯢、黑斑蛙和新疆北鯢外周血細(xì)胞觀察中也發(fā)現(xiàn)有梨形紅細(xì)胞，估計(jì)這是由未成熟紅細(xì)胞直接分裂形成的，是兩棲類紅細(xì)胞的增殖補(bǔ)充的一種方式〔16〕，究竟什么原因引起未成熟紅細(xì)胞的直接分裂，還有待于進(jìn)一步研究。

3.2 白細(xì)胞白細(xì)胞是動(dòng)物機(jī)體防御和保護(hù)功能的重要組成成分，不同動(dòng)物的各種白細(xì)胞的組成比例、大小有差異。就兩棲類而言，紅瘰疣螈外周血液中白細(xì)胞數(shù)量最多的是淋巴細(xì)胞，占43%，與其他兩棲綱動(dòng)物一致，這可能與兩棲類的生境有關(guān)，一般兩棲類生活在清澈的山間溪流中，對(duì)水質(zhì)要求較高，而淋巴細(xì)胞是機(jī)體特異性免疫反應(yīng)的主要物質(zhì)，所以在兩棲類外周血中白細(xì)胞數(shù)量最多的是淋巴細(xì)胞。

嗜中性粒細(xì)胞具有活躍的變形能力，高度的趨化性和很強(qiáng)的吞噬及消化細(xì)菌的能力，是吞噬外來微生物和異物的主要成分。紅瘰疣螈白細(xì)胞中嗜中性粒細(xì)胞含量（19%）與同科的東方蠑螈（22%）和藍(lán)尾蠑螈（20%）相似，與無足目的版納魚螈（15%）、有尾目的新疆北鯢（19%）與商城肥鯢（12%）和牛蛙（19%）接近，但與東北小鯢（1%）、北方山溪鯢（9%）、黑龍江林蛙（1%）差異較大，推斷這可能與兩棲動(dòng)物生活習(xí)性、環(huán)境有關(guān)，不存在科屬間的差異。

嗜堿性粒細(xì)胞不具有吞噬能力，但可增加毛細(xì)血管通透性和釋放肝素、組胺等多種生物活性物質(zhì)。在不同的脊椎動(dòng)物中其含量存在明顯的差異，對(duì)于兩棲類動(dòng)物它在白細(xì)胞中含量最少，紅瘰疣螈白細(xì)胞中僅占8%，新疆北鯢（1%）、東北小鯢（3%）、商城肥鯢（8%）、北方山溪鯢（6%），而有的種血液中就沒有嗜堿性粒細(xì)胞，如已經(jīng)報(bào)道的東方蠑螈、藍(lán)尾蠑螈、黑龍江林蛙、東北林蛙，而有的含量又很高如版納魚螈（11%），究其原因，目前還不清楚，有待于進(jìn)一步的探討〔17-22〕。

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