mtND5基因12338、12358和12406位點突變與弱精子癥的相關(guān)性分析

駱慧盈，李傳連，樓哲豐，鄭九嘉，張李雅，金龍金

（1.浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點實驗室，溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.婁底市中心醫(yī)院 檢驗科，湖南 婁底 417000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，浙江 溫州 325015）

mtND5基因12338、12358和12406位點突變與弱精子癥的相關(guān)性分析

駱慧盈1，李傳連2，樓哲豐1，鄭九嘉3，張李雅3，金龍金1

（1.浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點實驗室，溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.婁底市中心醫(yī)院 檢驗科，湖南 婁底 417000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，浙江 溫州 325015）

目的：探討mtND5基因12338、12358和12406位點突變與弱精子癥的相關(guān)性。方法：按照WHO標(biāo)準(zhǔn)收集55例弱精子癥患者和33例精子活力正常者的精液標(biāo)本，通過PCR及測序檢測mtND5基因12338、12358和12406三個位點的突變，分析比較兩組基因突變頻率及活力的差異。結(jié)果：弱精子癥組中精子mtND5 12338突變率（為10.91%）、12358突變率（為9.09%）、12406突變率（為12.73%）和三位點總突變率（為32.73%）均高于正常對照組（分別為9.09%、3.03%、3.03%和15.15%），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。進一步分析兩組的精子活力發(fā)現(xiàn)，突變組與非突變組a級精子百分率分別為（20.63±13.63）%、（30.61±18.87）%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；a+b級精子百分率分別為（29.66±17.08）%、（41.44±22.47）%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：m.12338 T＞C、m.12358 A＞G和m.12406 G＞A可能與精子活力有一定的相關(guān)性。

弱精子癥；精子活動力；mtND5；突變

不孕不育是一種嚴重影響人類生殖健康的疾病，且其中約有一半的原因是男性因素所致，稱為男性不育。由于生活方式的改變、社會工業(yè)的不斷發(fā)展及環(huán)境污染的加劇，男性不育患者日趨增加[1]。目前，它已成為一個全球關(guān)注的熱點問題。

據(jù)Hirsh[2]報道，男性不育癥中約有一半是由于男方精子質(zhì)量異?；蛐怨δ苷系K所致。其中精子質(zhì)量低下是其重要原因之一，而精子活動力則是衡量精子質(zhì)量的一項重要指標(biāo)。依據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)[3]，精子活力分為4個等級：a級為快速前向運動精子，b級為慢速前向運動精子，c級為原地運動精子，d級為靜止精子。當(dāng)a級＜25%且a+b＜50%時，可診斷為弱精子癥。精子活動的能量主要源自線粒體，當(dāng)線粒體結(jié)構(gòu)或功能異常時，精子活力會受到一定影響。

近年來，mtDNA突變和缺失與男性不育的相關(guān)研究越來越多的引起關(guān)注。有關(guān)精子線粒體基因突變與精子活力低下的相關(guān)研究已有一些報道。本實驗室已往的研究中也曾報道m(xù)tATPase基因變異[4]，mtND2、mtND3和mtND4L基因突變[5-6]與精子活力低下可能有一定相關(guān)性。迄今為止，對mtND5基因的研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，mtND5基因突變與Leber遺傳性視神經(jīng)病變、遺傳性肥厚性心肌病有一定相關(guān)性，然而，mtND5基因點突變與弱精子癥的相關(guān)性研究國內(nèi)外尚鮮有報道。為了解mtND5基因變異與弱精子癥的相關(guān)性，本研究通過基因測序檢測到mtND5 12338、12358和12406三個位點的突變，并對這三個突變位點與弱精子癥的相關(guān)性進行了分析，為進一步分析mtND5基因突變與弱精子癥的相關(guān)性提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象弱精子癥和正常對照組精液標(biāo)本來自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，根據(jù)WHO修訂標(biāo)準(zhǔn)，通過計算機輔助精液分析系統(tǒng)（CASA）分析，選取精子活力低下（a級＜25%且a+b級＜50%）患者55例，正常對照標(biāo)本（a級＞25%或a+b級＞50%）33例，所有精液標(biāo)本在采集前禁欲3～5 d，手淫法收集，在37 ℃孵育20～30 min，待其完全液化后進行分析。所有病例和對照均簽訂知情同意書。

1.2 主要試劑PCR擴增引物參照文獻[7]，上游5’-TAT CAC TCT CCT ACT TAC AG-3’，下游5’-AGA AGG TTA TAA TTC CTA CG-3’，擴增產(chǎn)物為866 bp。引物由寶生物（大連）工程有限公司合成。PCR聚合酶試劑、DNA片段純化試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；蛋白酶K為Merk公司產(chǎn)品；瓊脂糖、Tris試劑為Promega公司進口分裝。

1.3 方法

1.3.1 精子線粒體DNA的提取：用PBS洗滌已液化的精液標(biāo)本2～3次，56 ℃消化4～6 h，酚-氯仿法抽提精子線粒體DNA，Elution Buffer溶解。

1.3.2 PCR反應(yīng)和產(chǎn)物鑒定：2μ L DNA模板，上游和下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，MgCl2（25 μmol/L）3 μL，PCR（10×）緩沖液4 μL，dNTP（200 nmol/L）4μL，Taq聚合酶（5μmol/L）0.25 μL，ddH2O補足至40μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性 30 s，58 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 40 s，共35個循環(huán)，最后在72 ℃終止延伸6 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.3 PCR產(chǎn)物的純化和測序：按寶生物工程（大連）有限公司DNA片段純化試劑盒說明書進行PCR產(chǎn)物的純化，然后送上海鼎安生物科技有限公司進行正向測序。

1.4 突變分析利用CodonCode Aligner軟件將測序結(jié)果與Mitomap數(shù)據(jù)庫（www.mitomap.org）上提供的人類線粒體劍橋序列進行比對，對檢測出的核苷酸變異位點進行仔細核對峰圖確認。將突變前后的密碼子編碼的氨基酸性質(zhì)進行分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理方法采用SPSS17.0軟件將序列比對結(jié)果進行統(tǒng)計分析，組間突變率的比較采用卡方檢驗，精子活力的比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增結(jié)果PCR擴增后，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示與預(yù)期產(chǎn)物片段大小一致（見圖1）。

圖1 mtND5基因PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 mtND5 m.12338T＞C、m.12358 A＞G和m.12406 G＞A突變測序峰圖

2.2 序列比對和突變頻率分析測序結(jié)果與修正后劍橋序列進行比對，55例弱精子癥患者中mtND5基因的3個位點，分別發(fā)生了m.12338 T＞C、m.12358 A＞G和m.12406 G＞A突變（見圖2），與正常對照組相比，三個位點的突變頻率及總變異率均高于對照組（見表1），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。我們進一步對88例樣本分為突變組和非突變組，并對這兩組的精子活動力數(shù)據(jù)進行了統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)突變組的a級精子百分率和a+b級精子百分率顯著低于非突變組（P＜0.05）（見表2）。

2.3 mtND5基因錯義突變氨基酸性質(zhì)分析通過Mitomap數(shù)據(jù)庫查找分析，發(fā)現(xiàn)三個突變位點中，m.12358 A＞G突變使極性親水性氨基酸（蘇氨酸）變?yōu)榉菢O性疏水性氨基酸（丙氨酸），而另外兩個突變位點僅發(fā)生所編碼的氨基酸改變，無極性改變（見表3）。

表1 mtND5 m.12338 T＞C、m.12358 A＞G和m.12406 G＞A突變在弱精子癥組和正常對照組中的突變率

表2 突變組與非突變組a級、a+b級精子百分率的比較（%）

表3 mtND5基因三個錯義突變位點的氨基酸極性改變

3 討論

ND5是氧化呼吸鏈NADH-脫氫酶復(fù)合體的七個亞基之一，與細胞能量代謝有關(guān)。精子的活力強弱在受精中起著重要的作用，只有在快速前向運動的精子達到一定數(shù)量時，才能與卵子結(jié)合形成受精卵。若精子能量代謝障礙，則可能會產(chǎn)生精子活力降低，導(dǎo)致生殖障礙。

ND5亞基對于復(fù)合體I的活性是不可或缺的[8-9]。mtND5基因經(jīng)常被報道于各種各樣的表型，包括MELAS、LHON、MERRF和Leigh綜合征[10-11]。mtND5基因的一些突變會影響復(fù)合體I的酶活性，其中文獻[12]報道，mtND5 m.12338T＞C突變可能與Leber遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)。Liu等[13]在對mtND5與母系遺傳性肥厚性心肌病的研究時發(fā)現(xiàn)，mtND5 m. 12338 T＞C與母系遺傳肥厚性心肌病的發(fā)生也有一定的相關(guān)性，是肥厚性心肌病的危險因素之一。Chamkha等[14]在對嬰幼兒Pompe病研究時，在mtND5基因上也發(fā)現(xiàn)了一個新的突變位點，如m.12908 T＞A。但是在弱精子癥中mtND5基因突變尚鮮見報道。

我們對m.12338 T＞C、m.12358 A＞G和m.12406 G＞A三個位點突變對精子活動力進行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，精子活力a級與a+b級百分率在突變組中均顯著低于非突變組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明這三個位點突變對精子活力可能有一定作用。再對這三個位點突變前后的氨基酸變化情況分析發(fā)現(xiàn)，m.12358 A＞G（Thr→Ala）突變使編碼的極性親水性氨基酸（蘇氨酸）變?yōu)榉菢O性疏水性氨基酸（丙氨酸），這種氨基酸性質(zhì)的改變可能影響蛋白質(zhì)空間構(gòu)象從而影響其功能，再結(jié)合該位點突變在弱精子癥組高于對照組，我們推測m.12358 A＞G突變可能影響線粒體的功能，影響精子活力。m.12338T＞C突變位于mtND5基因的起始密碼子，當(dāng)發(fā)生突變時，使編碼蛋氨酸的起始密碼子變?yōu)榫幋a蘇氨酸的非起始密碼子。由于起始密碼子的突變，理論上推測可能使多肽鏈的翻譯受阻，從而使精子線粒體功能異常，進而影響精子活力。然而在我們的實驗中觀察到在對照組中也存在m.12338 T＞C突變，由于弱精子癥與對照組精子活力只是數(shù)量上的差異，對照組個體精液中也存在一定比例的不活動或活動力差的精子，對照組中我們檢測到的m.12338 T＞C突變的3例標(biāo)本c+d級精子百分率分別為51.5%、49.3%和36.6%，這可能是對照組中出現(xiàn)m.12338 T＞C突變的原因，有待于進一步的研究。

在弱精子癥組中，mtND5 m.12338 T＞C、m. 12358 A＞G和m.12406 G＞A三個位點突變率高于對照組，這從另一方面支持這三個突變對精子活動力的影響，但突變率在兩組間的比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，產(chǎn)生這一結(jié)果的原因之一我們推測這3個突變位點可能對精子活力的影響較小，僅僅是一種量的作用，但是不是產(chǎn)生弱精子癥的特異性原發(fā)致病突變位點，有待于進一步的研究；原因之二可能是檢測的病例數(shù)偏少，有待擴大樣本量做進一步的分析。

根據(jù)以上分析，我們認為m.12338 T＞C、m.12358 A＞G和m.12406 G＞A可能與精子活力有一定的相關(guān)性，但是不是弱精子癥的特異性原發(fā)致病突變有待于進一步的研究。

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（本文編輯：吳健敏）

Correlative analysis of asthenospermia and the mutation site of 12338, 12358 and 12406 in mtND5

LUO Huiying1, LI Chuanlian2, LOU Zhefeng1, ZHENG Jiujia3, ZHANG Liya3, JIN Longjin1.1.School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Clinical Laboratory, Loudi Central Hospital of Hu’nan, Loudi, 417000; 3.Reproductive Medicine Center, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To investigate the correlation between asthenospermia and the mutation site of 12338, 12358 and 12406 in mtND5.Methods:Fifty-five semen samples from patients with asthenospermia and 33 from healthy donors based on WHO criteria were collected and analyzed, mutation frequency of 12338, 12358 and 12406 in mtND5 was examined by polymerase chain reaction (PCR) and sequencing.Results:The mutation frequency (m.12338 T>C 10.9%, m.12358 A>G 9.09%, m.12406G>A 12.7%, total 32.73%) in asthenospermia group was higher than the frequency in control group (9.09%, 3.03%, 3.03% and 15.15%), but there was no significant difference between them (P>0.05). However, the percentages of grade a (20.63±13.63) and grade (a+b) (29.66±17.08) sperm in mutation samples (with m.12338 T>C or m.12358 A>G or m.12406 G>A) were significantly lower than that in non-mutation samples (30.61±18.87 and 41.44±22.47) (P<0.05).Conclusion:These mutations of m.12338 T>C, m.12358 A>G and m.12406 G>A in human sperm may have some correlation with sperm motility, but may not be the specific mutation site of asthenospermia.

asthenospermia; sperm motility; mtND5; mutation

R394.3

A

1000-2138（2014）03-0169-04

2013-11-26

浙江省教育廳科研基金資助項目（Y201223693）；溫州市科技合作項目（H20090063）。

駱慧盈（1988-），女，河南濮陽人，碩士生。

金龍金，教授，Email：1304071636@qq.com。