穩(wěn)定沉默黏著斑激酶結(jié)腸癌細胞株SW620的構(gòu)建

洪衛(wèi)文，蘇國強，應(yīng)紅安，林峰，梁衛(wèi)東

（1.臺州市第一人民醫(yī)院 普外科，浙江 臺州 318020；2.廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院 普外科，福建廈門 361000；3.臺州市第一人民醫(yī)院 特需VIP病區(qū)，浙江 臺州 318020）

黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的高度相關(guān)性已在一些研究中得到證實[1-2]。FAK在原發(fā)性大腸癌、肝癌組織中高表達可能促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，并有研究證實沉默F(xiàn)AK表達可以抑制乳腺癌、肝癌等惡性腫瘤細胞的增殖及轉(zhuǎn)移[3-5]。FAK沉默有望成為結(jié)直腸癌治療的新方法，而目前國內(nèi)有關(guān)穩(wěn)定沉默F(xiàn)AK的結(jié)腸癌細胞模型鮮有報道。本研究應(yīng)用已構(gòu)建的FAK RNA干擾（RNA interference，RNAi)慢病毒載體，通過包裝293T細胞產(chǎn)生重組病毒，感染SW620結(jié)腸癌細胞，并使用新霉素G418篩選穩(wěn)定感染病毒的細胞株，以建立穩(wěn)定FAK沉默的結(jié)腸癌細胞株SW620模型。此方法將為進一步研究沉默F(xiàn)AK基因表達對人轉(zhuǎn)移大腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的裸鼠體內(nèi)實驗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 慢病毒表達載體pLentilox3.7、293T細胞、大腸桿菌DH5α均由廈門大學(xué)李博安教授惠贈。慢病毒包裝系統(tǒng)由pLentilox3.7、PHR、VSVG質(zhì)粒組成。

1.2 主要的儀器和試劑 CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Forma），倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、照相顯微鏡（日本Olympus），培養(yǎng)板（美國Costar），等。試劑：質(zhì)粒小抽提取試劑盒（美國Qiangen），DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、新生小牛血清、DMEM、G418、NEAA、RMPI 1640（美國Gibco），氨芐青霉素、TEMED（美國Sigma），TurboFect（美國Fermentas），PVDF膜、鼠抗人FAK、Matrigel（美國Millipore），24孔板、細胞計數(shù)板（美國Costar），Tris（美國Boehringer Mannheim），SDS（中國華美生物），羊抗鼠二抗（中國博士德）。

1.3 方法

1.3.1 重組RNAi質(zhì)粒的擴增與提取：向DH5α感受態(tài)細菌100μL中加入構(gòu)建好的重組RNAi質(zhì)粒，冰浴30 min；42 ℃水浴鍋中熱休克90 s，冰浴2 min，然后鋪于含氨芐霉素（30μg/mL）的瓊脂平板表面，挑單個菌落，孵育12～16 h，按照試劑盒操作說明書提取純化質(zhì)粒。

1.3.2 重組FAK RNAi質(zhì)粒的酶切鑒定將重組質(zhì)粒和空載體同時雙酶切：產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳，分析酶切產(chǎn)物，進行酶切鑒定。①干擾質(zhì)粒酶和對照空載體酶切體系：XbaI 1.0μL，NotI 1.0μL，10×M Buffer 2.0μL，質(zhì)粒＜1μg，無菌水補足至20.0μL，反應(yīng)條件為37 ℃水浴鍋中酶切2～3 h。②酶切產(chǎn)物電泳：預(yù)期結(jié)果為重組質(zhì)粒組504 bp和7146 bp；空載體組為449 bp和7201 bp。1.3.3 慢病毒包裝及滴度測定：采用改良的陽離子聚合物轉(zhuǎn)染法：①轉(zhuǎn)染前1 d將293FT細胞加入DMEM完全培養(yǎng)基，制成細胞懸液。②依次加入A體系：plasmid（pLL3.7 20μg，PHR 15μg，VSVG 6μg）10μL；B體系：Fermentas TurboFect轉(zhuǎn)染試劑10 μL。③收集細胞上清加入新鮮的培養(yǎng)基，直到病毒完全被溶解。PBS將DAPI 1000倍稀釋，在流式細胞儀下檢測GFP表達頻率。病毒滴度（IU/mL）=GFP陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比÷5×1.5×105×103。

1.3.4 腫瘤細胞培養(yǎng)、分組及重組慢病毒質(zhì)粒感染腫瘤細胞：SW620細胞以1640培養(yǎng)基在5% CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)，20～24 h至細胞融合度達90%。實驗分三組：實驗組（轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒的pLL3.7 FAK的SW620細胞），陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照慢病毒質(zhì)粒pLL3.7的SW620細胞），未處理組（未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的SW620細胞）。在最佳病毒感染指數(shù)（multiplicity of infection，MOI）下感染對數(shù)生長期SW620細胞，感染慢病毒后，隨MOI增加，感染細胞數(shù)逐漸增加，本實驗設(shè)定MOI=20，并加入1000×Polybrene 10μL，48 h后熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.3.5 篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組慢病毒質(zhì)粒的SW620細胞株：加入新霉素G418，使?jié)舛冗_到800μg/mL，取14 d內(nèi)完全殺死細胞的最低濃度作為篩選濃度，本實驗采用700μg/mL進行前2周的篩選，2周后以50μg/mL維持篩選。

1.3.6 采用RT-PCR法檢測干擾前后FAK的mRNA表達：①提取細胞總RNA；②RT反應(yīng)：總RNA 1μg，RT Enzyne MIX 1μL，Primer MIX 1μL，5×RT buffer 4μL，ddH2O 20μL?；靹蚝螅?5 ℃ 5min；37 ℃ 20 min；98 ℃ 5 min。③PCR反應(yīng)：FAK正義引物為5’-ACATTATTGGCCACTGTGGATGAG-3’，反義引物為5’-GGCCAGTTTCATCTTGTTGATGAG-3’，擴增片段為125 bp；內(nèi)參β-actin 正義引物為5’-GATGCAG AAGGAGATCACTG-3’，反義引物為5’-GGGTGTAACGCAA CTAAGTC-3’，擴增片段為222 bp。先94 ℃變性3 min，隨后94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72℃延伸60 s，共擴增35個循環(huán)，最后繼續(xù)72 ℃延伸5 min，4 ℃放置，凝膠電泳并照相。

1.3.7 采用Western blot法檢測干擾前后FAK的蛋白表達：①細胞總蛋白提取。②考馬斯亮藍染色法測定總蛋白濃度：樣品的蛋白濃度=（樣品的OD值-空白組的OD值）/（標準品的OD值-空白組的OD值）×5。③蛋白變性：100 ℃變性8 min，-20 ℃保存?zhèn)溆?。④Western blot法的具體步驟:按照說明書首先SDS-PAGE垂直電泳，然后蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜，最后行抗原-抗體反應(yīng)及化學(xué)發(fā)光顯色。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)用±s表示，樣本均數(shù)間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒包裝及滴度測定 熒光倒置顯微鏡觀察可見各組均表達大量的綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP），測定滴度為2.89×107 TU/mL，表明慢病毒包裝成功（見圖1）。

圖1 轉(zhuǎn)染293T細胞48 h熒光圖（×100）

2.2 各組SW620細胞轉(zhuǎn)染慢病毒后熒光圖 相應(yīng)的慢病毒轉(zhuǎn)染入實驗組與陰性對照組，各組均表達較多綠色熒光信號，表明慢病毒轉(zhuǎn)染成功（見圖2）。

圖2 轉(zhuǎn)染細胞表達綠色熒光圖（×100）

2.3 穩(wěn)定FAK沉默SW620細胞株的建立 shRNA重組慢病毒感染SW620細胞后使用濃度800μg/mL G418篩選14 d后實驗組及陰性對照組細胞均恢復(fù)生長，形態(tài)轉(zhuǎn)好，熒光較前亮，同時熒光率高（見圖 3）。

圖3 穩(wěn)定FAK沉默SW620細胞株篩選后熒光圖（×100）

2.4 FAK RNAi載體的干擾效率檢測

2.4.1 RT-PCR檢測FAK mRNA表達：以β-actin作為內(nèi)參照，各組細胞均能擴增出約125 bp的FAK基因片段，用Quantity-One定量分析軟件進行條帶灰度分析，測定出各樣本FAK mRNA的相對表達量，結(jié)果顯示各組FAK mRNA表達分別為：實驗組為1.016±0.047、陰性對照組為3.971±0.127、未處理組為4.210±0.169，實驗組中FAK mRNA表達較陰性對照組、未處理組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

圖4 RT-PCR實驗結(jié)果

2.4.2 Western blot法檢測FAK蛋白表達：以βactin作為內(nèi)參照，用Quantity-One定量分析軟件進行條帶灰度分析，各組FAK蛋白表達分別為：實驗組為0.374±0.022、陰性對照組為3.216±0.101、未處理組為2.926±0.142，實驗組中FAK蛋白表達較陰性對照組、未處理組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

圖5 Western blot法檢測結(jié)果

3 討論

大腸癌是胃腸道常見的惡性腫瘤，致死率高并容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，我國近年大腸癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，遠處轉(zhuǎn)移是大腸癌患者的主要死因。FAK在整合素介導(dǎo)的細胞遷移、細胞周期和細胞存活等功能中起關(guān)鍵作用[6-7]，抑制FAK的表達可有效地降低腫瘤細胞的黏附和侵襲[8-10]。FAK有望成為新的腫瘤標志物、腫瘤治療的重要靶點，為惡性腫瘤的綜合診治提供新的思路。

RNAi具有很強的抑制目的基因的作用，較反義寡核苷酸抑制目的基因的效果更強，被認為是繼PCR后又一劃時代的基因工程方法[11-13]。慢病毒載體可感染非分裂細胞、目的基因長期表達、免疫反應(yīng)小，逐漸成為理想的基因轉(zhuǎn)移載體[14]。本實驗利用RNAi技術(shù)，使用慢病毒載體pLL3.7包裝成慢病毒，并用改良的病毒感染方法成功感染SW620結(jié)腸癌細胞，通過慢病毒載體自帶的新霉素抗性基因篩選單克隆細胞，并擴增培養(yǎng)，從而構(gòu)建出穩(wěn)定沉默F(xiàn)AK的結(jié)腸癌的細胞模型，是研究FAK在結(jié)腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移等作用機制中不可或缺的一步。為此，本研究就構(gòu)建FAK的結(jié)腸癌細胞株進行探討性研究，首先在選用結(jié)腸癌細胞株上，采用的是SW620，此細胞容易培養(yǎng)、生長速度適中，常規(guī)培養(yǎng)條件下能穩(wěn)定傳代，一般12～24 h分盤一次，另外SW620是從結(jié)腸癌患者轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)中獲取并建立的，惡性程度較高，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，是研究FAK在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中的合適的實驗對象；另外采用的慢病毒載體pLL3.7為病毒載體，帶有GFP及新霉素抗性基因，可以在體外甚至體內(nèi)示蹤細胞，方便細胞感染后篩選目的細胞，并且具有FAK基因沉默效率高、穩(wěn)定等優(yōu)點，通過Western blot法檢測FAK蛋白表達下降90%以上，感染細胞通過多次的傳代后FAK表達始終處于低水平，有效減少后期實驗誤差；病毒感染細胞是通過多次預(yù)實驗，采用不同藥物及劑量對照，最終選定Fermentas TurboFect轉(zhuǎn)染試劑及最合適的劑量成功感染SW620細胞，通過觀察發(fā)現(xiàn)感染率極高，感染后細胞生長無明顯抑制。在細胞篩選過程中利用質(zhì)粒中的neo抗性基因，使用不同劑量G418階梯篩選預(yù)實驗后，采用最合適的劑量對感染后細胞進行篩選，并選取熒光表達高的單克隆細胞株進行培養(yǎng)擴增，目的細胞能穩(wěn)定傳代擴增，從而最終構(gòu)建了穩(wěn)定沉默F(xiàn)AK的結(jié)腸癌細胞株；本細胞株的構(gòu)建為下一步體外研究FAK基因在結(jié)腸癌細胞中的作用及相關(guān)機制提供前提，并為進一步將FAK沉默的腫瘤細胞移植至裸鼠體內(nèi)的實驗研究奠定基礎(chǔ)。

[1]孫曉杰, 黃常志. PI3K-Akt信號通路與腫瘤[J]. 世界華人消化雜志, 2006, 14(3): 306-311.

[2]倪孔海, 翁志梁, 王思齊, 等. 粘著斑激酶在人良性前列腺增生組織中的表達及其意義[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2004, 34(4): 262-264.

[3]Seo CH, Jeong H, Feng Y, et al. Micropit surfaces designed for accelerating osteogenic differentiation of murine mesenchymal stem cells via enhancing focal adhesion and actin polymerization[J]. Biomaterials, 2013, 12 (35): 2245-2252.

[4]Baotran Ho, Gretchen Olson, Sheila Figel, et al. Nanog Increases Focal Adhesion Kinase (FAK) Promoter Activity and Expression and Directly Binds to FAK Protein to Be Phosphorylated[J]. J Biol Chem, 2012, 287(22): 18656-18673.

[5]袁周, 鄭起, 黃新余, 等. 抑制黏著斑激酶表達對人肝癌細胞轉(zhuǎn)移潛能的作用[J]. 中華外科雜志, 2007, 45(19): 1350-1353.

[6]Kobayashi-Sakamoto M, Isogai E, Holen I, et al. Osteoprotegerin induces cytoskeletal reorganization and activates FAK, Src, and ERK signaling in endothelial cells[J]. Eur J Haematol, 2010, 6(85): 26-35.

[7]Mitra SK, Hanson DA, Schlaepfer DD, et al. Focal adhesion kinase: in command and control of cell motility[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2005, 6(1): 56-68.

[8]Serrels A, Canel M, Brunton VG, et al. Src/FAK-mediated regulation of E-cadherin as a mechanism for controlling collective cell movement: insights from in vivo imaging[J].Cell Adh Migr, 2011, 5(4): 360-365.

[9]Cabodi S, del Pilar Camacho-Leal M, Di Stefano P, et al.Integrin signalling adaptors: not only figurants in the cancer story[J]. Nat Rev Cancer, 2010, 10(12): 858-870.

[10]Figel S, Gelman I. Focal adhesion kinase controls prostate cancer progression via intrinsic kinase and scaffolding functions[J]. Anticancer Agents Med Chem, 2011, 11(7):607-616.

[11]Maliyekkel A, Davis BM, Roninson IB. Cell cycle arrest drastically extends the duration of gene silencing after transient expression of short hairpin RNA[J]. Cell Cycle, 2006,5(20): 2390-2395.

[12]Cheng TL, Chang WT. Construction of simple and efficient DNA vector-based short hairpin RNA expression systems for specific gene silencing in mammalian cells[J]. Methods Mol Biol, 2007, 408: 223-241.

[13]黃坊, 趙穎海. RNAi干擾技術(shù)在鼻咽癌研究中的應(yīng)用進展[J]. 腫瘤防治研究, 2009, 36(1): 73-75.

[14]Yang H, He S, Quan Z, et al. Small Interfering RNA-mediated Caveolin-1 Knockout on Plasminogen Activator Inhibitor-1 Expression in Insulin-stimulated Human Vascular Endothelial Cells[J]. Acta Biochim Biophys Sin, 2007, 39(3): 224-233.